Summary
이 프로토콜은 포유 동물 세포에서 G 단백질 연결 수용체 (GPCR)의 내재화 초점 현미경 검출을 설명한다. 이것은 기본적인 세포 배양, 형질 전환, 및 공 초점 현미경 절차를 포함하는 융합 발현 GPCR의 세포 내 위치 파악 및 내재화를 검출하는 효율적이고 쉽게 해석 방법을 제공한다.
Introduction
세포를 수송하는화물 피킹 기계를 가지고 세포 외 물질 - 리간드 등, 미생물 영양분, 및 막 관통 단백질 -로 정보, 에너지 및 다른 목적 1,2 셀있다. 그것은 세포 항상성, 조직의 기능, 및 전체 세포 생존에 중요하다. 형광 융합 단백질의 세포 - 기반 표현은 신호 경로 (3)의 위치 파악 및 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)와 같은 막 횡단 수용체의 내재화를 연구 할 수있는 강력한 방법이다.
직접 형광 검출 기술과 결합 된 해파리 빅토리아 (Aequorea victoria)로부터의 녹색 형광 단백질 (GFP)로 태그 된 융합 단백질의 발현은, 넓은 수용을 얻은 단백질 타겟팅 연구 4, 5, 6. GFP 기반 detecti에는 고정 아티팩트 (7)을 피하면서 살아있는 세포의 실시간 영상을 허용하는 장점이있다. 다목적 클로닝 벡터 일련 9는 다양한 세포 8에 GFP 단백질 융합체의 발현을 용이하도록 구성되어있다. 및 pEGFP-N1 벡터는 포유류 세포에서보다 밝은 형광 발현 야생형 GFP에서 최적화 된 개선 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 코딩하는 널리 상용화 된 플라스미드 벡터이다. EGFP의 형광 신호가 포유 동물 세포에서 발현 관찰, 형광 현미경, 바람직하게는 공 촛점 현미경으로 488 nm에서 여기 및 507 nm에서의 방출과 함께 이루어져야한다.
세포 내 위치 파악 및 수용체의 리간드 - 매개 된 내재화를 모니터링 된 GPCR (10)의 신호 전달과 기능을 조사하기 위해 일반적인 기법 11>까지. 대부분의 경우에는 내재화 된 GPCR의 탈감작 (작용제의 존재에도 불구하고, 자극 반응의 감쇠) (12, 13)로 이끈다. 내재화 수용체 리소좀에 통합 저하하거나 수용체는 상기 실험에서 사용 된 세포주의 특성에 따라 다시 세포 표면에 재활용 될 수 수있다.
고나 도트로 핀 방출 호르몬 수용체 (GnRHRs)는 GPCR 패밀리에 속하고, 세포 외 아미노 말단 세포 내 -COOH 단자 전형적인 GPCR 단백질 구조를 가지고 있고, 일곱 막 횡단 (TM)는 14 도메인들. (Sepiella 자포니카에서 GnRHR 유전자) 재조합 플라스미드 Sj에 GnRHR-EGFP의 형질 감염 및 (HEK293 세포에서 발현) EGFP 태깅 에스 GnRHR 공 초점 현미경의 검출은 기존에보고 된교활한 및 GFP 형광은 막 횡단 단백질 제이션 분석법 15 기자로 설치되었다. 이제, S. 자포니카 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH에 Sj에)에 의해 활성화 Sj에 GnRHR의 내재화는 공 촛점 현미경으로 시간 및 용량 - 의존적 방식으로 입증되었다.
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Protocol
1. 셀 제조
- 세포 복구
- 37 ° C의 물을 욕조에 액체 질소 탱크로부터 동결 보존 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포를 옮기고 1 연속 진탕 - 2 분.
- 10 cm 세포 배양 접시에 평형화 성장 배지 10 ㎖ (둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액)을 추가한다. 부드럽게 평형 성장 매체에 해동 세포를 추가합니다.
- 4 시간 - 2 95 %의 공기와 5 % CO2를 함유하는 가습 분위기 37 ° C의 물 재킷 CO 2 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션.
- 후 2 - 4 시간 동안 세포가 부착 된 것을 확인한다. 48 시간 - 또 다른 24의 평형 성장 매체와 문화를 교체합니다.
참고 :이 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 제거하고 세포 손상을 방지하기 때문에 평형 성장 매체를 변경하면 유용합니다.
- <강한> 셀 통로
- 24 일 후 - 세포가 합류에 가까운 성장을 48 시간, 평형화 성장 배지를 폐기하고 인산 완충 식염수 2 ㎖ (PBS)으로 세포를 세척 하였다. 부드럽게 접시를 소용돌이.
- PBS를 폐기하고 트립신 EDTA 1 ㎖ (식염수, 0.25 % 트립신 및 0.02 % EDTA)를 추가한다. 완전히 세포를 소화하기 위해 접시를 조심스럽게 소용돌이와 트립신 - EDTA 솔루션을 대기음. 3 분 동안 37 ° C의 물 재킷 CO 2 인큐베이터에서 접시를 넣어.
참고 :이 기간 동안, 세 개의 새로운 10 cm 세포 배양 접시를 준비하고 각 평형 성장 매체의 10 mL를 넣어. - 세포가 접시의 바닥에서 해제 한 경우 광학 현미경을 사용하여 결정합니다. 접시에 평형 성장 매체의 2 ML을 추가합니다. 피펫 팅하여 혼합하고 즉시 새로운 접시의 각 세포 현탁액을 0.6 ㎖의 피펫. 부드럽게 피펫 팅하여 혼합하고, 세포를 37 ℃, 5 % CO 2에서 배양 할 수있다.
2. 셀 시드
- 24 일 후 - 계대 세포가 합류에 가까운 성장을 48 시간, 평형화 성장 배지를 버리고 PBS 2 ml로 세포를 세척한다. 부드럽게 접시를 소용돌이.
- PBS를 폐기하고 트립신 EDTA 1 ㎖를 추가한다. 완전히 세포를 소화하기 위해 접시를 조심스럽게 소용돌이와 트립신 - EDTA를 대기음. 3 분 동안 37 ° C의 물 재킷 CO 2 인큐베이터에서 접시를 넣어.
주 :이 기간 동안, 각각의 웰에 평형화 성장 배지 2ml를 첨가하여 6 웰 플레이트를 준비한다. - 현미경 관찰 하에서 세포 접시 바닥으로부터 상승하는 한 경우 접시 평형화 성장 배지 1 ㎖를 추가한다. 피펫 팅하여 혼합하고 즉시 제조 6- 웰 플레이트 (평형화 성장 배지 2 mL를 셀리스 6 웰 플레이트)의 각 웰에 세포 현탁액 0.1 ㎖ (양의 세포 성장 밀도에 따라 조정)을 피펫. 부드럽게 세포를 피펫으로 혼합 허용37 ° C에서 배양하고, 5 % CO 2.
3. 세포 형질
- 리포좀 제제로 형질 감염 방법 (1)
참고 : 형질 전환 시약 1 재료의 표를 참조하십시오.- 95 % 합류 - 다음 날, 세포는 85해야합니다 있는지 확인하십시오.
- 무균 마이크로 원심 튜브에 플라스미드 DNA (500 NG / μL) 및 감소 된 혈청 배지 100 μL 3㎍을 추가하고 부드럽게 혼합한다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션.
- 시약 1 및 다른 마이크로 원심 튜브 환원 혈청 배지 100 μL 9 μL를 준비하고 부드럽게 혼합한다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션.
- 희석 시약 1 (전체 부피 = 215 μL)로 희석하고 혼합물을 플라스미드 수확기. 부드럽게 혼합하고, 실온에서 20 분 동안 배양한다.
- 대기음 세포 배양 접시 오프 매체, 및 FBS없이를 1.5 ml의 신선한 DMEM을 추가한다.
- DNA-TRANSF의 215 μL를 추가ection 시약을 각 웰에 적하 혼합하고, 플레이트를 선회하여 부드럽게 혼합한다.
- 8 시간 - 4 CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션하고, 5 %. 10 % FBS와 신선한 DMEM로 교체하십시오.
- 모든 실험을 실행하기 전에 48 시간 - 24 다른 CO 2, 37 ℃에서 세포를 인큐베이션하고, 5 %.
- 리포좀 제제로 형질 감염 방법 2
참고 : 형질 전환 시약 2 재료의 표를 참조하십시오.- 무균 마이크로 원심 튜브에 플라스미드 DNA 2 μg의 (500 NG / μL), 시약 2 4 μL, 100 μL의 혈청 감소 배지를 추가한다. 부드럽게 혼합하고, 실온에서 15 분 동안 배양한다.
- 적가 방식으로 세포에 형질 전환 혼합물을 추가한다.
- 모든 실험을 실행하기 전에, 37 ℃에서 48 시간 및 5 % CO 2 - 형질 감염 후 24 세포를 배양한다.
커버 전표 4. 세포 배양
- 레배양 6 웰 플레이트에서 성장 배지를 이동.
- 칼슘 및 마그네슘없이 PBS 1 ㎖로 세포 단층을 세척한다.
- 0.5 mL의 트립신 EDTA를 추가한다. 신중하게 접시를 소용돌이 및 트립신 - EDTA를 대기음. 37 ℃에서 3 분, 5 % CO 2의 배양 플레이트를 인큐베이션. 실제의 배양 시간은 사용되는 세포주에 따라 달라진다.
주 :이 기간 동안 새로운 12 웰 플레이트를 준비하여 멸균 커버 슬립 각 웰에 직경 15mm의 추가. 리신, 라미닌, 콜라겐으로 코팅 된 커버 슬립은 쉽게 분리 HEK293 세포에 대한 세포 부착을 향상시킬 수있다. - 세포가 분리 될 때, 각 웰에 1 개 ㎖의 사전 - 가온 완전 성장 배지를 추가한다. 피펫 팅하여 혼합하고 바로 슬립 커버로 12- 웰 플레이트에 세포를 필요한 수를 옮긴다. 한 ML에 총 볼륨을 조정하기 위해 각 웰에 신선한 전체 성장 매체를 추가
- 37 ° C에서 24 시간 및 5 % CO 2 - 16 세포를 인큐베이션.
참고 : 30 후 -60 분은, 세포의 대부분은 멸균 커버 슬립에 부착 한 것이다.
5. 공 초점 현미경 감지
- 셀룰러 현지화
- 16 일 후 - 세포를 12 웰 플레이트에서 멸균 커버 슬립에 가까운 합류로 성장 24 시간, 5 μM의 최종 농도를 제공하는, 각 웰에, 멤브레인 프로브 DII를 추가한다. 세포는 37 ° C에서 30 분, 5 % CO 2 동안 배양 할 수있다.
- 30 분 후, 평형화 성장 배지를 제거하고 차가운 PBS로 두 번 세포를 씻어 (2 - 11 °의 C).
- 각 웰 (PBS)에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액 1 ㎖를 첨가하여 세포를 고정한다. 조심스럽게 15 분 동안 교반한다.
주의 : 파라 포름 알데히드는 피부 접촉이나 흡입 중간 독성이며, 가능성이 발암 물질로 지정. 화학은 파라 포름 알데히드의 무게 및 취급 중에 표기 후드 배기 밸런스 격납 등의 보호 대책을 연기. </ 리> - PBS 두 번 고정 된 세포를 씻으십시오. μL DAPI (4 ', 6-diamidino-2-페닐 -) 용액 (0.5 ㎍ / mL)을 각 웰 200-300 추가하고, 실온에서 10 분 동안 배양한다.
- PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 조심스럽게 판에서 커버 전표를 제거하고 여분의 PBS를 심지. 장착 매체 (50 % V / V 글리세롤 / 물) 한 방울 로케이션 현미경 슬라이드 상 전환. 슬라이드에서 초과 장착 매체를 제거합니다.
- 휴대 내면화
- 16 일 후 - 세포를 12 웰 플레이트에서 멸균 커버 슬립에 가까운 합류로 성장 24 시간, 평형화 성장 배지를 제거하고 신선한 추가 DMEM 배지 (37 ° C)를 가온. 37 ° C에서 1 시간, 5 % CO 2 세포를 인큐베이션.
- 30 분 동안 (0, 10-12, 10-9 및 10-6 M) 서로 다른 농도로 리간드를 세포를 처리하고, 다른 시간 10 -6 M의 리간드 (0 그들을 취급10, 30 및 60 분).
- (- 8 °의 C 2) 차가운 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 각 웰 (PBS)에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액 1 ㎖를 첨가하여 세포를 고정한다. 조심스럽게 15 분 동안 교반한다.
- PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 조심스럽게 판에서 커버 전표를 제거하고 여분의 PBS를 심지. 장착 매체 (50 % V / V 글리세롤 / 물) 한 방울 로케이션 현미경 슬라이드 상 전환. 슬라이드에서 초과 장착 매체를 제거합니다.
- 공 초점 현미경
- 수은 램프 전력, PC 현미경, 스캐너, 레이저를 포함, 공 초점 현미경의 하드웨어를 켭니다. 소프트웨어를 실행, 운영 체제 계정에 로그인 구성을 확인하고 레이저를 선택합니다. 지침에 따라 순서대로 공 초점 현미경 시스템의 다른 단위를 켭니다.
- 현미경 단계에 준비된 슬라이드를 놓습니다. 스테이지 제어기를 사용하여 대물 렌즈를 통해 샘플을 놓고. 삼나무 기름 한 방울에 추가오일 침지 렌즈가 선택 될 때 커버 슬립한다. 렌즈에 직면 슬라이드에 커버 전표를 놓습니다.
- 형광 현미경 아래에서 관심의 세포를 찾아보십시오.
- 스캔 모드로 전환합니다. 레이저 파워 및 형광 발광의 스펙트럼 범위를 선택. 튜닝 레이저 강도 및 기타 매개 변수에 의해 높은 품질 공 촛점 이미지를 캡처합니다.
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Representative Results
도 1은 공 초점 레이저 주사 현미경 시스템의 일례를 나타낸다. 그림 2는 HEK293 세포 및 pEGFP-N1의 발현을 제공한다. GFP 신호는 세포질 및 핵 검출되었다. 도 3은 우리의 이전에 발행 된 결과 (15)와 일치하는 HEK293 세포에서 S. 자포니카 GnRHR에서의 세포 내 위치 파악을 나타낸다. 때 CLSM에서 에스 GnRHR (에스 GnRHR-EGFP)의 C 말단에서 EGFP 태그 융합 단백질은이 실험에서 녹색 나타났다. DAPI로 염색 핵은 파란색으로 밝혀졌다. DII 염색 빨간색으로 세포막을 강조했다. 병합 된 이미지의 세포 표면에 황색 신호 에스 GnRHR의 세포막 제이션을 보여주는, 적색 및 녹색의 일치를 나타내었다.
도 4 및도 5를 표시하는 도면HEK293 세포에서 에스 GnRHR의 국제화 분석의 결과. Sj에 GnRHR의 내재화를 가시화하기 위해, 세포를 30 분 (도 4)에 대한 다른 농도 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (Sj에의 GnRH) 15로 처리하거나, 단일 농도로 처리 - 다양한 기간 대 (106 M) ( 그림 5). 에스 GnRH에없는 경우, 제어부 (CTL) 수용체 융합 세포막 제이션 있었다. 도 4에 도시 된 바와 같이, 서로 다른 리간드 농도는 Sj에 GnRHR의 내재화는 용량 의존적 방식으로 진행하고, 수용체는 완전히 10 세포 표면에서 내재화 된 - 6 M 리간드. 도 5에 도시 된 바와 같이, 10 수용체 내재화의 시간 코스 분석 결과 - 6 M 리간드가 내재화 시연에스 GnRHR 10 분 후에 작용제 자극 검출이고, 극단적 내재화는 60 분에서 일어났다. 이들 두 도면에서 초점 현미경으로 관찰 한 형광 에스 GnRHR-EGFP 융합 단백질은 주로 대폭 빠르게 HEK293 세포에서 에스 GnRH의 펩티드에 반응하여 세포 내로 내재화 원형질막에 편재이었다한다고 밝혀졌다.
그림 1. 공 초점 현미경 시스템의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 제어에서 GFP 단백질의 공 초점 현미경 HEK293 셀 및 pEGFP-N1은 형질 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
공 초점 현미경에 의한 HEK293 세포에서 Sj의 GnRHR-EGFP 융합 단백질의 그림 3. 현지화. DAPI로 염색 핵은 파란색으로 표시됩니다. 레드 염색에 도시 DII는 세포막을 강조한다. SJ GnRHR-EGFP 융합 단백질은 녹색으로 표시됩니다. 병합 된 이미지에서 노란색 빨간색과 녹색 신호의 일치를 나타냅니다. 모든 이미지는 적어도 3 개 개의 독립적 인 실험을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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공 초점 현미경에 의한 타임 과정에서 HEK293 세포에서 Sj의 GnRHR-EGFP 융합 단백질의 그림 4. 국제화. Sj에 GnRHR-EGFP 플라스미드로 형질 감염된 HEK293 세포를 30 분 동안의 GnRH 상이한 농도로 처리하여 활성화시켰다. 제어 케이스의 GnRH 자극 (CTL) 선수. 모든 이미지는 적어도 3 개 개의 독립적 인 실험을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
공 초점 현미경으로 용량 의존적으로 HEK293 세포 Sj에 GnRHR-EGFP 융합 단백질도 5 내면화. 다른 D 6 M 리간드 - 에스 GnRHR-EGFP 플라스미드로 형질 감염된 HEK293 세포를 10로 처리하여 활성화 된urations. 제어 케이스의 GnRH 자극 (CTL) 선수. 모든 이미지는 적어도 3 개 개의 독립적 인 실험을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 HEK293 세포에서 세포 내 발현 및 위치 파악 GPCR 융합 단백질의 내재화를 검출하는 효율적이고 쉽게 해석 방법을 제공한다. 이 기술은 쉽게 HEK293 세포 BMN 및 봄 빅스 모리 (16)로부터 corazonin 수용체의 세포 내재화 제이션을위한 많은 다른 유전자와 세포 유형에 대해 적응 될 수있다.
이 강력한 분석의 성공적인 응용 프로그램은 몇 가지 주요 요인에 의존한다. 제일 효율적인 형질 전환 및 데이터 품질에 필수적인 세포의 건강이다. 형질 전환 배양 시간, 배양 된 세포에 대한 손상이 가능한 모든 단계 형질 다른 실험과 촬상 전에 슬립 커버하는 형질 세포의 통로 사이의 간격이다. 따라서, 세포의 건강을 유지하는 것은이 실험의 모든 단계를위한 중요한 전제 조건입니다. 또한, 고밀도 문화에 단단하게 압축 된 세포를 피하는 것은 공 초점 현미경으로 높은 품질의 이미지를 획득하기 위해 매우 중요합니다. 된 GPCR의 위치 파악에 형광 물질의 영향을 최소화하기 위해, 우리는 세포 내 C- 말단에 융합 EGFP와 수용체를 생성. 세포에 유전자의 성공적이고 효율적인 형질 전환도 중요하다. 형질 전환 효율은 다양한 세포주에서 크게 변할 수있다. 따라서, 프로토콜의 특정 단계의 최적화는 사용 된 특정 세포 유형에 따라 필요할 수있다. 예를 들어, 형질 전환 방법 (1)에없는 FBS DMEM에서 형질 전환 세포의 배양 기간은 셀의 조건에 따라 최적화 될 수있다. DNA의 플라스미드의 용량뿐만 아니라, 리포좀 시약의 투여 량 및 감소 된 혈청 배지는 특정 세포주에 따라 조정되어야한다. 그렇지 않으면, electrotransfection 기술 대신 리포좀 매개 형질 감염 시약 f를 실시 할 수있다또는 특정 세포주에서 허용되는 형질 전환 효율. 그러나, 추가적인 하드웨어가 필요하고, 현탁 제 및 소량의 세포로 형질 electrotransfection 어렵다된다. 현재 분석의 진정한 장점은 있지만, 예컨대 에스 GnRH의 리간드에 응답 에스 GnRHR의 내재화 급성 조작 후 동일한 배양 조건하에 동일한 세포의 변화의 비교에있다.
내재화는 11 자극에 적합한 세포 반응을 위해 시그널링 GPCR을 제어하는 주된 메카니즘 중 하나이다. 우리는 쉽게 공 초점 현미경과 영상을 통해 국제화의 변화를 관찰 할 수있다. 용량 - 및 시간 - 의존적 방식으로 에스 GnRHR의 내재화는도 4에 명백하게 드러난다.
우리가 기술 한 프로토콜은 쉽게 다른 진핵 홍보의 세포 내 추적에 적용 할 수 있습니다이러한 핵 에스트로겐 수용체 (17) oteins. 그러나, 프로토콜의 특정 단계의 최적화 추가 탐사 및 연습이 필요합니다 사용되는 특정 세포 유형에 따라, 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 단백질의 세포 내 위치 유전자, 단백질 수정의 식별에 큰 영향을 미치는 점을 고려하고, 신호 경로, 게시 된 연구를 기반으로이 프로토콜은 신뢰할 수있는 데이터 및 정보를 제공 할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
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- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
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