Summary
Bu protokol, memeli hücrelerinde G-protein kenetli reseptör (GPCR) içselleştirmenin konfokal mikroskopi bağlanmasını anlatır. Temel hücre kültürü, transfeksiyon, ve konfokal mikroskopi prosedürü içeren füzyon ifade GPCR hücre içi lokalizasyonu ve içselleşmesini tespit etmek için etkin ve kolay yorumlanabilir bir yöntem sağlar.
Introduction
Hücreler taşımak için yük trafik mekanizmalara sahip hücre dışı malzemeler-tür ligandlar, mikroorganizmalar, besin ve zar-ötesi proteinden-bir bilgi, enerji ve diğer amaçlar 1, 2 hücre olarak. Hücresel homeostazı, doku işlevinin ve genel hücrenin hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. Floresan füzyon proteinlerinin hücre bazlı ekspresyon yolları 3 sinyal lokalizasyonu ve G-protein bağlı reseptörler (GPCR), transmembran reseptörleri, internalizasyonunu incelemek için etkili bir yoldur.
Doğrudan floresans saptama teknikleri ile bir arada Aequorea victoria akvaryum balığındaki yeşil floresan protein (GFP) ile etiketlenmiş füzyon proteinlerinin ekspresyonu, geniş kabul görmüştür protein gibi araştırma 4, 5, 6. GFP tabanlı Detectiüzerinde sabitleme eserler 7 kaçınırken yaşayan hücrelerin gerçek zamanlı görüntüleme izin verme avantajına sahiptir. Çok yönlü klonlama vektörleri bir dizi, 9, çeşitli hücrelerde 8 GFP protein füzyonlarının ekspresyonunu kolaylaştırmak için inşa edilmiştir. pEGFP-N1 vektörü memeli hücrelerinde daha parlak floresans ve daha yüksek ifadesi için doğal tipte GFP arasından optimize edilmiş olan bir arttırılmış yeşil fluoresan protein (EGFP) kodlayan yaygın olarak kullanılan ve ticari olarak plazmid vektörüdür. EGFP flüoresan sinyal memeli hücrelerinde ifade gözlemlemek için, floresans mikroskopisi tercihen eş odaklı mikroskopi ile 488 nm'de eksitasyon ve 507 nm'de emisyon ile yapılmalıdır.
Hücre içi lokalizasyonu ve reseptörlerin ligand aracılı içselleştirme İzleme GPCR'lerin 10 sinyal iletimini ve araştırmak üzere yaygın bir tekniktir 11,> yukarı. Bir çok durumda, internalizasyonunu GPCR'lerin duyarsızlaştırma (agonistlerin mevcudiyetinde rağmen teşvik cevabının hafifleme) 12, 13 neden olmaktadır. içsel reseptörleri lizozom dahil edilmiş ve bozulmuş ya da reseptörler ve deneylerde kullanılan hücre çizgilerinin yapısına bağlı olarak, hücre yüzeyine geri geri dönüştürülebilir edilebilir.
Gonadotropin salgılatıcı hormon reseptörleri (GnRHRs) GPCR familyasına aittir ve hücre dışı bir amino-terminali, bir hücre içi -COOH terminal ile, tipik bir GPCR protein yapısına sahip ve yedi zar-ötesi (TM) 14 alanlarla kullanılabilir. (Sepiella japonica gelen GnRHR geni ile) yeniden birleştirici plazmit Sj GnRHR-EGFP transfeksiyonu ve (HEK293 hücrelerinde ifade edilir) EGFP-etiketli Sj GnRHR konfokal mikroskopi tespit Previou bildirilmiştirsinsi ve GFP floresan transmembran protein lokalizasyonu deneyleri 15 muhabir olarak kurulmuştur. Şimdi, S. japonica gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH Sj) ile aktive Sj GnRHR içselleştirilmesi, eş odaklı mikroskopi ile zaman ve doza bağlı şekillerde gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Hazırlanması
- Hücre kurtarma
- 37 ° C su banyosu için bir sıvı azot tankından dondurularak korunmuş insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreler aktarın ve 1 sürekli çalkalama - 2 dakika.
- 10 cm'lik bir hücre kültür tabağına dengelenmiş büyüme ortamı 10 mL (Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu) eklenir. Yavaşça dengelenmiş bir büyüme ortamına çözülmüş hücrelere ilave edin.
- 4 saat - 2% 95 hava ve% 5 CO2 içeren bir nemlendirilmiş atmosfer ile 37 ° C bir su ceketli CO2 inkübatöründe inkübe hücreleri.
- 2 sonra - 4 saat, hücreler bağlı olup olmadığını kontrol edin. 48 saat - bir 24 için dengelenmiş bir büyüme ortamı ve kültür değiştirin.
Not: dimetil sülfoksit (DMSO) kaldırır ve hücre hasarına karşı koruma sağlar, çünkü dengelenmiş bir büyüme ortamının değiştirilmesi yararlıdır.
- <strong> Hücre pasaj
- 24 sonra, - hücrelerinin yakın konflüansa büyüdü 48 saat, dengelenmiş bir büyüme ortamı atılır ve fosfat tamponlu tuzlu su içinde 2 mL (PBS) ile yıkama hücreleri. nazikçe Swirl çanak.
- PBS atın ve Tripsin-EDTA, 1 mL (tuzlu su,% 0.25 tripsin ve% 0.02 EDTA) ekleyin. Hücreleri tamamen sindirimi için, çanak dikkatle girdap ve tripsin-EDTA çözeltisi aspire. 3 dakika için 37 ° C su ceketli CO2 inkübatör çanak koyun.
NOT: Bu süre esnasında, üç yeni 10-cm hücre kültür kaplarına hazırlanması ve her bir dengelenmiş büyüme ortamı 10 ml. - Hücreler çanak alt kaldırılır eğer bir ışık mikroskobu kullanarak, belirler. çanak dengelenmiş bir büyüme ortamı 2 mL ekleyin. pipetleme ile karıştırın ve hemen yeni tabağın her hücre süspansiyonu, 0.6 ml pipetleyin. Yavaşça pipetleme ile karıştırın ve hücreler, 37 ° C'de ve% 5 CO2 inkübe edin.
2. Hücre Ekme
- 24 saatten sonra - geçirilmiş hücrelerin yakınındaki konflüansa büyüdü 48 saat, dengelenmiş bir büyüme ortamı atılır ve 2 mL PBS ile yıkama hücreleri. nazikçe Swirl çanak.
- PBS atın ve tripsin-EDTA 1 ml. Hücreleri tamamen sindirimi için, çanak dikkatle girdap ve tripsin-EDTA aspire. 3 dakika için 37 ° C su ceketli CO2 inkübatör çanak koyun.
NOT: Bu süre boyunca, her bir dengelenmiş bir büyüme ortamı için 2 ml ilave edilerek, 6 gözlü bir plakanın hazırlanması. - Mikroskobik gözlem altında, hücreler, bulaşık alttan kaldırılması için ise, çanak dengelenmiş bir büyüme ortamının 1 mL ekleyin. pipetleme ile karıştırın ve hemen hazırlanan bir 6-çukurlu bir tablaya (dengelenmiş bir büyüme ortamı ile 2 ml hücre az 6-yuvalı plaka) her bir çukuruna hücre süspansiyonundan 0.1 mL (hacim hücre büyüme yoğunluğuna göre ayarlanır) pipetleyin. Yavaşça hücreleri pipetleme karışım ve izin37 ° C'de inkübe edilir ve% 5 CO2 ile.
3. Hücre Transfeksiyonu
- Lipozom formülasyonları ile transfeksiyonu, yöntem 1,
NOT: transfeksiyon reaktif 1 için Materyallerin Tablosuna bakınız.- % 95 birleştiğinde - Ertesi gün, hücreler 85 olmalıdır emin olun.
- steril mikrosantrifüj tüpüne plazmid DNA (500 ng / ml) ve düşük serum ortamında 100 uL 3 ug ekleyin ve yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
- Reaktif 1 ve başka bir mikrosantrifüj tüpü içinde düşük serum ortamında 100 uL 9 uL hazırlayın ve hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
- seyreltilmiş Reaktif 1 (toplam hacim = 215 uL) ile seyreltilmiş plazmid karışımının birleştirin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
- Aspire hücreleri kültüre plaka kapalı orta ve FBS'siz 1.5 ml taze DMEM ekleyin.
- DNA transf 215 uL ekleyinection reaktif her bir damlalık yardımıyla karışım ve plaka karıştırılırken yavaşça karıştırın.
- 8 saat - 4 CO2 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5. % 10 FBS ile taze DMEM ile değiştirin.
- Herhangi bir deney çalıştırmadan önce 48 saat - bir 24 için CO 2, 37 ° C'de inkübe hücreleri ve% 5.
- Lipozom formülasyonları ile transfeksiyonu, yöntem 2,
NOT: transfeksiyon reaktif 2 için Materyallerin Tablosuna bakınız.- steril mikrosantrifüj tüpü içine plazmid DNA 2 ug (500 ng / uL), Reaktif 2 4 uL ve 100 uL düşük serum ortamı ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
- damla damla hücrelere transfeksiyon karışımı ekleyin.
- Herhangi bir deney çalıştırmadan önce, 37 ° C'de 48 saat% 5 CO2 - Transfeksiyondan sonra, 24 hücreleri inkübe edin.
Kapak fislerinde 4. Hücre Kültürü
- YenidenKültür 6 gözlü levhadan büyüme ortamı hareket ettirin.
- kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1 mL PBS ile hücre mono tabakasının yıkayın.
- 0.5 ml tripsin-EDTA ekleyin. dikkatli bir şekilde çanak girdap ve tripsin-EDTA aspire. 37 ° C de 3 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 için kültür plaka inkübe edin. Gerçek inkübasyon süresi, kullanılan hücre kuşağı ile değişir.
NOT: Bu süre boyunca, yeni bir 12 oyuklu plaka hazırlanması ve steril kapaklar her fişleri 15 mm çapında bir ekleyin. lisin, laminin, ya da kollajen ile kaplanır Kapak slipleri kolayca ayırmak HEK293 hücrelerinin hücre eki iyileştirebilir. - Hücreler müstakil zaman, her bir 1 ml önceden ısıtılmış tam büyüme ortamı ilave edin. pipetleme ile karıştırın ve hemen lameller 12-iyi levhaya Gerekli sayıda hücre transfer edin. 1 mL toplam hacmini ayarlamak için her bir oyuğa taze tam büyüme ortamı ilave edin
- 37 ° C'de 24 saat ve% 5 CO 2-16 hücreleri inkübe edin.
NOT: 30 sonrası -60 dakika, hücrelerin çoğunluğunun steril bir örtü slipleri yapıştırılır olacaktır.
5. Konfokal mikroskopi Algılama
- Hücresel lokalizasyon
- 16 sonra, - hücreleri 12 çukurlu bir tabakta steril lameller üzerine yakın akışa kadar büyütülmüş olan, 24 saat, 5 uM nihai yoğunluk olarak, her bir göze, membran prob, DII ekleyin. Hücreler, 37 ° C'de 30 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe izin verin.
- 30 dakika sonra, dengelenmiş bir büyüme ortamı çıkarın ve soğuk PBS içinde iki kere yıkama hücreleri (2-8 ° C).
- Her bir oyuğa (PBS içinde), bir% 4 paraformaldehit çözeltisi 1 mL eklenerek hücreler sabitleyin. Yavaşça 15 dakika boyunca çalkalayın.
Dikkat: paraformaldehid deri ve soluma yoluyla orta derecede toksik ve olası kanserojen olarak belirlemiştir. Kimyasal paraformaldehit tartım ve taşıma sırasında kullanılan gereken davlumbaz, havalandırmalı denge muhafazaları veya başka koruma önlemleri duman. </ Li> - PBS içinde iki kez duran hücreleri yıkayın. uL DAPI (4' , 6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisi (0.5 ug / mL) her birine 200-300 de ilave edilir ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
- PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Dikkatlice plaka kapak slipi çıkarın ve aşırı PBS kapalı fitil. montaj ortamına (% 50 h / h gliserol / su) bir damla yüklü mikroskop lamı üzerine ters çevirin. Slaytları fazla montaj orta çıkarın.
- Hücresel içselleştirme
- 16 sonra, - hücreleri 12 çukurlu bir tabakta steril lameller üzerine yakın akışa kadar büyütülmüş olan, 24 saat, dengelenmiş bir büyüme ortamı kaldırmak ve taze ekleyin DMEM ortamı (37 ° C), ısıtılmıştır. 37 ° C'de 1 saat ve% 5 CO2 inkübe hücreleri.
- 30 dakika boyunca (0 10 -12, 10 -9 ve 10 6 M) farklı konsantrasyonları ile ligandın hücreleri tedavi ve farklı zamanlarda 10 -6 M ligandı (0 ile tedavi,10, 30 ve 60 dakika).
- (- 8 ° C, 2), soğuk PBS içinde iki kere hücreleri yıkayın. Her bir oyuğa (PBS içinde), bir% 4 paraformaldehit çözeltisi 1 mL eklenerek hücreler sabitleyin. Yavaşça 15 dakika boyunca çalkalayın.
- PBS içinde iki kez hücreleri yıkayın. Dikkatlice plaka kapak slipi çıkarın ve aşırı PBS kapalı fitil. montaj ortamına (% 50 h / h gliserol / su) bir damla yüklü mikroskop lamı üzerine ters çevirin. Slaytları fazla montaj orta çıkarın.
- mikroskopisi
- cıva lambası güç, PC mikroskop, tarayıcı ve lazer gibi, konfokal mikroskop donanım açın. Yazılımı başlatmak, işletim sistemi hesabına giriş yapılandırmasını kontrol ve lazer seçin. talimatlara göre sırayla odaklı mikroskopi sisteminin farklı birimleri açın.
- Mikroskop sahnede hazırlanan slaytlar yerleştirin. sahne kumandasını kullanarak objektif lens üzerinde numuneyi yerleştirin. sedir yağı bir damla ekleyinyağ daldırma objektif seçildiğinde lamel. Merceği bakan slaytlarda kapağını fişleri yerleştirin.
- Floresan mikroskobu altında ilgi hücreleri bulun.
- tarama moduna geçin. lazer gücü ve emisyon fluorofor spektral aralığı seçin. akort lazer yoğunluğu ve diğer parametrelere göre yüksek kalitede eş odaklı görüntüler çekin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, bir eş odaklı mikroskop sisteminin bir örneğini göstermektedir. Şekil 2, HEK293 hücrelerinde pEGFP-N1 ekspresyonunu göstermektedir. GFP sinyali sitoplazma ile çekirdek saptandı. Şekil 3, daha önce yayınlanmış sonuçlar 15 ile uyumlu HEK293 hücrelerinde S. japonica gelen GnRHR hücre içi lokalizasyonu göstermektedir. Zaman CLSM altında Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) C-termininde EGFP etiketiyle füzyon proteini, bu deneyde yeşil çıktı. DAPI ile boyanmış çekirdeği mavi açığa çıktı. DII boyama kırmızı hücre zarını vurguladı. Birleştirilmiş görüntüde hücre yüzeyi üzerinde sarı sinyal Sj GnRHR plazma membranı lokalizasyonunu ortaya koyan, kırmızı ve yeşil tesadüf işaret etmiştir.
4 ve 5, görüntü ŞekilHEK293 hücrelerinde Sj GnRHR içselleştirme deneylerin sonuçları. Sj GnRHR internalizasyonunu görselleştirmek için, hücreler, 30 dakika boyunca (Şekil 4), farklı konsantrasyonlarda gonadotropin salgılatıcı hormon (Sj GnRH) 15 ile muamele edilmiş ya da tek bir konsantrasyonu ile muamele edilmiştir - farklı sürelerde (10 6 M) ( Şekil 5). Sj GnRH yokluğunda, kontrol (CTL) reseptör füzyon plazma zan lokalizasyonunu vardı. Şekil 4'te gösterildiği gibi, farklı bağlayıcı konsantrasyonlarda, Sj GnRHR ait içselleştirme doza bağımlı bir şekilde ilerledi ve reseptör tamamen 10 ile hücre yüzeyinden özümsendiğini - 6 M ligand. Şekil 5'de gösterildiği gibi, 10 ile alıcı içselleştirme zaman süreci analizi sonuçları: - 6 M ligandının internalize olduğunu göstermiştirSj GnRHR 10 dakika agonist uyarma sonra belirlenebilmiştir ve aşırı içselleştirme 60 dakika ile meydana geldi. Bu iki rakamdan, konfokal mikroskopi ile yapılan gözlemler floresan Sj GnRHR-EGFP füzyon protein, öncelikle önemli ölçüde ve hızla HEK293 hücrelerinde Sj GnRH peptide karşılık olarak hücresi içine plazma membranı içinde bulunmaktadır ve olduğunu ortaya çıkarmıştır.
Şekil 1. konfokal mikroskop sistemi için bir örnek. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Kontrol GFP Protein Konfokal mikroskopi HEK293 hücreleri pEGFP-N1-transfekte . Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Konfokal Mikroskopi ile HEK293 hücrelerinde Sj GnRHR EGFP füzyon proteininin Şekil 3. lokalizasyonu. DAPI ile boyanmış çekirdeği mavi renkte gösterilir. kırmızıyla gösterilen DII boyama, hücre zarını vurgulamaktadır. Sj GnRHR EGFP füzyon proteini, yeşil gösterilir. Birleştirilmiş görüntüde, sarı, kırmızı ve yeşil sinyallerin tesadüf gösterir. Bütün resimler, en az üç bağımsız deneyler temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
ig4.jpg"/>
Aynı odaklı mikroskopi ile bir zaman süreci içinde, HEK293 hücrelerinde Sj GnRHR EGFP füzyon proteininin Şekil 4. İçselleştirilmesi. Sj GnRHR EGFP plasmid ile transfekte edilmiş HEK293 hücreleri, 30 dakika için GnRH farklı konsantrasyonları ile işlenerek aktive edildi. Kontrol durumda GnRH stimülasyonu (CTL) idi. Bütün resimler, en az üç bağımsız deneyler temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Konfokal Mikroskopi ile doza bağımlı bir şekilde, HEK293 hücrelerinde Sj GnRHR EGFP füzyon proteininin Şekil 5. İçselleştirilmesi. Farklı d, 6 M ligandının - Sj GnRHR EGFP plasmid ile transfekte edilmiş HEK293 hücreleri, 10 ile işlenerek aktive edildiherhangi bir biçimde oluşturulabilir. Kontrol durumda GnRH stimülasyonu (CTL) idi. Bütün resimler, en az üç bağımsız deneyler temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol HEK293 hücrelerinde hücre içi lokalizasyonu ve eksprese GPCR füzyon proteininin internalizasyonunu tespit etmek için etkin ve kolay yorumlanabilir bir yöntem sağlar. Teknik kolayca HEK293 ve BMN hücreleri 16 Bombyx mori kaynaklı corazonin reseptörünün hücresel yerini ve internalizasyon için birçok farklı gen ve hücre tipleri için uyarlanabilir.
Bu güçlü testin başarılı uygulama birkaç anahtar faktöre dayanır. Önemlisi verimli transfeksiyon ve veri kalitesi için gerekli olan hücrelerin iyi sağlık vardır. Transfeksiyon İnkübasyon süresi, kültürlenmiş hücrelere zarar görmesi mümkündür tüm adımları transfeksiyon ve diğer deneyler, ve görüntüleme önce fişleri kapsayacak şekilde transfekte edilmiş hücrelerin geçişi arasındaki aralık vardır. Bu nedenle, hücrelerin sağlığı korumada bu deneyde tüm adımlar için önemli bir ön koşuldur. Üstelik, yoğun kültürlerde sıkıca sıkıştırılmış hücreleri kaçınarak konfokal mikroskobu ile yüksek kalitede görüntü elde etmek için hayati önem taşımaktadır. GPCR'lerin lokalizasyonuna floresan etiketi etkisini en aza indirmek için, hücre içi, C-ucuna birleşmiş EGFP reseptörleri oluşturulur. hücrelere gen başarılı ve verimli transfeksiyon da önemlidir. Transfeksiyon verimi, farklı hücre hatları büyük oranda değişebilir. Bu nedenle, protokol belirli adımlar optimizasyonu, kullanılan özel hücre tipine bağlı olarak, gerekli olabilmektedir. Örneğin, transfeksiyon metot 1, FBS'siz DMEM içinde transfekte edilmiş hücrelerin inkubasyon süresinin hücre durumuna göre optimize edilebilir. DNA plazmidi dozajına Ayrıca lipozom Maddenin dozajı ve düşük serum ortamı spesifik hücre hatlarına göre ayarlanmalıdır. Aksi takdirde, electrotransfection tekniği yerine lipozom aracılı transfeksiyon reaktifi f yapılabileceğineveya belirli bir hücre hattında olarak kabul edilebilir bir transfeksiyon verimi. Bununla birlikte, ek donanım gereklidir ve süspansiyon içinde ve küçük bir hacme hücreler electrotransfection ile transfekte etmek zordur edilir. Mevcut deneyde gerçek gücü, ancak, bu Sj GnRH liganda tepki olarak Sj GnRHR içselleştirme gibi akut manipülasyonlara sonra aynı kültür koşulları altında aynı hücrelerde değişiklikleri arasındaki karşılaştırma yatmaktadır.
Içselleştirme 11 uyaranlara uygun hücresel yanıtları sağlamak için sinyal GPCR kontrol baskın mekanizmalarından biridir. Biz kolayca konfokal mikroskobu ile görüntüleme yoluyla içselleştirme değişiklikleri gözlemleyebilirsiniz. Doza ve zamana bağlı bir şekilde Sj GnRHR internalizasyonunun Şekil 4'te açıkça ortaya çıkar.
daha önce tanımladığımız protokolü kolay diğer ökaryotik pr hücre içi izleme uyarlanabilirnükleer östrojen reseptörü 17 olarak oteins. Ancak, protokolde belli adımların optimizasyonu daha fazla incelenmesi ve uygulama gerektirecektir kullanılan belirli hücre tiplerine bağlı olarak, gerekli olacaktır. Bununla birlikte, proteinlerin hücre içi yere genlerin protein modifikasyonlarının tanımlanması üzerinde büyük bir etkisi olduğu göz önüne alındığında, ve sinyal yolları, yayınlanan araştırmaya göre bu protokol, güvenilir veri ve bilgi sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
- Mellman, I.
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
- Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
- von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
- Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
- Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
- Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
- Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).
- Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
- Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
- Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
- Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
- Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
- Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).
