Summary
Guanosine trifosfaat (GTP) binding is een van de vroegste gebeurtenissen bij G-proteïne-koppelde receptor (GPCR) activatie. Dit protocol beschrijft hoe u specifieke GPCR-ligandinteracties farmacologisch kunt karakteriseren door de binding van het radioactief gemerkte GTP-analoog, [35S] guanosine-5'-O- (3-thio) trifosfaat ([35S] GTPγS) te monitoren in Reactie op een ligand van interesse.
Abstract
G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn een grote familie van transmembrane receptoren die kritische rollen spelen in normale cellulaire fysiologie en vormen een belangrijk farmacologisch doel voor meerdere indicaties, waaronder analgesie, bloeddrukregulatie en de behandeling van psychiatrische aandoeningen. Bij ligandbinding katalyseren GPCR's de activatie van intracellulaire G-eiwitten door de incorporation van guanosinetrifosfaat (GTP) te stimuleren. Geactiveerde G-eiwitten stimuleren dan signaleringspaden die cellulaire reacties opwekken. GPCR-signalering kan worden gecontroleerd door de opneming van een radioactief gemerkte en niet-hydrolyseerbare vorm van GTP, [35S] guanosine-5'-O- (3-thio) trifosfaat ([35S] GTPγS) in G-eiwitten te meten. In tegenstelling tot andere methoden die meer stroomafwaartse signaleringsprocessen beoordelen, meet [35S] GTPγS-binding een proximale gebeurtenis bij GPCR-signalering en, belangrijker, kan agonis onderscheidenTs, antagonisten en inverse agonisten. Het onderhavige protocol schetst een gevoelige en specifieke werkwijze voor het bestuderen van GPCR-signalen met behulp van ruwe membraanpreparaten van een archetypische GPCR, de μ-opioïde receptor (MOR1). Alhoewel er alternatieve benaderingen zijn voor het fractioneren van cellen en weefsels, zijn er veel kostenverbod, vervelend en / of niet-standaard laboratoriumapparatuur. De huidige methode verschaft een eenvoudige procedure die functionele ruwe membranen verrijkt. Na het isoleren van MOR1 werden verschillende farmacologische eigenschappen van zijn agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefaline (DAMGO) en antagonist, naloxon, bepaald.
Introduction
G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR's) zijn een grote familie van celoppervlakreceptoren die verantwoordelijk zijn voor een opmerkelijke reeks fysiologische processen, waaronder analgesie, olfaction en gedrag 1 . GPCRs handelen door specifieke externe signalen te detecteren en vervolgens intracellulaire signalering te stimuleren. Ze markeren daarom een belangrijke koppeling tussen de externe en interne omgevingen van een cel. Vanwege de cruciale rol die GPCR's spelen in de biologie, zijn ze belangrijke doelen geworden voor zowel basisonderzoek en drugsontdekking 2 , 3 .
In tegenstelling tot andere receptorfamilies die discrete liganden binden, kunnen GPCR's heel verschillende soorten moleculen binden. Terwijl een GPCR met peptiden kan interageren, kan een andere fotonen, kleine moleculen of ionen 1 , 4 aanvoelen. Terwijl hun liganden divers zijn, zijn GPCR's verenigd in hun algemene architectUre en functie. Individuele GPCR's bestaan uit zeven α-helische transmembraaneiwitten met extracellulaire aminoterminalen en intracellulaire carboxylterminals 5 , 6 . GPCR's zijn gekoppeld aan intracellulaire G-eiwitten-heterotrimerische eiwitcomplexen die zijn samengesteld uit a-, p- en y-subunits-die diverse signaalwegen 7 bemiddelen. De G a -subeenheid is een guanine nucleotide-bindend eiwit dat inactief is wanneer gebonden aan guanosinedifosfaat (BBP) en actief wanneer gebonden aan guanosinetrifosfaat (GTP) 8 , 9 . Wanneer GPCR's hun liganden binden, ondergaan ze een conformatieverandering die G a toelaat zich te scheiden van G γ , waardoor G α het BBP voor GTP 7 kan uitwisselen . De receptor zelf wordt gefosforyleerd bij zijn carboxylterminal door verschillende serine / threonIne kinasen 10 , 11 en geïnternaliseerd om de receptorsignalen 12 , 13 , 14 te verzwakken. Ondertussen gaan het geactiveerde G a monomeer en G β dimeer voort om afzonderlijke signaleringswegen 7 te activeren. Er zijn verschillende isoformen van elke G-eiwit subeenheid, en elke isoform is gericht op specifieke stroomafwaartse en secundaire messenger systemen. De grote G a isoformen omvatten G s , G q , G i / o en G 12-13 . Typisch associëren individuele GPCR's met een bepaalde G a- isoform, waardoor een externe stimulus gekoppeld wordt aan een specifieke cellulaire respons 1 .
Het karakteriseren van een GPCR-ligand interactie is cruciaal voor het begrijpen van de biologie van de receptor. Aangezien de BBP / GTP-uitwisseling een van de vroegste vooravond isNts die volgend bindend bindend zijn, het monitoren van GTP-binding kan GPCR-activering of remming meten. Het analyseren van meer stroomafwaartse gebeurtenissen bij GPCR-signalering is vaak niet zo kwantitatief of stoichiometrisch, kan geen volledige agonisten van partiële groepen onderscheiden en kunnen dure reagentia vereisen. Bovendien, verhoogde GTP binding aan G α eiwitten is een bijna universele gebeurtenis na GPCR activatie, wat betekent dat meten van GTP binding een breed toepasselijke analyse is voor het monitoren van de activiteit van de meeste GPCR's. Het meten van GTP-binding is een eenvoudige en snelle aanpak om GPCR-signalering in cellen te monitoren die de receptor van belang of in het natieve weefsel overexpressieert. Het onderhavige protocol beschrijft een functionele GTP-bindingsassay onder gebruikmaking van een archetypische GPCR, de μ-opioïde receptor (MOR1) om de activiteit van een agonist en antagonist op GPCR-signalering te bepalen.
Dit protocol beschrijft eerst hoe u ruwe membranen kan isoleren van cellen die MOR1 overexpresseren. OpmerkingDit protocol is niet beperkt tot overexpressiesystemen en kan toegepast worden op vele bronnen van membraan, met inbegrip van natief weefsel of preparaten die meerdere receptoren en G-eiwitten 15 uitdrukken. Het protocol beschrijft vervolgens hoe de binding van een radioactief GTP-analoog aan deze membranen wordt gemeten in reactie op verschillende concentraties van [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -kefalfine (DAMGO) of naloxon, een MOR1-agonist en antagonist, respectievelijk. Het GTP-analoog, [35S] guanosine-5'-O- (3-thio) trifosfaat ([35S] GTPγS) is niet hydrolyseerbaar. Deze eigenschap is kritisch omdat G a- subeenheden intrinsieke GTPase-activiteit 7 vertonen en het gemerkte gammafosfaat op een hydrolyseerbare GTP-radiochemische stof elimineren. Membraanen worden dan op glasvezelfilters gevangen en gewassen, waarna het radioactief gemerkt GTP gekwantificeerd wordt door middel van vloeibare scintillatietelling. Meerdere farmacologische parameters kunnen worden afgeleid naar karakterE de receptor-ligand interactie, inclusief de half maximale respons (EC 50 ) en Hill coëfficiënt (n H ) voor agonisten en de half maximale remmende concentratie (IC 50 ) en evenwichtsdissociatieconstante (Kb) voor antagonisten 16 , 17 , 18 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Expressie van recombinant HA-MOR1 in gekweekte cellen
OPMERKING: Volg alle celcultuurprotocollen in een steriele laminaire stromingskap.
- Steriliseer de celkweek-laminaire stromende kap met 70% ethanol en houd steriele techniek door de celcultuur.
- Bereid menselijke embryonale niercellen 293 (HEK293) celcultuurmedium, compleet Dulbecco's-gemodificeerd Eagle Medium (DMEM): DMEM, pH 7,4, aangevuld met 2 mM L-glutamine, 1% penicilline / streptomycine en 10% foetaal runder serum (FBS ).
- Plate 2,5 x 10 6 HEK293 cellen op een 10 cm weefselkweekplaat in 10 ml volledig DMEM en incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 totdat 70 tot 80% samenvloeiing bereikt wordt (O / N).
OPMERKING: Om voldoende eiwit te verzamelen voor een compleet GTP-bindend experiment, bordeer ten minste 3 x 10 cm platen cellen. - Transfecteer de cellen met HA-MOR1 met behulp van een gekozen transfectie-reagens en volg de fabrikant '; S richtlijnen Incubeer gedurende 36-48 uur.
OPMERKING: Menselijk MOR-1 cDNA (NCBI Reference Sequence: NM_000914.4) was een royale cadeau van Gavril Pasternak en werd gekloneerd in pCMV-HA.
2. Cell fractionering en membraan collectie
- Bereid de volgende lysisbuffers op:
- Buffer 1: 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), pH 7,4; 1 mM ethyleenglycol-bis (P-aminoethylether) -N, N, N ', N'-tetraazijnzuur (EGTA); 10% sucrose; Protease inhibitor cocktail; En 1 mM dithiothreitol (DTT). Voeg de DTT vers op de dag van membraanisolatie.
- Buffer 2: 10 mM HEPES, pH 7,4; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2; En 1 mM DTT. Voeg de DTT vers op de dag van membraanisolatie.
- Verwijder de getransfecteerde cellen uit de incubator (stap 1.4), aspireer het medium en spoel de cellen met 5 ml ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Aspireer de PBS en overmaat vloeistof uithet bord.
- Voeg 600 μl buffer 1 toe aan de cellen. Verwijder de cellen van het plaatoppervlak met behulp van een celschraper en pipetteer de celsuspensie in een 1,6 ml microcentrifugebuis.
- Bevestig de microcentrifugebuis onmiddellijk in vloeibare stikstof. Nadat de monsters bevroren zijn, doe de lysaten op ijs of doe ze op -80 ° C voor langdurige opslag.
- Herhaal stap 2.3 en 2.4 met alle platen van cellen.
- Zodra de lysaten ontdooid zijn, gebruik een enkelpuls microbuis-homogenisator om de cellen te openen. Pols de homogenisator 3-5 keer gedurende 10 s, en plaats de buis 30 seconden op ijs tussen pulsen.
- Verzamel 20 μL als hele celfractie.
- Centrifugeer het resterende monster gedurende 10 minuten bij 1000 xg en 4 ° C. Verzamel de supernatant en plaats in een nieuwe 1,6 ml microcentrifuge buis op ijs.
- Resuspendeer de pellet in 100 μl buffer 1 en rehomogenizeer met een stamper. Pols de homoGeneriseer 3-5 keer voor 5 s, plaats de buis gedurende 30 s op pulsen tussen pulsen.
- Centrifugeer het monster een tweede keer gedurende 10 minuten bij 1000 xg en 4 ° C. Combineer de supernatant met de supernatant uit stap 2.7.
OPMERKING: De overige pellet bevat kern- en membraanproteïnen.
- Centrifugeer het monster een tweede keer gedurende 10 minuten bij 1000 xg en 4 ° C. Combineer de supernatant met de supernatant uit stap 2.7.
- Centrifugeer de gecombineerde supernatanten gedurende 20 minuten bij 11.000 xg en 4 ° C. Scheid de supernatant (de cytosolische fractie) in een nieuwe 1,6 ml microcentrifugebuis.
- Resulteer de pellet in 200 μl buffer 2. Homogeniseer de pellet door het 3-5 minuten te tritureren. Centrifugeer het monster gedurende 20 minuten bij 21.100 xg en 4 ° C. Aspirateer de supernatant. Resuspendeer de pellet die de ruwe membraanfractie bevat in 50 μl buffer 2.
- Ga direct door naar de GTPγS bindingsexperimenten (sectie 3) of snap-freeze in vloeibare stikstof en houd bij -80 ° C op.
3. [ 35 S] GTPγS Binding OPMERKING: Gebruik standaard radiochemisch veiligheidsprotocol bij het behandelen van [ 35 S] GTPγS en bij het uitvoeren van [ 35 S] GTPγS bindingsexperimenten. Draag beschermende handschoenen en een lab coat altijd. Controleer het verpakkingsmateriaal voor lekken of scheuren. Verwijder afval en overmaat reagentia volgens de institutionele protocollen.
- Bereid Incomplete Bindende Buffer (IBB) op door 50 mM HEPES, pH 7,4 te mengen; 5 mM MgCl2; 100 mM NaCl; En 1 mM ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) in gedestilleerd water.
- Verdun voorraad [ 35 S] GTPγS tot 50 nM in 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 en 10 mM DTT. Maak 500 μL porties en houd ze op -80 ° C. Gebruik alleen een vers ontdooide aliquot onmiddellijk voordat u het experiment start. Doe de porties op ijs.
- Bereid nonradio-gemerkt GTPγS door 1 mg GTPγS poeder op te lossen in 177,62 μL zuiver water voor een voorraadconcentratie van 10 mM. Maak 10 μl porties en sla ze op-20 ° C
- Bereid complete bindingsbuffer (CBB) op door IBB aan te vullen om een eindconcentratie van 1 mM DTT, 0,1% (gew.vol.) Boviene serumalbumine (BSA), 10 μM BBP en 0,1 nM [35S] GTPγS op te nemen.
OPMERKING: De CBB bevat nu radiolabelde GTP. Neem passende veiligheidsmaatregelen tijdens het werken met radioactieve oplossingen. - Doe de membraanfractie van stap 2.11 op ijs.
- Kwantificeer de eiwitconcentratie van de membraanfractie via een Bradford-eiwitassay onder gebruikmaking van een spectrofotometer bij 595 nm.
- Bereid een verdunningsreeks van BSA eiwitstandaarden bij Buffer 2, bij eindconcentraties van 0, 250, 500, 750, 1.500, 2.500 en 5.000 μg / ml.
- Voeg 2 μl van elke standaard of membraan toe aan 1 mL Bradford reagens in een cuvette. Meng grondig door vortexen.
- Pas de spectrofotometer aan op een golflengte van 595 nm en leeg met behulp van de cuvette met 0 μg / ml eiwit.
- Wacht 5 min en rEad elk van de normen en elk van de monsters bij een golflengte van 595 nm.
- Bepaal de absorptie van de normen ten opzichte van de concentratie. Met behulp van de Beer-Lambert-wet (A = εcl, waar ε = extinctiecoëfficiënt, l = lengte van cuvette en c = concentratie), bereken de concentratie van de membraanmonsters.
- Verdun de membraanfracties tot een concentratie van 100 ug eiwit / ml in IBB.
OPMERKING: Eén 10 cm gerecht van HEK293 cellen levert meestal tussen 1 en 3 mg eiwit / ml. - Bereid de volgende experimentele condities voor in afzonderlijke 1,6 ml microcentrifugebuizen: een ligandverdunningsserie, een basale activiteitstoestand om basale GTP-binding te meten en een niet-specifieke bindende conditie om nonspecifieke GTP-binding te meten.
- Voor de ligandverdunningsserie bereidt u een verdunningsreeks van het ligand van belang in een eindvolume van 100 μl CBB. Bereid de ligandserie op 2x de gewenste eindconcentratieons. Ruim de ligandconcentraties om adequaat een reeks responsen te dekken.
- Om het effect van DAMGO op GTP binding via MOR1 te bepalen, bereiden DAMGO verdunningen van 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM en 2 pM in CBB Volume: 100 μl).
OPMERKING: Als bijvoorbeeld het ligand van belang heeft een verwachte EC50 waarde van 10 μM, bereidt ligandverdunningen van 200 nM, 2 μM, 20 μM, 200 μM en 2 mM. Deze vijf voorwaarden omvatten een breed scala van concentraties en zijn 2x de gewenste concentratie voor de test.
- Om het effect van DAMGO op GTP binding via MOR1 te bepalen, bereiden DAMGO verdunningen van 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM en 2 pM in CBB Volume: 100 μl).
- Voor basale binding, berei alleen een buis met 100 μL CBB.
- Voor nonspecifieke binding, berei een buis met 99 μl CBB aangevuld met 1 μL 2 mM nietradio gelabeld GTPγS.
- Voor de ligandverdunningsserie bereidt u een verdunningsreeks van het ligand van belang in een eindvolume van 100 μl CBB. Bereid de ligandserie op 2x de gewenste eindconcentratieons. Ruim de ligandconcentraties om adequaat een reeks responsen te dekken.
- Voeg bij elke experimentele toestand 100 μL van de verdunde membraanoplossing (stap 3.7) toe.
- Incubeer de membranen met de verschillende experimentenEentrische condities in 1,6 ml microcentrifuge buizen gedurende 30 minuten bij 25 ° C in een thermomixer of op een orbitale shaker.
4. Membraanfiltratie
- Bereid de wasbuffer op door 50 mM Tris-HCl te combineren, pH 7,4; 5 mM MgCl2; En 50 mM NaCl in gedestilleerd water.
- Voorzichtig de glasvezelfilters in water gedurende 10 minuten.
OPMERKING: Filters hebben een poriegrootte van 1 μm, een diameter van 2,1 cm en een dikte van 675 μm. - Verwijder de monsters uit de thermomixer of de orbitale shaker (stap 3.10). Pulse-spin de monsters gedurende 5 seconden om elke monster op de bodem van de buis te verzamelen.
- Verwijder het deksel van het vacuümfiltratieapparaat. Leg de voorgelegde filters op de vacuümpoorten van het apparaat. Bevestig het deksel van de apparaat om een vacuümafdichting te vormen. Zet het vacuüm aan.
- Pipetteer 195 μL van elke 200 μL experimentele conditie op filters om de fout van adsorptie naar de muren van de buis en / of pipet te minimaliseren.ting.
- Was de filters driemaal met 1 ml ijskoude wasbuffer.
5. Liquid Scintillation Counting
- Plaats 5 ml scintillatie tellen flesjes in een telrek. Voeg 5 ml scintillatievloeistof toe aan elke injectieflacon.
- Zet het vacuüm uit (stap 4.4). Verwijder het deksel van het vacuümfiltratieapparaat. Met behulp van tweezers, haal de filters uit de vacuümpoorten van het filtratieapparaat en laat elke filter in een afzonderlijke 5 ml scintillatie flesje vallen.
- Bereid één injectieflacon met 195 μL CBB om het maximale signaal te bepalen.
- Bevestig elke injectieflacon veilig. Incubeer de flesjes op een orbitale shaker bij 25 ° C gedurende 10 minuten.
- Schakel de scintillatieteller in. Programmeer de scintillatieteller om 35 S isotopenemissie te meten gedurende 5 minuten per monster met behulp van het standaard geassocieerd scintillatieprogramma.
- Druk op "Start" om een telling te maken.
- Wanneer het tellen gedaan is, gooi de getelde flesje afS als gevaarlijk afval.
6. Data-analyse
- Voer de gegevens in in statistieken en analysesoftware.
- Trek de niet-specifieke binding van elk van de andere metingen af om de specifieke binding te bepalen.
OPMERKING: De mate van nonspecifieke binding wordt bepaald door het monster geïncubeerd met niet-radioactief gemerkte GTPγS (stap 3.8.3). - Open de statistieken en analysesoftware en selecteer een XY dataset entry.
- Voer de specifieke bindingsgegevens van de [ 35 S] GTPγS-bindingsexperimenten in een data tabel in de statistieken en analysesoftware. Voer de agonistconcentraties in, zoals molaire concentraties, in de kolom "X". Voer de bijbehorende 35 S-tellingen in als "Y" -waarden.
- Trek de niet-specifieke binding van elk van de andere metingen af om de specifieke binding te bepalen.
- Transformeer de gegevens.
- Zet de X-waarden om naar hun respectieve logaritme door op "Analyseer" te klikken. Selecteer "Transform" van de ingebouwdeN analyses.
- Selecteer in het dialoogvenster 'Transform' de optie 'Transform X-waarden gebruiken' en selecteer de functie 'X = log (X)'. Kies om een nieuwe grafiek van de resultaten te maken.
- Klik op 'OK'.
- Normaliseer de Y-waarden.
- Met de getoonde getransformeerde resultaten klikt u op 'Analyse'. Selecteer "Normaliseren" van de ingebouwde analyses.
- Selecteer in het dialoogvenster Normaliseren de knop om 0% te definiëren als de "kleinste waarde in elke dataset" en 100% als de "grootste waarde in elke dataset." Selecteer het vak om de resultaten te presenteren als percentages. Selecteer het vak om een nieuwe grafiek van de resultaten te maken.
- Klik op 'OK'.
- Plaats een niet-lineaire regressiekromme op de getekende gegevens. Voer een niet-lineaire regressieanalyse uit.
- Met de genormaliseerde resultaten weergegeven, klikt u op 'Analyse'. Uit de ingebouwde analyses, Selecteer "Niet-lineaire regressie (curve fit)."
- Als u een agonist onderzoekt, selecteert u 'log (agonist) versus genormaliseerd antwoord - variabele helling' in het dialoogvenster.
- Als u een antagonist onderzoekt, selecteert u log (antagonist) versus genormaliseerd antwoord - variabele helling "in het dialoogvenster.
- Klik op 'OK'.
- Bekijk de grafiek en resultaten om ervoor te zorgen dat de fit en de gegevens in redelijke overeenstemming zijn. Zorg ervoor dat de regressie overeenkomt met het algemene patroon van de getekende data en dat de residuen niet zo groot zijn dat ze de dosis-respons curve plat maken.
OPMERKING: De software zal de resultaten van de niet-lineaire regressie samenvatten en de concentratie die de half maximale respons (EC 50 ), Hill-coëfficiënt (n H ) en half-maximale remmende concentratie (IC 50 ) oplevert, aangeeft. - Afleiden van de agonist / antagonistparameter.
- Leid de agonist equIlibrium dissociatie constanten (Kb) uit een van de volgende experimenten 16 , 17 , 18
- Bepaal de verschuiving in de dosis-respons van een agonist in concurrentie met een vaste concentratie antagonist. Hier, EC 50 '= EC 50 (1 + [antagonist] / antagonist Kb ), waar EC 50 ' de rechtsverschuivende EC 50 is .
- Bepaal [ 35 S] GTPγS binding met verschillende concentraties antagonist in concurrentie met een vaste concentratie van agonist. Hier, K b = IC 50 / (2 + ([agonist] / agonist EC 50 ) n ) 1 / n - 1, waar n de heuvelcoëfficiënt van de agonist is.
- Leid de agonist equIlibrium dissociatie constanten (Kb) uit een van de volgende experimenten 16 , 17 , 18
- Afhankelijk van de variabiliteit van de data, herhaal het experiment (stappen 3.8-5.6) voor elk ligand ongeveer 3-5 keer en gemiddelde de resultaten met behulp van een statistiek en analyse softwarezijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cell fractionering kan worden gebruikt om membraan geassocieerde eiwitten te isoleren en verrijken uit cytosolische en nucleaire eiwitten. Figuur 1 is een Western blot die de inhoud van de drie primaire fracties demonstreert die kan worden verzameld tijdens het subcellulaire fractioneringsproces. Specifiek blijkt dat fractionering fractionele membraanproteïnen ( dat wil zeggen Na + / K + ATPase, proteinedisulfide-isomerase (PDI) en HA-MOR1) scheidt van histon H2B en glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH), nucleaire eiwitten en cytosolische eiwitten, respectievelijk. Bovendien toont Figuur 1 het verrijken van eiwitten (laan 1 vergeleken met laan 4) in hun respectievelijke subcellulaire fracties als gevolg van fractionering. Een representatieve Ponceau vlek toont gelijke eiwitbelasting in elke fractie. Het is belangrijk om op te merken dat dit fractiOnatie protocol onderscheidt zich niet van verschillende cellulaire membranen. PDI is over het algemeen gelokaliseerd aan het endoplasmatische reticulum (ER), terwijl Na + / K + ATPase overwegend bij het plasmamembraan is. Echter, beide eiwitten zijn aanwezig in de uiteindelijke ruwe membraanfractie ( Figuur 1 , baan 4). Bovendien, terwijl dit protocol sterk nucleaire eiwitten scheidt van de cytosolische en uiteindelijke membraanfractie ( Figuur 1 , rijstroken 2-4) bevat de fractie verrijkt voor nucleaire eiwitten enkele membraaneiwitten ( Figuur 1 , rijstrook 2), mogelijk uit het ER.
Meerdere farmacologische parameters kunnen worden afgeleid om een GPCR-ligand interactie te karakteriseren via GTP-bindende experimenten ( Tabel 1 ). Bijvoorbeeld kan de half maximale respons (EC50) en Hill coëfficiënt (nH) van een agonist worden afgeleid door het monitoren van GTP binding inReactie op verschillende doses van de agonist. Figuur 3A toont dosis-responsieve GTP binding aan MOR1 na DAMGO behandeling. Wanneer de data geschikt is voor een vierparameter niet-lineaire regressie, beschrijft de fit een receptor-ligand interactie met een EC 50 van 185 ± 23 nM en een Hill coëfficiënt van 0,46 ± 0,06. De ondiepe GTP-bindingscurve waargenomen na DAMGO-behandeling suggereert een negatieve coöperatie tussen DAMGO en MOR1. Deze methode kan ook de farmacologie van een antagonist identificeren en omschrijven. Zoals figuur 3A en B illustreert, is naloxon een MOR1 antagonist. De agonistische kracht (Kb) van naloxon, 97 ± 20 nM, werd bepaald door de concentratie van naloxon te variëren in concurrentie met een vaste concentratie van DAMGO ( Figuur 3A ). Naloxon vertoonde een heuvelcoëfficiënt van 0,88 ± 0,06, wat de onafhankelijke binding tussen naloxon en MOR1 voorstelde. Als de acEen ligand is niet bekend, deze analyse kan onderscheiden tussen een agonist, antagonist en inverse agonist. Als het ligand een agonist is, zou er een toename van GTP-binding zijn, zoals in Figuur 3A , na DAMGO-toepassing. Als het ligand een inverse agonist is, zou er een verminderde binding van GTP ten opzichte van basale binding zijn. Als het ligand een antagonist is, zou er geen effect zijn op de behandeling met ligand alleen. Als gelijktijdig met een agonist toegepast wordt, zou een antagonist het vermogen van de agonist remmen om GTP-binding te stimuleren. Figuur 3A illustreert de antagonistische activiteit van naloxon tegen de agonist DAMGO.
Figuur 1: Cellulaire fractie scheidt membraan geassocieerde, nucleaire en cytosolische eiwitten. ( Top ) Lane 1 staat voor deEiwit aanwezig in de hele cel. Laan 2 bevat nucleaire en membraan geassocieerde eiwitten gescheiden tijdens de eerste centrifugatie stappen. Laan 3 is de cytosolische fractie gescheiden na 20 minuten centrifugatie bij 11.000 x g. Laan 4 bevat een ruwe membraanfractie geschikt voor [35S] GTPγS-bindende experimenten. ( Bottom ) Ponceau vlek van een westerse membraan demonstreert eiwitbelasting voor elke cellulaire fractie. De volgende antilichamen werden gebruikt voor immunoblotting: muis anti-Na + / K + -ATPase (1: 1000), muis anti-GAPDH (1: 5000), muis anti-H2B (1: 2.500), konijn anti-PDI : 1.000) en rat anti-HA (1: 2000). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stroomschema die de fractie en de [35S] GTPγS-bindingsprocedure uiteenzet. Eerst, transfecteer de cellen om de GPCR van belang uit te drukken. Na 48 uur, geoogst en fractioneer de cellen om de receptor (rood) en geassocieerde G-eiwitten te isoleren (groen = G α , paars = G β , en oranje = G γ ). Om GTP-bindende experimenten uit te voeren, voeg [ 35 S] GTPγS toe en incubeer de membranen met het ligand van belang. Om de G-eiwitactiviteit te meten, bind de membranen aan een filter om eventuele ongebonden radiochemische stoffen weg te wassen en vervolgens de gebonden [ 35 S] GTPγS te kwantificeren door middel van vloeibare scintillatietelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Agonisme aNd Antagonisme bij μ-opioïde Receptoren gedefinieerd door [ 35 S] GTPγS binding. ( A ) [ 35 S] GTPγS dosis-respons curve naar DAMGO alleen (blauw) of naloxon in competitie met 2,5 μM DAMGO (groen). [35S] GTPγS binding werd genormaliseerd tot de maximale stimulatie in elk experiment en werd uitgedrukt als een percentage. De getoonde punten zijn de gemiddelde van triplicaatbepalingen en worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SEM ( B ) Antagonisme van DAMGO gestimuleerde [ 35 S] GTPγS Bindend met naloxon. [35S] GTPγS Binding werd gekwantificeerd na de toevoeging van alleen naloxon (100 uM), DAMGO alleen (10 uM) of DAMGO (10 uM) in concurrentie met naloxon (100 uM). De resultaten worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. Klik dan op hijWeer een grotere versie van deze figuur te zien.
| ligand | EC 50 of IC 50 (nM) | N H | K b (nM) |
| DAMGO | 185 ± 23 | 0,46 ± 0,06 | |
| naloxon | 420 ± 87 | 0,88 ± 0,06 | 97 ± 20 |
Tabel 1: Farmacologische parameters van DAMGO en naloxonactiviteit bij μ-opioïde Receptoren. De half maximale respons (EC 50 ) en Hill-coëfficiënt (n H ) voor DAMGO werden afgeleid van [ 35 S] GTPγS-binding in reactie op verschillende doses DAMGO. De half maximale remmende concentratie(IC50) en evenwichtsdissociatieconstante (Kb) voor naloxon werden bepaald uit het effect van de concurrentie tussen naloxon en 2,5 μM DAMGO op [35S] GTPγS-binding. De resultaten worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het onderhavige protocol beschrijft twee afzonderlijke maar complementaire methoden: een eenvoudige aanpak van fractioneren cellen en weefsels in brede maar aparte compartimenten en een middel om GPCR signalering te onderzoeken door de meting van [ 35 S] GTPγS binding.
Efficiënte cellulaire fractionering heeft een breed scala aan toepassingen, variërend van de extractie en verrijking van eiwitten, naar de beoordeling van de subcellulaire lokalisatie van eiwitten, aan de studie van receptor farmacologie. Hoewel er alternatieve benaderingen zijn om cellen en weefsels te fractioneren, is het hier gepresenteerde protocol betrekkelijk goedkoper, sneller en eenvoudiger. In tegenstelling tot meer gevestigde methoden kan deze methode echter geen plasmamembraan geassocieerde eiwitten scheiden van andere membranale compartimenten, zoals endosomen of het ER. Ook moet worden opgemerkt dat terwijl het bovenstaande protocol een transient overexpressiesysteem gebruikt om celmembranen te genereren die de GPCR vanInteresse, dit protocol is compatibel met stabiele overexpressiesystemen, evenals met dierlijk of menselijk weefsel 19 .
Proefbereiding is essentieel om fractieopbrengst en zuiverheid te maximaliseren. Het is bijzonder belangrijk om volledige homogenisatie te waarborgen en om de overgangstijden tussen centrifugatiestappen te minimaliseren. Het gebruik van een pellethomogenisator / stamper om het celmembraan volledig te verstoren verhoogt de ruwe membraanopbrengst in de uiteindelijke celfractie aanzienlijk. Als de membraanopbrengst te laag is, zouden de twee eenvoudigste oplossingen zijn om de initiële celkweek op te schalen en / of de celpelletje een paar keer te homogeniseren. Als individuele fracties een hoge mate van onzuiverheid hebben, vermindert u de overgangstijden tussen centrifugatie en scheiding. Laat de monsters niet zitten na centrifugeren, aangezien eiwitten in het monster kunnen diffunderen en de fractiezuiverheid verminderen.
Filtration-based [ 35 S] GTPyS binding is een snelle en kwantitatieve methode om de activatie van G-eiwitten te meten met behulp van de bijbehorende receptor. Het meten van GTP-binding zorgt voor een meer kwantitatieve meting van GPCR-activiteit dan algemeen mogelijk bij het monitoren van stroomafwaartse processen. Er zijn echter twee kritieke beperkingen voor de methode die hierin wordt beschreven. Belangrijker nog, filtratie gebaseerde [ 35 S] GTPγS kwantificering is niet even haalbaar met alle G a isoformen 20 , 21 . In het algemeen is deze methode beperkt tot G i / o- gekoppelde GPCR's zoals MOR1 22 . G s- en G q- gekoppelde receptoren hebben de neiging om minder gevoelig te zijn. Dit komt waarschijnlijk door de combinatie van de lagere overvloed van G s / G q en hun relatief langzamer nucleotide wisselkoers, waardoor het moeilijk is om echte [ 35 S] GTPγS binding boven de achtergrond te onderscheiden. Deze beperking is elders aangepakt Overal met gebruikmaking van G-eiwit antilichaam capture technieken 20 . Sommige groepen hebben geconstateerd dat het elimineren van BBP uit de reactie de signaal-ruisverhouding voor G s- of G q- gekoppelde receptoren 23 verbetert. De tweede beperking is de membraan gevoeligheid voor lipofiele agonisten of oppervlakteactieve stoffen. [ 35 S] GTPγS assays vereisen functionele receptor-G-eiwitcomplexen en de toevoeging van lipofiele moleculen aan het reactiesysteem kan de structuur van de membranen of deze complexen verstoren. Als dit een mogelijke zorg is, kan het voordelig zijn om te testen of het reagens van belang [35S] GTPγS binding in een reeds goed gekarakteriseerd systeem verstoort, zoals in DAMGO gemedieerde MOR1 stimulatie. Andere voorwaarden om optimalisatie te overwegen omvatten de bindingsbuffer pH, de concentraties Mg 2+ en NaCl, de eiwitconcentratie en de incubatietijd 23 ,Ef "> 24.
Dit protocol richtte zich op een goed gekenmerkte GPCR, de MOR1 en goed gekenmerkte drugs, DAMGO (agonist) en naloxon (antagonist), die op MOR1 handelen. Echter, één van de voordelen van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om onbekende liganden te karakteriseren als agonisten, antagonisten of inverse agonisten, afhankelijk van hoe het ligand GTP-binding moduleert. Bij het ontwerpen van experimenten is het van kritiek belang om een bereik van concentraties van het ligand van belang te gebruiken en rekening te houden met het bereik van de resultaten: agonisten zullen leiden tot een toename van GTP binding over de basislijn, inverse agonisten zullen een afname in GTP-binding vergeleken met Baseline en antagonisten hebben weinig of geen effect wanneer ze afzonderlijk worden toegevoegd aan de basis-GTP binding.
Samengevat beschrijft dit protocol een techniek voor het uitvoeren van subcellulaire fractionering, het verzamelen van ruwe membraanpreparaten en het onderzoeken van GPCR-activering door het meten van [ 35 S] GTPγS binding. Deze technieken kunnen gemakkelijk aangepast worden aan een verscheidenheid aan celkweek- en weefselmodellen om de farmacologie van een van de belangrijkste families van receptoren te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health subsidie DA-000266 en het Medisch Wetenschappelijk Opleidingsprogramma T32-subsidie (CV, NWZ, en PCS). De auteurs willen ook somersault18: 24 (somersault1824.com) voor de Library of Science & Medical Illustrations erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in a 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Cell culture 10 cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), New York, NY. 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), New York, NY. 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), New York, NY. 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), New York, NY. 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , Springer. 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
