Summary
La liaison à la guanosine triphosphate (GTP) est l'un des premiers événements dans l'activation du récepteur couplé aux protéines G (GPCR). Ce protocole décrit comment caractériser pharmacologiquement des interactions spécifiques de GPCR-ligand en surveillant la liaison de l'analogue GTP radio-marqué, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), en Réponse à un ligand d'intérêt.
Abstract
Les récepteurs couplés à la protéine G (GPCR) sont une grande famille de récepteurs transmembranaires qui jouent un rôle critique dans la physiologie cellulaire normale et constituent une cible pharmacologique majeure pour de multiples indications, y compris l'analgésie, la régulation de la pression artérielle et le traitement des maladies psychiatriques. Lors de la liaison au ligand, les GPCR catalysent l'activation des protéines G intracellulaires en stimulant l'incorporation du guanosine triphosphate (GTP). Les protéines G activées stimulent alors les voies de signalisation qui provoquent des réponses cellulaires. La signalisation GPCR peut être surveillée en mesurant l'incorporation d'une forme radiomarquée et non hydrolysable de GTP, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS), en protéines G. Contrairement à d'autres méthodes qui évaluent plus de processus de signalisation en aval, [ 35 S] GTPγS binding mesure un événement proximal dans la signalisation GPCR et, surtout, peut distinguer l'agonisTs, antagonistes et agonistes inverse. Le présent protocole décrit une méthode sensible et spécifique pour l'étude de la signalisation GPCR en utilisant des préparations à membrane brute d'un GPCR archétypal, le récepteur μ-opioïde (MOR1). Bien qu'il existe des approches alternatives pour le fractionnement des cellules et des tissus, beaucoup sont coûteuses, fastidieuses et / ou nécessitent des équipements de laboratoire non standard. La présente méthode fournit une procédure simple qui enrichit les membranes brutes fonctionnelles. Après avoir isolé MOR1, diverses propriétés pharmacologiques de son agoniste, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) et antagoniste, naloxone, ont été déterminées.
Introduction
Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont une grande famille de récepteurs de surface cellulaire responsables d'une gamme remarquable de processus physiologiques, y compris l'analgésie, l'olfaction et le comportement 1 . Les GPCR agissent en détectant des signaux externes spécifiques et en stimulant ensuite la signalisation intracellulaire. Ils marquent donc une jonction clé entre les environnements externe et interne d'une cellule. En raison du rôle critique que jouent les GPCR dans la biologie, ils sont devenus des cibles majeures pour la recherche fondamentale et la découverte de médicaments 2 , 3 .
Contrairement à d'autres familles de récepteurs qui se lient à des ligands discrets, les GPCR peuvent lier des molécules très différentes. Alors qu'un GPCR peut interagir avec des peptides, un autre peut détecter les photons, les petites molécules ou les ions 1 , 4 . Bien que leurs ligands soient diversifiés, les GPCR sont unifiés dans leur architecte généralUre et fonction. Les GPCR individuels sont constitués de sept protéines transmembranaires α-hélicoïdales avec des terminaux amino extracellulaires et des terminaux carboxyle intracellulaires 5 , 6 . Les GPCR sont couplés aux protéines G intracellulaires - complexes de protéines hétérotrimères composés de sous-unités α, β et γ - qui opèrent sur différentes voies de signalisation 7 . La sous-unité G α est une protéine de liaison aux nucléotides de guanine qui est inactif lorsqu'elle est liée au diphosphate de guanosine (PIB) et active lorsqu'elle est liée au guanosine triphosphate (GTP) 8 , 9 . Lorsque les GPCR lient leurs ligands, ils subissent un changement conformationnel qui permet à G α de se dissocier de G βγ , permettant ainsi à G α d'échanger le PIB pour GTP 7 . Le récepteur lui-même est phosphorylé à son extrémité carboxyle par divers serine / threonIne kinases 10 , 11 et internalisées pour atténuer la signalisation du récepteur 12 , 13 , 14 . Pendant ce temps, le monomère G α activé et le dimère G βγ procèdent à l'activation de voies de signalisation distinctes 7 . Il existe plusieurs isoformes de chaque sous-unité de protéine G, et chaque isoforme cible des voies en aval et des systèmes de messagerie secondaire particuliers. Les principales isoformes de G α comprennent G s , G q , G i / o et G 12-13 . Généralement, les GPCR individuels s'associaient à une isoforme G α particulière, reliant ainsi un stimulus externe à une réponse cellulaire spécifique 1 .
La caractérisation d'une interaction GPCR-ligand est essentielle pour comprendre la biologie du récepteur. Comme l'échange de PIB / GTP est l'une des premières veilleNts qui suit la liaison du ligand, la surveillance de la liaison GTP peut mesurer l'activation ou l'inhibition du GPCR. L'analyse de plus d'événements en aval dans la signalisation GPCR n'est souvent pas aussi quantitatif ni stoechiométrique, peut ne pas distinguer les agonistes complets de ceux partiels et peut nécessiter des réactifs coûteux. En outre, l'augmentation de la liaison GTP aux protéines G α est un événement presque universel suite à l'activation du GPCR, ce qui signifie que la mesure de la liaison GTP est un dosage largement applicable pour le suivi de l'activité de la plupart des GPCR. La mesure de la liaison GTP est une approche simple et rapide pour surveiller la signalisation GPCR dans les cellules surexprimant le récepteur d'intérêt ou dans le tissu indigène. Le présent protocole détaille un dosage fonctionnel de liaison GTP en utilisant un GPCR archétypal, le récepteur μ-opioïde (MOR1), pour déterminer quantitativement l'activité d'un agoniste et d'un antagoniste sur la signalisation GPCR.
Ce protocole décrit d'abord comment isoler les membranes brutes des cellules qui surexpriment MOR1. Notez queCe protocole ne se limite pas aux systèmes de surexpression et peut être appliqué à de nombreuses sources de membrane, y compris des tissus indigènes ou des préparations exprimant des récepteurs multiples et des protéines G 15 . Le protocole détaille ensuite comment mesurer la liaison d'un analogue GTP radioactif à ces membranes en réponse à des concentrations variables de [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) ou de naloxone, un agoniste et antagoniste MOR1, respectivement. L'analogue GTP, [ 35 S] guanosine-5'-O- (3-thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS) n'est pas hydrolysable. Cette propriété est critique parce que les sous-unités G α présentent une activité GTPase intrinsèque 7 et élimineraient le phosphate gamma marqué sur un radiochimique GTP hydrolysable. Les membranes sont ensuite piégées sur des filtres à fibres de verre et lavées, après quoi le GTP radiomarqué est quantifié par comptage par scintillation liquide. Des paramètres pharmacologiques multiples peuvent être dérivés pour caractériserE l'interaction récepteur-ligand, y compris la réponse demi-maximale (EC 50 ) et le coefficient Hill (n H ) pour les agonistes et la concentration inhibitrice demi-maximale (IC 50 ) et la constante de dissociation à l'équilibre (K b ) pour les antagonistes 16 , 17 , 18 .
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Protocol
1. Expression de HA-MOR1 recombinant dans des cellules cultivées
REMARQUE: Suivez tous les protocoles de culture cellulaire dans une hotte à flux laminaire stérile.
- Stériliser le capot de flux laminaire de culture cellulaire avec 70% d'éthanol et maintenir une technique stérile tout au long de la culture cellulaire.
- Préparer le milieu de culture cellulaire des cellules de rein embryonnaires humaines 293 (HEK293), compléter le milieu Eagle Eagle (DMEM) modifié par Dulbecco: DMEM, pH 7,4, additionné de L-glutamine 2 mM, 1% de pénicilline / streptomycine et 10% de sérum bovin fœtal (FBS ).
- Placer 2,5 x 10 6 cellules HEK293 sur une plaque de culture tissulaire de 10 cm dans 10 mL de DMEM complet et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu'à atteindre 70 à 80% de confluence (O / N).
REMARQUE: Pour recueillir suffisamment de protéines pour une expérience complète de liaison au GTP, déposez au moins 3 x 10 cm de plaques de cellules. - Transférez les cellules avec HA-MOR1 en utilisant un réactif de transfection de choix et en suivant le fabricant 'Les lignes directrices de s. Incuber pendant 36-48 h.
NOTE: L'ADNc de MOR-1 humain (NCBI Reference Sequence: NM_000914.4) était un cadeau généreux de Gavril Pasternak et a été clone dans pCMV-HA.
2. Cellules de fractionnement et de collecte de membrane
- Préparez les tampons de lyse suivants:
- Tampon 1: acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-pipérazineéthanesulfonique 10 mM (HEPES), pH 7,4; 1 mM d'éthylène glycol-bis (β-aminoéthyléther) -N, N, N ', N'-tétraacétique (EGTA); 10% de saccharose; Cocktail d'inhibiteur de protéase; Et 1 mM de dithiothréitol (DTT). Ajouter le DTT frais le jour de l'isolement de la membrane.
- Tampon 2: HEPES 10 mM, pH 7,4; EGTA 1 mM; MgCl 2 1 mM; Et 1 mM de TNT. Ajouter le DTT frais le jour de l'isolement de la membrane.
- Enlever les cellules transfectées de l'incubateur (étape 1.4), aspirer le milieu et rincer les cellules avec 5 ml de solution salée tamponnée au phosphate glacée (PBS). Aspirer le PBS et l'excès de liquide dela plaque.
- Ajouter 600 μL de tampon 1 aux cellules. À l'aide d'un grattoir cellulaire, délimiter les cellules de la surface de la plaque et pipeter la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 1,6 mL.
- Immédiatement, congéler le tube de microcentrifugeuse à l'azote liquide. Une fois que les échantillons sont congelés, décongeler les lysats sur de la glace ou les placer à -80 ° C pour un stockage à long terme.
- Répétez les étapes 2.3 et 2.4 avec toutes les plaques de cellules.
- Une fois que les lysats ont été décongelés, utilisez un homogénéisateur micro-tube à impulsion unique pour ouvrir les cellules. Pousse l'homogénéisateur 3-5 fois pendant 10 s, remet le tube sur la glace pendant 30 s entre les impulsions.
- Recueillir 20 μL en tant que fraction de cellule entière.
- Centrifuger l'échantillon restant pendant 10 min à 1000 xg et 4 ° C. Recueillir le surnageant et placer dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,6 mL sur de la glace.
- Remettre en suspension la pastille dans 100 μl de tampon 1 et réhomogénéiser avec un pilon. Pulse homoGénérateur 3-5 fois pendant 5 s, remettre le tube sur la glace pendant 30 secondes entre les impulsions.
- Centrifuger l'échantillon une seconde fois pendant 10 min à 1000 xg et 4 ° C. Mélanger le surnageant avec le surnageant à partir de l'étape 2.7.
REMARQUE: La pastille restante contient des protéines nucléaires et membranaires.
- Centrifuger l'échantillon une seconde fois pendant 10 min à 1000 xg et 4 ° C. Mélanger le surnageant avec le surnageant à partir de l'étape 2.7.
- Centrifuger les surnageants combinés pendant 20 min à 11 000 xg et 4 ° C. Séparer le surnageant (la fraction cytosolique) en un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,6 mL.
- Remettre en suspension la pastille dans 200 μL de tampon 2. Homogénéiser la pastille en la triturant 3 à 5 fois. Centrifuger l'échantillon pendant 20 min à 21 100 xg et 4 ° C. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension la pastille contenant la fraction de membrane brute dans 50 μL de tampon 2.
- Immédiatement, procédez aux expériences de liaison GTPγS (section 3) ou congéluez-vous dans de l'azote liquide et conservez à -80 ° C.
3. Reliure [ 35 S] GTPγS REMARQUE: utilisez un protocole de sécurité radiochimique standard lors de la manipulation de [ 35 S] GTPγS et lors de la conduite de [ 35 S] expériences de liaison GTPγS. Portez des gants de protection et une blouse de laboratoire en tout temps. Vérifiez le matériau d'emballage pour les fuites ou les fissures. Éliminer les déchets et les réactifs en excès selon les protocoles institutionnels.
- Préparer un tampon de liaison incomplète (IBB) en mélangeant 50 mM de HEPES, pH 7,4; MgCl2 5 mM; NaCl 100 mM; Et 1 mM d'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) dans de l'eau distillée.
- Diluer le stock [35S] GTPγS à 50 nM dans 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 et 10 mM DTT. Faire des aliquotes de 500 μL et les conserver à -80 ° C. N'utiliser qu'une partie aliquote fraîchement décongelée immédiatement avant d'amorcer l'expérience. Décongeler les aliquotes sur de la glace.
- Préparer des GTPyS non radiographiés en dissolvant 1 mg de poudre GTPγS dans 177,62 μL d'eau pure pour une concentration en stock de 10 mM. Faire des aliquotes de 10 μL et les conserver à-20 ° C.
- Préparer un tampon de liaison complet (CBB) en complétant IBB pour inclure une concentration finale de DTT 1 mM, 0,1% (poids / vol) d'albumine de sérum bovin (BSA), 10 uM de GDP et 0,1 μM [ 35 S] GTPγS.
REMARQUE: le CBB contient maintenant un GTP radiomarqué. Prenez les consignes de sécurité appropriées tout en travaillant avec des solutions radioactives. - Décongeler la fraction de membrane à partir de l'étape 2.11 sur la glace.
- Quantifier la concentration en protéines de la fraction membranaire par un dosage de protéines Bradford en utilisant un spectrophotomètre à 595 nm.
- Préparez une série de dilutions de protéines BSA avec le tampon 2, aux concentrations finales de 0, 250, 500, 750, 1 500, 2 500 et 5 000 μg / mL.
- Ajouter 2 μL de chaque étalon ou membrane à 1 mL de réactif Bradford dans une cuvette. Bien mélanger en vortex.
- Ajuster le spectrophotomètre à une longueur d'onde de 595 nm et blanc en utilisant la cuve avec 0 μg / mL de protéine.
- Attendez 5 min et rEad chacune des normes et chacun des échantillons à une longueur d'onde de 595 nm.
- Tracer l'absorbance des normes par rapport à la concentration. En utilisant la loi de Beer-Lambert (A = εcl, où ε = coefficient d'extinction, l = longueur de cuve et c = concentration), calculer la concentration des échantillons de membrane.
- Diluer les fractions membranaires à une concentration de 100 μg de protéine / ml dans IBB.
REMARQUE: Un plat de 10 cm de cellules HEK293 donne habituellement entre 1 et 3 mg de protéine / mL. - Préparez les conditions expérimentales suivantes dans des tubes individuels de microcentrifugeuse de 1,6 mL: une série de dilution de ligand, une condition d'activité basale pour mesurer la liaison GTP basale et une condition de liaison non spécifique pour mesurer une liaison GTP non spécifique.
- Pour la série de dilution de ligand, préparer une série de dilution du ligand d'intérêt dans un volume final de 100 μL de CBB. Préparez la série de ligands à 2x la concentration finale souhaitéeOns. Espacer les concentrations de ligands pour couvrir adéquatement une gamme de réponses.
- Pour analyser l'effet de DAMGO sur la liaison GTP via MOR1, préparer des dilutions DAMGO de 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM et 2 pM en CBB (finale Volume: 100 μL).
NOTE: Par exemple, si le ligand d'intérêt a une valeur EC 50 attendue de 10 μM, préparer des dilutions de ligand de 200 nM, 2 μM, 20 μM, 200 μM et 2 mM. Ces cinq conditions couvrent une large gamme de concentrations et sont 2 fois la concentration souhaitée pour l'analyse.
- Pour analyser l'effet de DAMGO sur la liaison GTP via MOR1, préparer des dilutions DAMGO de 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM et 2 pM en CBB (finale Volume: 100 μL).
- Pour la liaison basale, prépare un tube avec 100 μL de CBB seulement.
- Pour une liaison non spécifique, préparer un tube avec 99 μL de CBB supplémenté avec 1 μL de GTPγS non marqué au 2 mM.
- Pour la série de dilution de ligand, préparer une série de dilution du ligand d'intérêt dans un volume final de 100 μL de CBB. Préparez la série de ligands à 2x la concentration finale souhaitéeOns. Espacer les concentrations de ligands pour couvrir adéquatement une gamme de réponses.
- Ajouter 100 μL de la solution à membrane diluée (étape 3.7) à chaque condition expérimentale.
- Incuber les membranes avec les différentes expériencesConditions entales dans des tubes de microcentrifugation de 1,6 mL pendant 30 min à 25 ° C dans un thermomixer ou sur un agitateur orbital.
4. Filtration membranaire
- Préparer le tampon de lavage en combinant 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4; 5 mM de MgCl 2 ; Et 50 mM de NaCl dans de l'eau distillée.
- Presoak les filtres en fibre de verre dans l'eau pendant 10 min.
REMARQUE: les filtres ont une taille de pore de 1 μm, un diamètre de 2,1 cm et une épaisseur de 675 μm. - Retirez les échantillons du thermomixer ou du shaker orbital (étape 3.10). Enroulez brièvement les échantillons pendant 5 s pour collecter chaque échantillon au fond du tube.
- Retirer le couvercle de l'appareil de filtration sous vide. Posez les filtres pré-fixés sur les orifices de vide de l'appareil. Rétablissez le couvercle de l'appareil pour former un joint sous vide. Allumez le vide.
- Pipetter 195 μL de chaque condition expérimentale de 200 μL sur les filtres pour minimiser l'erreur d'adsorption sur les parois du tube et / ou de la pipetteTing.
- Laver les filtres trois fois avec 1 ml de tampon de lavage glacé.
5. Comptage des scintillations liquides
- Placer des flacons de comptage de scintillation de 5 mL dans une grille de comptage. Ajouter 5 mL de fluide scintillant à chaque flacon.
- Éteignez le vide (étape 4.4). Retirer le couvercle de l'appareil de filtration sous vide. À l'aide de pincettes, retirez les filtres des orifices de vide de l'appareil de filtration et déposez chaque filtre dans un flacon de scintillation individuel de 5 mL.
- Préparez un flacon avec 195 μL de CBB pour déterminer le signal maximal.
- Capsule chaque flacon en toute sécurité. Incuber les flacons sur un agitateur orbital à 25 ° C pendant 10 min.
- Allume le compteur de scintillation. Programmer le compteur de scintillation pour mesurer l'émission d'isotopes 35 S pendant 5 min par échantillon en utilisant le programme de scintillation associé standard.
- Appuyez sur "Démarrer" pour prendre un compte.
- Lorsque le comptage est terminé, disposez le flacon comptéS comme déchets dangereux.
6. Analyse des données
- Entrez les données dans les statistiques et les logiciels d'analyse.
- Soustraire la liaison non spécifique de chacune des autres mesures pour déterminer la liaison spécifique.
NOTE: Le degré de liaison non spécifique est déterminé par l'échantillon incubé avec GTPγS non radiomarqué (étape 3.8.3). - Ouvrez le logiciel de statistiques et d'analyse et sélectionnez une entrée de jeu de données XY.
- Entrez les données de liaison spécifiques des expériences de liaison [ 35 S] GTPγS dans un tableau de données dans le logiciel de statistiques et d'analyse. Entrez les concentrations d'agonistes, en tant que concentrations molaires, dans la colonne "X". Entrez les comptes 35 S associés en tant que valeurs "Y".
- Soustraire la liaison non spécifique de chacune des autres mesures pour déterminer la liaison spécifique.
- Transformez les données.
- Convertissez les valeurs X en leur logarithme respectif en cliquant sur "Analyser". Sélectionnez "Transformer" à partir de la version intégrée.N analyses.
- Dans la boîte de dialogue "Transformer", sélectionnez "Transformer X values using" et sélectionnez la fonction "X = log (X)". Choisissez de créer un nouveau graphique des résultats.
- Cliquez sur "OK".
- Normalize les valeurs Y.
- Avec les résultats transformés affichés, cliquez sur "Analyser". Sélectionnez "Normalize" dans les analyses intégrées.
- Dans la boîte de dialogue "Normaliser", sélectionnez le bouton radio pour définir 0% comme «la plus petite valeur dans chaque ensemble de données» et 100% comme «la plus grande valeur dans chaque ensemble de données». Sélectionnez la case pour présenter les résultats en pourcentage. Sélectionnez la case pour créer un nouveau graphique des résultats.
- Cliquez sur "OK".
- Ajuster une courbe de régression non linéaire aux données traçées. Effectuer une analyse de régression non linéaire.
- Avec les résultats normalisés affichés, cliquez sur "Analyser". Des analyses intégrées, Sélectionnez "Régression non linéaire (ajustement en courbe)".
- Si vous étudiez un agoniste, sélectionnez "log (agonist) vs. réponse normalisée - pente variable" dans la boîte de dialogue.
- Si l'on étudie un antagoniste, "sélectionnez log (antagoniste) par rapport à la réponse normalisée - inclinaison variable" dans la boîte de dialogue.
- Cliquez sur "OK".
- Examinez le graphique et les résultats pour vous assurer que l'ajustement et les données sont en accord raisonnable. Assurez-vous que la régression correspond au schéma général des données tracées et que les résidus ne sont pas si grands qu'ils rendent la courbe dose-réponse plate.
REMARQUE: le logiciel résume les résultats de la régression non linéaire et détaille la concentration qui provoque la réponse à moitié maximale (EC 50 ), le coefficient de colline (n H ) et la concentration inhibitrice demi-maximale (IC50). - Dérivation de l'effet de l'agoniste / antagoniste.
- Diffusez l'agoniste équConstantes de dissociation de l'ilibrium (K b ) de l'une des expériences suivantes 16 , 17 , 18
- Évaluer le décalage de la dose-réponse d'un agoniste en compétition avec une concentration fixe d'antagonistes. Ici, EC 50 '= EC 50 (1 + [antagoniste] / antagoniste Kb ), où EC 50 ' est le EC 50 décalé vers le bas.
- Évaluez [ 35 S] GTPγS liant avec des concentrations variables d'antagonistes en concurrence avec une concentration fixe d'agoniste. Ici, K b = IC 50 / (2 + ([agoniste] / agoniste EC 50 ) n ) 1 / n - 1, où n est le coefficient de Hill de l'agoniste.
- Diffusez l'agoniste équConstantes de dissociation de l'ilibrium (K b ) de l'une des expériences suivantes 16 , 17 , 18
- Selon la variabilité des données, répétez l'expérience (étapes 3.8-5.6) pour chaque ligand environ 3-5 fois et moyennez les résultats à l'aide d'une analyse statistique et d'analysesont.
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Representative Results
Le fractionnement cellulaire peut être utilisé pour isoler et enrichir les protéines associées à la membrane à partir de protéines cytosoliques et nucléaires. La figure 1 est une Western blot démontrant le contenu des trois fractions primaires qui peuvent être collectées pendant le processus de fractionnement sous-cellulaire. Plus précisément, la figure 1 montre que le fractionnement sépare de manière propre les protéines membranaires ( c'est-à-dire Na + / K + ATPase, protéine disulfide isomérase (PDI) et HA-MOR1) à partir de l'histone H2B et de la 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) glycéraldédotique, des protéines nucléaires et des protéines cytosoliques, respectivement. En outre, la figure 1 démontre l'enrichissement des protéines (voie 1 par rapport à la voie 4) dans leurs fractions sous-cellulaires respectives à la suite du fractionnement. Une tache représentative de Ponceau démontre une charge protéique égale dans chaque fraction. Il est important de noter que cette fractureLe protocole d'onation ne fait pas de distinction entre les différentes membranes cellulaires. La PDI est généralement localisée dans le réticulum endoplasmique (ER), alors que la Na + / K + ATPase est principalement à la membrane plasmique. Cependant, les deux protéines sont présentes dans la fraction finale de la membrane brute ( Figure 1 , voie 4). En outre, alors que ce protocole sépare solidement les protéines nucléaires de la fraction de la membrane cytosolique et finale ( Figure 1 , pistes 2 à 4), la fraction enrichie pour les protéines nucléaires contient certaines protéines membranaires ( Figure 1 , voie 2), éventuellement à partir de l'ER.
Des paramètres pharmacologiques multiples peuvent être dérivés pour caractériser une interaction GPCR-ligand via des expériences de liaison GTP ( tableau 1 ). Par exemple, la réponse à moitié maximale (EC 50 ) et le coefficient de Hill (n H ) d'un agoniste peuvent être dérivés en surveillant la liaison GTP dansRéponse à différentes doses de l'agoniste. La figure 3A démontre une liaison GTP sensible à la dose à MOR1 après un traitement DAMGO. Lorsque les données sont adaptées à une régression non linéaire à quatre paramètres, l'ajustement décrit une interaction récepteur-ligand avec une EC 50 de 185 ± 23 nM et un coefficient Hill de 0,46 ± 0,06. La courbe de liaison GTP peu profonde observée après le traitement par DAMGO suggère une coopérativité négative entre DAMGO et MOR1. Cette méthode peut également identifier et décrire la pharmacologie d'un antagoniste. Comme le montrent la figure 3A et B , la naloxone est un antagoniste MOR1. La puissance agoniste (K b ) de naloxone, 97 ± 20 nM, a été déterminée en faisant varier la concentration de naloxone en compétition avec une concentration fixe de DAMGO ( Figure 3A ). La naloxone a montré un coefficient de Hill de 0,88 ± 0,06, ce qui suggère une liaison indépendante entre la naloxone et la MOR1. Si l'acLa formation d'un ligand est inconnue, ce dosage peut discriminer entre un agoniste, un antagoniste et un agoniste inverse. Si le ligand est un agoniste, il y aurait une augmentation de la liaison GTP, comme dans la Figure 3A , suite à l'application DAMGO. Si le ligand est un agoniste inverse, il y aurait une liaison diminuée de GTP par rapport à la liaison basale. Si le ligand est un antagoniste, il n'y aurait aucun effet sur le traitement avec le ligand seul. Si elle est appliquée en même temps avec un agoniste, un antagoniste inhiberait la capacité de l'agoniste à stimuler la liaison GTP. La figure 3A illustre l'activité antagoniste de la naloxone contre l'agoniste DAMGO.
Figure 1: Fractionnement cellulaire Sépare les protéines associées à la membrane, nucléaire et cytosolique. ( Haut ) La voie 1 représente leProtéine présente dans toute la cellule. La voie 2 contient des protéines nucléaires associées à la membrane séparées pendant les premières étapes de centrifugation. La voie 3 est la fraction cytosolique séparée après 20 min de centrifugation à 11 000 x g. La voie 4 contient une fraction de membrane brute appropriée pour des expériences de liaison [ 35 S] GTPγS. ( En bas ) La tache de Ponceau d'une membrane occidentale démontre le chargement de protéines pour chaque fraction cellulaire. Les anticorps suivants ont été utilisés pour immunoblot: anti-Na + / K + -ATPase de souris (1: 1 000), anti-GAPDH de souris (1: 5000), souris anti-H2B (1: 2 500), anti-PDI de lapin (1 : 1 000) et le rat anti-HA (1: 2 000). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Tableau de flux décrivant la procédure de fractionnement et [ 35 S] GTPγS-binding. D'abord, transférez les cellules pour exprimer le GPCR d'intérêt. Après 48 h, récoltez et fractionnez les cellules pour isoler le récepteur (rouge) et les protéines G associées (vert = G α , violet = G β et orange = G γ ). Pour effectuer des expériences de liaison GTP, ajouter [ 35 S] GTPγS et incuber les membranes avec le ligand d'intérêt. Pour mesurer l'activité de la protéine G, lier les membranes à un filtre pour éliminer tout agent radiochimique non lié, puis quantifier le [35S] GTPγS lié par comptage par scintillation liquide. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: l'agonisme aNd Antagonisme aux récepteurs μ-opioïdes Définis par [ 35 S] liaison GTPγS. ( A ) [ 35 S] GTPγS dose-réponse courbe à DAMGO seul (bleu) ou naloxone en concurrence avec 2.5 μM DAMGO (vert). La liaison de [ 35 S] GTPγS a été normalisée à la stimulation maximale dans chaque expérience et a été exprimée en pourcentage. Les points indiqués sont la moyenne des déterminations par triplication et sont exprimés en moyenne ± SEM ( B ) Antagonisme de la GTPγS stimulée par DAMGO [ 35 S] Liaison par naloxone. [ 35 S] GTPγS La liaison a été quantifiée après l'addition de naloxone seule (100 μM), DAMGO seule (10 μM) ou DAMGO (10 μM) en concurrence avec la naloxone (100 μM). Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. Cliquez sur luiRe à voir une version plus grande de ce chiffre.
| Ligand | EC 50 ou IC 50 (nM) | N H | K b (nM) |
| DAMGO | 185 ± 23 | 0,46 ± 0,06 | |
| Naloxone | 420 ± 87 | 0,88 ± 0,06 | 97 ± 20 |
Tableau 1: Paramètres pharmacologiques de l'activité DAMGO et Naloxone chez les récepteurs μ-opioïdes. La réponse à demi-maximale (EC 50 ) et le coefficient Hill (n H ) pour DAMGO ont été dérivés de la liaison [ 35 S] GTPγS en réponse à des doses variables de DAMGO. La concentration inhibitrice demi-maximale(IC 50 ) et la constante de dissociation d'équilibre (K b ) pour la naloxone ont été déterminées à partir de l'effet de la concurrence entre la naloxone et le DAMGO à 2,5 μM sur la liaison [ 35 S] GTPγS. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes.
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Discussion
Le présent protocole décrit deux méthodes distinctes mais complémentaires: une approche simple pour fractionner les cellules et les tissus dans des compartiments larges mais distincts et un moyen d'étudier la signalisation GPCR en mesurant la liaison [ 35 S] GTPγS.
Le fractionnement cellulaire efficace a une large gamme d'applications, allant de l'extraction et l'enrichissement des protéines, à l'évaluation de la localisation subcellulaire des protéines, à l'étude de la pharmacologie des récepteurs. Bien que des approches alternatives pour le fractionnement des cellules et des tissus existent, le protocole présenté ici est relativement moins cher, plus rapide et plus simple. Contrairement aux méthodes plus établies, cependant, cette méthode est incapable de séparer de manière propre les protéines associées à la membrane plasmatique des autres compartiments membranaires, tels que les endosomes ou les ER. Il faut noter aussi que si le protocole ci-dessus utilise un système de surexpression transitoire pour générer des membranes cellulaires contenant le GPCR deCe protocole est compatible avec des systèmes de surexpression stables, ainsi qu'avec des tissus animaux ou humains 19 .
La préparation de l'échantillon est essentielle pour maximiser le rendement et la pureté de la fraction. Il est particulièrement important d'assurer une homogénéisation complète et de minimiser les temps de transition entre les étapes de centrifugation. L'utilisation d'un homogénéisateur / pilon de pastilles pour perturber complètement la membrane cellulaire augmente de manière significative le rendement de la membrane brute dans la fraction cellulaire finale. Si le rendement de la membrane est trop faible, les deux solutions les plus simples seraient d'augmenter la culture cellulaire initiale et / ou d'homogénéiser la pastille cellulaire encore quelques fois. Si les fractions individuelles présentent un degré élevé d'impureté, réduisez les temps de transition entre la centrifugation et la séparation. Ne laissez pas les échantillons assis après la centrifugation, car les protéines peuvent se diffuser dans l'échantillon et réduire la pureté de la fraction.
Filtration basée [ 35 S] GTPγS est une méthode rapide et quantitative pour mesurer l'activation des protéines G en utilisant le récepteur associé. La mesure de la liaison GTP permet une mesure plus quantitative de l'activité GPCR que ce qui est généralement possible lors de la surveillance des processus en aval. Cependant, il existe deux limitations critiques à la méthode décrite ici. Plus important encore, la quantification [ 35 S] GTPγS basée sur la filtration n'est pas également possible avec toutes les isoformes G α 20 , 21 . En général, cette méthode est limitée aux GPCR couplés G i / o comme MOR1 22 . Les récepteurs couplés G s et G q ont tendance à être moins sensibles. Ceci est probablement dû à la combinaison de l'abondance inférieure de G s / G q et de leur taux de change de nucleotides relativement plus lent, ce qui rend difficile la distinction entre la liaison réelle [ 35 S] GTPγS au-dessus du fond. Cette limitation a été abordée Et utilisant des techniques de capture d'anticorps G-protéines 20 . Certains groupes ont constaté que l'élimination du PIB de la réaction améliore le rapport signal sur bruit pour les récepteurs cousus G s -ou G q 23 . La deuxième limitation est la sensibilité à la membrane aux agonistes lipophiles ou aux tensioactifs. [ 35 S] Les tests de GTPγS nécessitent des complexes de protéines G-récepteurs fonctionnels, et l'addition de molécules lipophiles au système de réaction peut perturber la structure des membranes ou de ces complexes. Si cela est potentiellement préoccupant, il peut être avantageux de tester si le réactif d'intérêt perturbe la liaison [ 35 S] GTPγS dans un système déjà bien caractérisé, comme dans la stimulation MOR1 médiée par DAMGO. D'autres conditions à considérer comme optimisant comprennent le pH du tampon de liaison, les concentrations de Mg 2+ et de NaCl, la concentration de protéines et le temps d'incubation 23 ,Ef "> 24.
Ce protocole s'est concentré sur un GPCR bien caractérisé, le MOR1 et des médicaments bien caractérisés, DAMGO (agoniste) et naloxone (antagoniste), qui agissent sur MOR1. Cependant, l'un des avantages de cette technique est qu'il peut être utilisé pour caractériser des ligands inconnus comme agonistes, antagonistes ou agonistes inverse, selon la façon dont le ligand module la liaison GTP. Lors de la conception d'expériences, il est essentiel d'utiliser une gamme de concentrations du ligand d'intérêt et d'être conscient de la gamme des résultats: les agonistes provoqueront une augmentation de la liaison GTP par rapport à la base, les agonistes inverses entraîneront une diminution de la liaison GTP par rapport à La ligne de base et les antagonistes auront peu ou pas d'effet lorsqu'ils sont ajoutés isolément sur la liaison GTP basale.
En résumé, ce protocole décrit une technique pour effectuer le fractionnement subcellulaire, la collecte de préparations de membrane brute et l'étude de l'activation de GPCR en mesurant [ 35 S] GLiaison TPγS. Ces techniques peuvent être facilement adaptées à une variété de modèles de cellules et de tissus cellulaires pour étudier la pharmacologie d'une des familles de récepteurs les plus importantes.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrentiel.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention DA-000266 des instituts nationaux de la santé et la subvention T32 du programme de formation des scientifiques scientifiques (CV, NWZ et PCS). Les auteurs souhaiteraient également reconnaître somersault18: 24 (somersault1824.com) pour la Bibliothèque des Sciences et des Illustrations médicales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in a 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Cell culture 10 cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
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