Summary
Связывание гуанозинтрифосфата (GTP) является одним из самых ранних событий активации G-протеин-связанного рецептора (GPCR). Этот протокол описывает, как фармакологически характеризуют специфические взаимодействия GPCR-лиганда путем контроля связывания радиомеченного GTP-аналога, [ 35 S] гуанозин-5'-O- (3-тио) трифосфата ([ 35 S] GTPγS), в Ответ на лиганд, представляющий интерес.
Abstract
G-протеин-связанные рецепторы (GPCRs) представляют собой большое семейство трансмембранных рецепторов, которые играют критическую роль в нормальной клеточной физиологии и составляют основную фармакологическую цель для множественных показаний, включая аналгезию, регулирование артериального давления и лечение психических заболеваний. После связывания лиганда GPCR катализируют активацию внутриклеточных G-белков, стимулируя включение гуанозинтрифосфата (GTP). Активированные G-белки затем стимулируют сигнальные пути, которые вызывают клеточные реакции. Передача сигналов GPCR может контролироваться путем измерения включения радиоактивно меченной и негидролизуемой формы GTP, [ 35 S] гуанозин-5'-O- (3-тио) трифосфата ([ 35 S] GTPγS) в G-белки. В отличие от других методов, которые оценивают более длительные процессы сигнализации, связывание [ 35 S] GTPγS измеряет проксимальное событие в передаче сигналов GPCR и, что важно, может различать агонидыTs, антагонисты и обратные агонисты. В настоящем протоколе описывается чувствительный и специфический метод изучения передачи сигналов GPCR с использованием сырых мембранных препаратов архетипического GPCR, μ-опиоидного рецептора (MOR1). Хотя существуют альтернативные подходы к фракционированию клеток и тканей, многие из них являются дорогостоящими, утомительными и / или требуют нестандартного лабораторного оборудования. Настоящий метод обеспечивает простую процедуру, которая обогащает функциональные сырые мембраны. После выделения MOR1 определяли различные фармакологические свойства его агониста [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -энкефалина (DAMGO) и антагониста налоксона.
Introduction
G-протеин-связанные рецепторы (GPCRs) представляют собой большое семейство рецепторов клеточной поверхности, ответственных за замечательный массив физиологических процессов, включая анальгезию, обоняние и поведение 1 . GPCR действуют путем определения специфических внешних сигналов и впоследствии стимулируют внутриклеточную сигнализацию. Поэтому они отмечают ключевое соединение между внешней и внутренней средами ячейки. Из-за важной роли GPCRs в биологии они стали основными целями как для фундаментальных исследований , так и для открытия лекарств 2 , 3 .
В отличие от других семейств рецепторов, которые связывают дискретные лиганды, GPCR могут связывать очень разные типы молекул. В то время как один GPCR может взаимодействовать с пептидами, другой может воспринимать фотоны, малые молекулы или ионы 1 , 4 . Хотя их лиганды разнообразны, GPCRs объединены в своем общем архитектореUre и функции. Отдельные GPCR состоят из семи α-спиральных трансмембранных белков с внеклеточными аминоконцами и внутриклеточными карбоксильными терминалами 5 , 6 . GPCRs связаны с внутриклеточными G-белками-гетеротримерными белковыми комплексами, состоящими из α, β и γ-субъединиц, которые опосредуют различные сигнальные пути 7 . G-субъединица представляет собой гуанин-нуклеотидсвязывающий белок, который неактивен при связывании с гуанозиндифосфатом (ВВП) и активен при связывании с гуанозинтрифосфатом (ГТФ) 8,9 . Когда GPCR связывают свои лиганды, они подвергаются конформационному изменению, которое позволяет G α диссоциировать из G βγ , тем самым позволяя G α обменивать ВВП для GTP 7 . Сам рецептор фосфорилируется на своем карбоксильном конце различными серинами / треонамиIne kinases 10 , 11 и интернализуется для ослабления сигнализации 12 , 13 , 14 рецептора. Между тем активированный Gα-мономер и димер G βγ продолжают активировать различные сигнальные пути 7 . Существует несколько изоформ каждой субъединицы G-белка, и каждая изоформа нацелена на конкретные нисходящие пути и системы вторичных мессенджеров. Основные изоформы Gα включают G s , G q , G i / o и G 12-13 . Как правило, отдельные GPCR ассоциируются с конкретной изоформой G α , тем самым связывая внешний раздражитель с конкретным клеточным ответом 1 .
Характеристика взаимодействия GPCR-лиганда имеет решающее значение для понимания биологии рецептора. Поскольку обмен ВВП / ГТФ является одним из первыхNts, который следует за связыванием лиганда, мониторинг связывания GTP может измерять активацию или ингибирование GPCR. Анализ большего количества событий в нисходящем потоке в сигнале GPCR часто не является количественным или стехиометрическим, не может отличить полных агонистов от частичных и может потребовать дорогостоящих реагентов. Более того, увеличение связывания GTP с G α- белками является почти универсальным событием после активации GPCR, что означает, что измерение связывания GTP является широко применимым анализом для мониторинга активности большинства GPCR. Измерение связывания GTP является простым и быстрым подходом к мониторингу передачи сигналов GPCR в клетках, сверхэкспрессирующих рецептор, представляющий интерес, или в нативной ткани. В настоящем протоколе подробно описывается анализ функционального GTP-связывания с использованием архетипического GPCR, μ-опиоидного рецептора (MOR1), чтобы количественно определить активность агониста и антагониста при передаче сигналов GPCR.
В этом протоколе впервые описывается, как изолировать сырые мембраны от клеток, сверхэкспрессирующих MOR1. Обратите внимание, чтоЭтот протокол не ограничивается системами сверхэкспрессии и может быть применен ко многим источникам мембраны, включая нативную ткань или препараты, экспрессирующие множественные рецепторы и G-белки 15 . Затем в протоколе подробно описывается, как измерять связывание радиоактивного аналога GTP с этими мембранами в ответ на различные концентрации [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -энкефалина (ДАМГО) или налоксона, агониста и антагониста MOR1, соответственно. Аналог GTP [ 35 S] гуанозин-5'-O- (3-тио) трифосфат ([ 35 S] GTPγS) негидролизуется. Это свойство имеет решающее значение, так как G α- субъединицы проявляют внутреннюю активность GTPase 7 и устраняют меченый гамма-фосфат на гидролизуемом радиотеке GTP. Мембраны затем захватывают на стекловолоконные фильтры и промывают, после чего радиоактивно меченный ГТП определяют количественно с помощью жидкостного сцинтилляционного счета. Множественные фармакологические параметры могут быть получены для характеристикиE) взаимодействие рецептора с лигандом, включая полумаксимальный ответ (EC 50 ) и коэффициент Хилла (n H ) для агонистов и полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC 50 ) и константу равновесной диссоциации (K b ) для антагонистов 16 , 17 , 18 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Экспрессия рекомбинантного HA-MOR1 в культивируемых клетках
ПРИМЕЧАНИЕ. Следуйте всем протоколам клеточной культуры в стерильном ламинарном вытяжном шкафу.
- Стерилизуйте ламинарный вытяжной колпачок клеточной культуры с помощью 70% этанола и поддерживайте стерильную технику во всей культуре клеток.
- Подготавливают среду для культивирования клеток эмбриональной почки человека 293 (HEK293), полную модифицированную Дульбекко среду Игла (DMEM): DMEM, pH 7,4, дополненную 2 мМ L-глутамином, 1% пенициллином / стрептомицином и 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS ).
- Пластину 2,5 × 10 6 клеток HEK293 на 10 см планшета для культивирования ткани в 10 мл полного DMEM и инкубируют при 37 ° C и 5% CO 2 до достижения 70-80% слияния (O / N).
ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы собрать достаточное количество белка для полного эксперимента по связыванию с GTP, нанесите пластинки по меньшей мере на 3 × 10 см пластин. - Трансфицируйте клетки с помощью HA-MOR1 с использованием трансфекционного реагента по выбору и следуя указаниям производителя,; S руководящие принципы. Инкубируйте в течение 36-48 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ. КДНК MOR-1 человека (NCBI Reference Sequence: NM_000914.4) была щедрым подарком от Гаврила Пастернака и была клонирована в pCMV-HA.
2. Фракционирование клеток и сбор мембран
- Подготовьте следующие буферы для лизиса:
- Буфер 1: 10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES), pH 7,4; 1 мМ этиленгликоль-бис (β-аминоэтиловый эфир) -N, N, N ', N'-тетрауксусной кислоты (EGTA); 10% сахарозы; Коктейль ингибитора протеазы; И 1 мМ дитиотреитола (ДТТ). Добавьте DTT в день изоляции мембраны.
- Буфер 2: 10 мМ HEPES, pH 7,4; 1 мМ EGTA; 1 мМ MgCl 2 ; И 1 мМ DTT. Добавьте DTT в день изоляции мембраны.
- Удалите трансфицированные клетки из инкубатора (этап 1.4), аспирируйте среду и промойте клетки 5 мл ледяного забуференного фосфатом солевого раствора (PBS). Аспирируйте PBS и избыток жидкости изплита.
- Добавьте к ячейкам 600 мкл буфера 1. Используя скребок для клеток, удалите клетки с поверхности пластины и пипетируйте суспензию клеток в микроцентрифужную пробирку объемом 1,6 мл.
- Немедленно замораживайте микроцентрифужную пробирку в жидком азоте. После замораживания образцов оттаивают лизаты на льду или помещают их при -80 ° C для длительного хранения.
- Повторите шаги 2.3 и 2.4 со всеми пластинами клеток.
- Как только лизаты оттаивают, используйте одноимпульсный гомогенизатор для микротрубок, чтобы разбить клетки. Пульс гомогенизатора 3-5 раз в течение 10 с, помещая трубку обратно на лед в течение 30 с между импульсами.
- Собирают 20 мкл в виде цельной фракции клеток.
- Центрифугируйте оставшийся образец в течение 10 минут при 1000 xg и 4 ° C. Собирают супернатант и помещают в новую 1,6 мл микроцентрифужную пробирку на льду.
- Ресуспендируют гранулу в 100 мкл буфера 1 и регомогенизируют пестиком. Пульс гомоГенизатора 3-5 раз в течение 5 с, помещая трубку обратно на лед в течение 30 с между импульсами.
- Центрифугируйте образец второй раз в течение 10 минут при 1000 × g и 4 ° C. Объедините супернатант с супернатантом с шага 2.7.
ПРИМЕЧАНИЕ. Оставшийся осадок содержит ядерные и мембранные белки.
- Центрифугируйте образец второй раз в течение 10 минут при 1000 × g и 4 ° C. Объедините супернатант с супернатантом с шага 2.7.
- Центрифугируют объединенные супернатанты в течение 20 мин при 11000 xg и 4 ° C. Отделите супернатант (цитозольную фракцию) в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,6 мл.
- Ресуспендируют гранулу в 200 мкл буфера 2. Гомогенизируют гранулу, растирая ее 3-5 раз. Центрифугируйте образец в течение 20 минут при 21100 xg и 4 ° C. Аспирируйте супернатант. Ресуспендируют гранулу, содержащую сырую мембранную фракцию, в 50 мкл буфера 2.
- Немедленно перейдите к экспериментам по связыванию GTPγS (раздел 3) или замораживанию в жидком азоте и храньте при -80 ° C.
3. [ 35 S] GTPγS Binding ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте стандартный протокол радиохимической безопасности при работе с [ 35 S] GTPγS и при проведении экспериментов по связыванию [ 35 S] GTPγS. Всегда носите защитные перчатки и лабораторное покрытие. Проверьте упаковочный материал на наличие утечек или трещин. Утилизируйте отходы и избыточные реагенты в соответствии с институциональными протоколами.
- Подготовьте неполный буфер для переплета (IBB) путем смешивания 50 мМ HEPES, pH 7,4; 5 мМ MgCl2; 100 мМ NaCl; И 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в дистиллированной воде.
- Разбавьте запас [ 35 S] GTPγS до 50 нМ в 10 мМ Трис-HCl, pH 7,6 и 10 мМ DTT. Сделайте аликвоты по 500 мкл и сохраните их при -80 ° C. Используйте только свежую талую аликвоту непосредственно перед началом эксперимента. Оттепель аликвот на льду.
- Подготовить нерадиоомеченный GTPγS путем растворения 1 мг порошка GTPγS в 177,62 мкл чистой воды для концентрации запаса 10 мМ. Сделайте аликвоты по 10 мкл и сохраните их в-20oC.
- Подготовьте полный буфер связывания (CBB), добавив IBB, чтобы включить конечную концентрацию 1 мМ DTT, 0,1% (мас. / Об.) Бычьего сывороточного альбумина (BSA), 10 мкМ ВВП и 0,1 нМ [ 35 S] GTPγS.
ПРИМЕЧАНИЕ. CBB теперь содержит радиоактивно меченый GTP. При работе с радиоактивными растворами соблюдайте соответствующие меры предосторожности. - Оттереть мембранную фракцию со стадии 2.11 на льду.
- Определите концентрацию белка в мембранной фракции с помощью анализа белка Брэдфорда, используя спектрофотометр при 595 нм.
- Подготовьте серию разбавления стандартов белка BSA буфером 2 при конечных концентрациях 0, 250, 500, 750, 1500, 2500 и 5000 мкг / мл.
- Добавьте 2 мкл каждого стандарта или мембраны в 1 мл реактива Брэдфорда в кювете. Тщательно перемешайте путем встряхивания.
- Настройте спектрофотометр на длину волны 595 нм и заготовку с использованием кюветы с белком 0 мкг / мл.
- Подождите 5 мин и rКаждый из стандартов и каждый из образцов с длиной волны 595 нм.
- Определите поглощение стандартов по сравнению с концентрацией. Используя закон Бера-Ламберта (A = εcl, где ε = коэффициент экстинкции, l = длина кюветы и c = концентрация), вычислите концентрацию образцов мембраны.
- Разбавьте мембранные фракции до концентрации 100 мкг белка / мл в IBB.
ПРИМЕЧАНИЕ. Одна тарелка размером 10 см из клеток HEK293 обычно дает между 1 и 3 мг белка / мл. - Подготовьте следующие экспериментальные условия в отдельных 1,6 мл микроцентрифужных пробирках: серию разбавления лигандов, условие базальной активности для измерения базального связывания GTP и неспецифическое условие связывания для измерения неспецифического связывания GTP.
- Для серии разведения лигандов подготовьте серию разбавления представляющего интерес лиганда в конечном объеме 100 мкл CBB. Подготовьте серию лигандов в 2x желаемой конечной концентрациидополнения. Пространствуйте концентрации лигандов, чтобы адекватно покрыть диапазон ответов.
- Для анализа влияния DAMGO на связывание GTP через MOR1, подготовить DAMGO разведения 2 мМ, 200 мкМ, 20 мкМ, 2 мкМ, 200 нМ, 20 нМ, 2 нМ, 200 пМ, 20 пМ и 2 пМ в CBB (окончательный Объем: 100 мкл).
ПРИМЕЧАНИЕ. Например, если интересующий лиганд имеет ожидаемое значение ЕС 50, равное 10 мкМ, подготовьте разведения лигандов 200 нМ, 2 мкМ, 20 мкМ, 200 мкМ и 2 мМ. Эти пять условий охватывают широкий диапазон концентраций и составляют 2x желаемую для анализа концентрацию.
- Для анализа влияния DAMGO на связывание GTP через MOR1, подготовить DAMGO разведения 2 мМ, 200 мкМ, 20 мкМ, 2 мкМ, 200 нМ, 20 нМ, 2 нМ, 200 пМ, 20 пМ и 2 пМ в CBB (окончательный Объем: 100 мкл).
- При базовом связывании подготовьте только трубку с 100 мкл CBB.
- Для неспецифического связывания готовят пробирку с 99 мкл CBB, дополненную 1 мкл 2 мМ нерадио-меченного GTPγS.
- Для серии разведения лигандов подготовьте серию разбавления представляющего интерес лиганда в конечном объеме 100 мкл CBB. Подготовьте серию лигандов в 2x желаемой конечной концентрациидополнения. Пространствуйте концентрации лигандов, чтобы адекватно покрыть диапазон ответов.
- Добавьте 100 мкл раствора разбавленной мембраны (шаг 3.7) в каждое экспериментальное состояние.
- Инкубируйте мембраны с различными экспериментамиВ 1,6 мл микроцентрифужных пробирках в течение 30 мин при 25 ° С в термомиксере или на орбитальном шейкере.
4. Мембранная фильтрация
- Подготовьте промывочный буфер, объединив 50 мМ Трис-HCl, pH 7,4; 5 мМ MgCl 2 ; И 50 мМ NaCl в дистиллированной воде.
- Предварительно смойте фильтры из стекловолокна в воде в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ. Фильтры имеют размер пор 1 мкм, диаметр 2,1 см и толщину 675 мкм. - Удалите образцы из термомиксера или орбитального шейкера (шаг 3.10). Кратко прокрутите образцы в течение 5 с для сбора каждого образца на дне трубки.
- Снимите крышку вакуумного фильтрационного устройства. Положите предварительно очищенные фильтры на вакуумные отверстия устройства. Снова закрепите крышку устройства, чтобы сформировать вакуумное уплотнение. Включите вакуум.
- Пипеткой 195 мкл каждого экспериментального условия 200 мкл на фильтры для сведения к минимуму погрешности от адсорбции до стенок трубки и / или пипеткитин.
- Промывайте фильтры три раза 1 мл ледяного промывочного буфера.
5. Сцинтилляционный подсчет жидкости
- Поместите 5 мл сцинтилляционных счетных флаконов в счетную стойку. Добавьте 5 мл сцинтилляционной жидкости в каждый флакон.
- Выключите вакуум (шаг 4.4). Снимите крышку вакуумного фильтрационного устройства. Используя пинцет, возьмите фильтры из вакуумных отверстий фильтрационного аппарата и опустите каждый фильтр в отдельный 5-миллилитровый сцинтилляционный флакон.
- Подготовьте один флакон с 195 мкл CBB для определения максимального сигнала.
- Надежно закройте каждый флакон. Инкубируйте флаконы на орбитальном шейкере при 25 ° C в течение 10 минут.
- Включите сцинтилляционный счетчик. Запрограммируйте сцинтилляционный счетчик для измерения изотопного излучения 35 S в течение 5 минут на образец с использованием стандартной связанной сцинтилляционной программы.
- Нажмите «Старт», чтобы принять счет.
- Когда подсчет выполняется, удалите подсчитанный флаконВ качестве опасных отходов.
6. Анализ данных
- Введите данные в программное обеспечение для статистики и анализа.
- Вычтите неспецифическое связывание с каждого из других измерений, чтобы определить конкретное связывание.
ПРИМЕЧАНИЕ. Степень неспецифического связывания определяется образцом, инкубированным с не радиоактивно меченым GTPγS (шаг 3.8.3). - Откройте программное обеспечение статистики и анализа и выберите запись набора XY.
- Введите конкретные данные привязки из экспериментов [ 35 S] GTPγS-привязки в таблицу данных в статистическом и аналитическом программном обеспечении. Введите концентрацию агониста в виде молярных концентраций в колонке «Х». Введите соответствующие значения 35 S как значения «Y».
- Вычтите неспецифическое связывание с каждого из других измерений, чтобы определить конкретное связывание.
- Преобразовать данные.
- Преобразуйте значения X в соответствующий логарифм, нажав «Анализ». Выберите «Преобразовать» из встроенногоN анализов.
- В диалоговом окне «Трансформация» выберите «Преобразовать значения X с помощью» и выберите функцию «X = log (X)». Выберите, чтобы создать новый график результатов.
- Нажмите «ОК».
- Нормализовать значения Y.
- При отображении преобразованных результатов нажмите «Анализ». Выберите «Нормализовать» из встроенных анализов.
- В диалоговом окне «Нормализовать» выберите переключатель, чтобы определить 0% как «наименьшее значение в каждом наборе данных» и 100% как «наибольшее значение в каждом наборе данных». Выберите поле для представления результатов в процентах. Выберите поле, чтобы создать новый график результатов.
- Нажмите «ОК».
- Настройте кривые нелинейной регрессии на построенные данные. Выполните нелинейный регрессионный анализ.
- При отображении нормализованных результатов нажмите «Анализ». Из встроенных анализов, Выберите «Нелинейная регрессия (подгонка кривой)».
- При исследовании агониста в диалоговом окне выберите «log (агонист) и нормализованный ответ - наклон переменной».
- Если исследовать антагонист, «выберите лог (антагонист) против нормализованного ответа - переменный уклон» из диалогового окна.
- Нажмите «ОК».
- Просмотрите график и результаты, чтобы убедиться, что подгонка и данные находятся в разумном согласии. Убедитесь, что регрессия соответствует общей схеме построенных данных и что остатки не настолько велики, что они дают кривую зависимости доза-эффект.
ПРИМЕЧАНИЕ. Программное обеспечение суммирует результаты нелинейной регрессии и детализирует концентрацию, которая вызывает полумаксимальный отклик (EC 50 ), коэффициент Хилла (n H ) и полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC 50 ). - Выделяют потенцию параметра агониста / антагониста.
- Выведите эквивалент агонистаКонстанты диссоциации ilbrium (K b ) из любого из следующих экспериментов 16 , 17 , 18
- Оцените смещение доза-ответ агониста в конкуренции с фиксированной концентрацией антагониста. Здесь EC 50 '= EC 50 (1 + [антагонист] / антагонист Kb ), где EC 50 ' является правым сдвигом EC 50 .
- Оценить связывание [ 35 S] GTPγS с различными концентрациями антагониста в конкуренции с фиксированной концентрацией агониста. Здесь K b = IC 50 / (2 + ([агонист / агонист EC 50 ) n ) 1 / n - 1, где n - коэффициент Хилла агониста.
- Выведите эквивалент агонистаКонстанты диссоциации ilbrium (K b ) из любого из следующих экспериментов 16 , 17 , 18
- В зависимости от изменчивости данных повторите эксперимент (шаги 3.8-5.6) для каждого лиганда примерно в 3-5 раз и усредните результаты, используя статистическое и аналитическое программное обеспечениенаходятся.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Фракционирование клеток можно использовать для выделения и обогащения мембранно-ассоциированных белков из цитозольных и ядерных белков. Рисунок 1 представляет собой вестерн-блоттинг, демонстрирующий содержание трех первичных фракций, которые могут быть собраны во время процесса субклеточного фракционирования. В частности, на рисунке 1 показано, что фракционирование чисто разделяет мембранные белки ( т.е. Na + / K + АТФазу, дисульфид-изомеразу белка (PDI) и HA-MOR1) из гистона H2B и глицеральдегида 3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), ядерных белков и цитозольных белков, соответственно. Кроме того, на рисунке 1 показано обогащение белков (дорожка 1 по сравнению с дорожкой 4) в их соответствующих субклеточных фракциях в результате фракционирования. Представительная окраска Понцо демонстрирует равную загрузку белка в каждой фракции. Важно отметить, что этот фракциПротокол не различает различные клеточные мембраны. PDI обычно локализуется в эндоплазматическом ретикулуме (ER), тогда как Na + / K + АТФаза преимущественно находится на плазматической мембране. Однако оба белка присутствуют в конечной фракции сырой мембраны ( фиг. 1 , дорожка 4). Кроме того, хотя этот протокол надежно отделяет ядерные белки от цитозольной и конечной мембранной фракции ( рис. 1 , дорожки 2-4), фракция, обогащенная ядерными белками, содержит некоторые мембранные белки ( рис. 1 , дорожка 2), возможно, из ER.
Могут быть получены множественные фармакологические параметры для характеристики взаимодействия GPCR-лиганда с помощью GTP-связывающих экспериментов ( таблица 1 ). Например, полумаксимальный ответ (EC 50 ) и коэффициент Хилла (n H ) агониста могут быть получены путем мониторинга связывания GTP вОтвет на различные дозы агониста. Фиг. 3А демонстрирует связывание GTP, чувствительное к дозам, к MOR1 после лечения DAMGO. Когда данные подходят к четырехпараметрической нелинейной регрессии, подгонка описывает взаимодействие рецептор-лиганд с EC 50 185 ± 23 нМ и коэффициент Хилла 0,46 ± 0,06. Неглубокая кривая GTP-связывания, наблюдаемая после лечения DAMGO, указывает на отрицательную кооперативность между DAMGO и MOR1. Этот метод также может идентифицировать и описывать фармакологию антагониста. Как показано на фиг.3А и В , налоксон является антагонистом MOR1. Эффективность агониста (K b ) налоксона 97 ± 20 нМ определялась путем изменения концентрации налоксона в конкуренции с фиксированной концентрацией ДАМГО ( рис. 3А ). Налоксон показал коэффициент Хилла 0.88 ± 0.06, предполагая независимое связывание между налоксоном и MOR1. Если переменная acНеизвестного лиганда, этот анализ может различать агонист, антагонист и обратный агонист. Если лиганд является агонистом, было бы увеличение связывания GTP, как на рисунке 3A , после применения DAMGO. Если лиганд является обратным агонистом, было бы уменьшено связывание GTP по сравнению с базальным связыванием. Если лиганд является антагонистом, не будет никакого эффекта на лечение только лигандом. Если применять одновременно с агонистом, антагонист будет препятствовать способности агониста стимулировать связывание GTP. На фиг. 3А показана антагонистическая активность налоксона против агониста DAMGO.
Рисунок 1: Клеточная фракфикация разделяет мембранно-ассоциированные, ядерные и цитозольные белки. ( Вверху ) Переулок 1 представляетБелка, присутствующего во всей клетке. Дорожка 2 содержит ядерные и мембранно-ассоциированные белки, разделенные на первых стадиях центрифугирования. Дорожка 3 представляет собой цитозольную фракцию, разделяемую через 20 минут центрифугирования при 11000 × g. Дорожка 4 содержит сырую мембранную фракцию, подходящую для экспериментов [ 35 S] GTPγS-связывания. ( Снизу ) окраска Понсо западной мембраны демонстрирует загрузку белка для каждой клеточной фракции. Для иммуноблоттинга применяли следующие антитела: мышь против Na + / K + -АТФазы (1: 1000), мышь против GAPDH (1: 5000), мышь против H2B (1: 2500), кроличьи анти-PDI (1 : 1000), и крыса против HA (1: 2000). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
фигура 2: Блок-схема, описывающая процедуру фракционирования и [ 35 S] GTPγS-связывания. Во-первых, трансфекция клеток, чтобы выразить интересующий GPCR. Через 48 ч собирают и фракционируют клетки для выделения рецептора (красного) и связанных с ним G-белков (зеленый = G α , фиолетовый = G β и оранжевый = G γ ). Для проведения экспериментов с использованием GTP-связывания добавьте [ 35 S] GTPγS и инкубируйте мембраны с представляющим интерес лигандом. Чтобы измерить активность G-белка, свяжите мембраны с фильтром, чтобы смыть любые несвязанные радиохимические вещества, а затем количественно оценить связанный [ 35 S] GTPγS с помощью жидкостного сцинтилляционного счета. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Агонизм aАнтагонизм при μ-опиоидных рецепторах Определяется связыванием [ 35 S] GTPγS. ( A ) [ 35 S] GTPγS доза DAGGO (синий) или налоксон в конкуренции с 2,5 мкМ DAMGO (зеленый). Связывание [ 35 S] GTPγS нормализовалось до максимальной стимуляции в каждом эксперименте и выражалось в виде процента. Показанные точки являются средними трехкратных определений и выражаются как средний ± SEM ( B ) антагонизм DAMGO-стимулированного [ 35 S] GTPγS Связывание налоксоном. [ 35 S] GTPγS Связывание определяли количественно после добавления только налоксона (100 мкМ), только DAMGO (10 мкМ) или ДАМГО (10 мкМ) в конкуренции с налоксоном (100 мкМ). Результаты выражаются как среднее ± SEM трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмитеRe, чтобы просмотреть большую версию этого рисунка.
| лиганд | EC 50 или IC 50 (нМ) | N H | K b (nM) |
| DAMGO | 185 ± 23 | 0,46 ± 0,06 | |
| Налоксон | 420 ± 87 | 0,88 ± 0,06 | 97 ± 20 |
Таблица 1: Фармакологические параметры активности ДАМГО и налоксона у μ-опиоидных рецепторов. Полумаксимальный ответ (EC 50 ) и коэффициент Хилла (n H ) для DAMGO были получены из связывания [ 35 S] GTPγS в ответ на различные дозы DAMGO. Полумаксимальная ингибирующая концентрация(IC 50 ) и константа равновесной диссоциации (K b ) для налоксона определяли по эффекту конкуренции между налоксоном и 2,5 мкМ DAMGO при связывании [ 35 S] GTPγS. Результаты выражаются как среднее ± SEM трех независимых экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем протоколе описаны два отдельных, но взаимодополняющих метода: простой подход к фракционированию клеток и тканей в широкие, но четкие отсеки и средство для исследования передачи сигналов GPCR путем измерения связывания [ 35 S] GTPγS.
Эффективное клеточное фракционирование имеет широкий спектр применений, начиная от экстракции и обогащения белков, до оценки субклеточной локализации белков, до изучения рецепторной фармакологии. Хотя существуют альтернативные подходы к фракционированию клеток и тканей, представленный здесь протокол сравнительно дешевле, быстрее и проще. Однако, в отличие от более установленных методов, этот метод не способен очистить от связанных с мембраной плазменных мембран из других мембранных компартментов, таких как эндосомы или ER. Следует также отметить, что, хотя в вышеупомянутом протоколе используется переходная система сверхэкспрессии для создания клеточных мембран, содержащих GPCRИнтерес, этот протокол совместим со стабильными системами сверхэкспрессии, а также с животными или тканями человека 19 .
Подготовка проб имеет решающее значение для максимизации выхода фракции и ее чистоты. Особенно важно обеспечить полную гомогенизацию и минимизировать время перехода между стадиями центрифугирования. Использование гранулированного гомогенизатора / пестика для полного разрушения клеточной мембраны значительно увеличивает выход сырой мембраны в конечной фракции клеток. Если выход мембраны слишком низок, двумя простейшими растворами было бы увеличение первоначальной культуры клеток и / или гомогенизация клеточного осадка еще несколько раз. Если отдельные фракции показывают высокую степень примеси, уменьшите время перехода между центрифугированием и разделением. Не позволяйте образцам сидеть после центрифугирования, так как белки могут диффундировать в образец и уменьшать чистоту фракции.
Фильтрационная [ 35 S] GTPγS-связывание является быстрым и количественным методом для измерения активации G-белков с использованием соответствующего рецептора. Измерение связывания GTP позволяет проводить более количественное измерение активности GPCR, чем это обычно возможно при мониторинге последующих процессов. Однако существует два критических ограничения для метода, описанного здесь. Самое главное, что количественное определение на основе фильтрации [ 35 S] GTPγS нецелесообразно для всех изоформ G α 20 , 21 . В общем, этот метод ограничивается G i / o -соединенными GPCR, такими как MOR1 22 . G s - и G q - присоединяемые рецепторы имеют тенденцию быть менее чувствительными. Это, вероятно, связано с сочетанием более низкого содержания G s / G q и относительно медленного обменного курса нуклеотидов, что затрудняет отличное связывание реального [ 35 S] GTPγS над фоном. Это ограничение было адресовано els При использовании методов захвата антител G-белка 20 . Некоторые группы обнаружили, что устранение ВВП от реакции улучшает отношение сигнал / шум для G s - или G q - присоединенных рецепторов 23 . Второе ограничение - чувствительность мембраны к липофильным агонистам или поверхностно-активным веществам. [ 35 S] GTPγS требуют функциональных рецептор-G-белковых комплексов, и добавление липофильных молекул в реакционную систему может нарушить структуру мембран или этих комплексов. Если это является потенциальной проблемой, может оказаться целесообразным проверить, вызывает ли заинтересованный реагент связывание [ 35 S] GTPγS в уже хорошо охарактеризованной системе, например, в стимуляции MOR1, опосредованной ДАМГО. Другие условия для оптимизации включают в себя рН связующего буфера, концентрации Mg 2+ и NaCl, концентрацию белка и время инкубации 23 ,Ef "> 24.
Этот протокол был посвящен хорошо охарактеризованному GPCR, MOR1 и хорошо охарактеризованным препаратам, DAMGO (агонист) и налоксону (антагонисту), которые действуют на MOR1. Однако одним из преимуществ этого метода является то, что его можно использовать для характеристики неизвестных лигандов в качестве агонистов, антагонистов или обратных агонистов, в зависимости от того, как лиганд модулирует связывание GTP. При разработке экспериментов крайне важно использовать диапазон концентраций интересующего лиганда и учитывать диапазон исходов: агонисты вызовут увеличение связывания GTP по сравнению с исходным уровнем, обратные агонисты вызовут снижение связывания GTP по сравнению с Исходный уровень и антагонисты будут практически не иметь эффекта при добавлении в изоляции при привязке базовой линии GTP.
Таким образом, этот протокол описывает способ проведения субклеточного фракционирования, сбор сырых мембранных препаратов и исследование активации GPCR путем измерения [ 35 S] GСвязывание TPγS. Эти методы могут быть легко адаптированы к различным культурам клеток и тканевым моделям для изучения фармакологии одного из наиболее важных семейств рецепторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют никаких конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения грантом DA-000266 и грантом программы T32 для медицинских ученых (CV, NWZ и PCS). Авторы также хотели бы признать somersault18: 24 (somersault1824.com) для Библиотеки наук и медицинских иллюстраций.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in a 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Cell culture 10 cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), New York, NY. 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), New York, NY. 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), New York, NY. 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), New York, NY. 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , Springer. 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
