Summary
Guanosintrifosfat (GTP) binding er en av de tidligste hendelsene i G-protein-koblet reseptor (GPCR) aktivering. Denne protokollen beskriver hvordan man farmakologisk karakteriserer spesifikke GPCR-ligand-interaksjoner ved å overvåke bindingen av den radiomerkede GTP-analogen, [35S] guanosin-5'-O- (3-tio) trifosfat ([35S] GTPγS), i Svar på en ligand av interesse.
Abstract
G-proteinkopplede reseptorer ( GPCRs ) er en stor familie av transmembrane reseptorer som spiller kritiske roller i normal cellulær fysiologi og utgjør et stort farmakologisk mål for flere indikasjoner, inkludert analgesi, blodtrykksregulering og behandling av psykiatrisk sykdom. Ved ligandbinding katalyserer GPCRs aktiveringen av intracellulære G-proteiner ved å stimulere inkorporering av guanosintrifosfat (GTP). Aktiverte G-proteiner stimulerer deretter signalveier som fremkaller cellulære responser. GPCR-signalering kan overvåkes ved å måle inkorporeringen av en radiomerket og ikke-hydrolyserbar form av GTP, [35S] guanosin-5'-0- (3-tiotrifosfat) ([35S] GTPγS) i G-proteiner. I motsetning til andre metoder som vurderer flere nedstrøms signalprosesser, måler [35S] GTPγS-binding en proksimal hendelse i GPCR-signalering og, viktigere, kan skille agonisTs, antagonister og inverse agonister. Den foreliggende protokoll beskriver en sensitiv og spesifikk metode for å studere GPCR-signalering ved bruk av råmembranpreparater av en arketypisk GPCR, μ-opioidreseptoren (MOR1). Selv om alternative tilnærminger til fraksjonering av celler og vev eksisterer, er mange kostnadseffektive, kjedelige og / eller krever ikke-standard laboratorieutstyr. Den foreliggende fremgangsmåte gir en enkel prosedyre som beriker funksjonelle råmembraner. Etter isolering av MOR1 ble forskjellige farmakologiske egenskaper av dets agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefalin (DAMGO) og antagonist, nalokson, bestemt.
Introduction
G-proteinkopplede reseptorer (GPCRs) er en stor familie av celleoverflate-reseptorer som er ansvarlige for et bemerkelsesverdig utvalg av fysiologiske prosesser, inkludert analgesi, olfaction og adferd 1 . GPCR'er virker ved å detektere spesifikke eksterne signaler og deretter stimulere intracellulær signalering. De markerer derfor en nøkkelforbindelse mellom de eksterne og interne omgivelsene til en celle. På grunn av den kritiske rollen som GPCR spiller i biologi, har de blitt store mål for både grunnforskning og narkotikaforskning 2 , 3 .
I motsetning til andre reseptorfamilier som binder diskrete ligander, kan GPCRs binde svært forskjellige typer molekyler. Mens en GPCR kan interagere med peptider, kan en annen fornemme fotoner, små molekyler eller ioner 1 , 4 . Mens deres ligander er forskjellige, er GPCRer samlet i deres overordnede arkitektUre og funksjon. Individuelle GPCRs består av syv a-spiralformede transmembranproteiner med ekstracellulære aminoterminaler og intracellulære karboxylterminaler 5 , 6 . GPCRer er koblet til intracellulære G-proteiner-heterotrimeriske proteinkomplekser sammensatt av a-, p- og y-underenheter-som medierer mangfoldige signalveier 7 . G α -underenheten er et guaninukleotidbindende protein som er inaktivt når det er bundet til guanosindifosfat (BNP) og aktivt når det er bundet til guanosintrifosfat (GTP) 8 , 9 . Når GPCRer binder deres ligander, gjennomgår de en konformasjonsendring som tillater G α å dissociere fra G β , og derved tillater G α å utveksle BNP for GTP 7 . Reseptoren i seg selv er fosforylert ved sin karboksalterminale av forskjellige serin / treonIne kinaser 10 , 11 og internalisert for å dempe mottakersignalering 12 , 13 , 14 . I mellomtiden fortsetter den aktiverte G a- monomeren og G- β- dimeren for å aktivere forskjellige signalveier 7 . Det er flere isoformer av hver G-protein-underenhet, og hver isoform målretter bestemte nedstrømsbaner og sekundære meldingssystemer. De store G a- isoformene inkluderer G s , G q , G i / o og G 12-13 . Typisk forbinder individuelle GPCR'er med en bestemt G a- isoform, hvorved en ekstern stimulus kobles til en bestemt cellulær respons 1 .
Karakterisering av en GPCR-ligand-interaksjon er kritisk for å forstå biologien til reseptoren. Som BNP / GTP-utveksling er en av de tidligste på kveldenNts som følger ligandbindende, overvåking av GTP-binding kan måle GPCR-aktivering eller -inhibering. Å analysere flere nedstrøms hendelser i GPCR-signalering er ofte ikke så kvantitativ eller støkiometrisk, kan ikke skille full agonister fra delvise, og kan kreve dyre reagenser. Videre er økt GTP-binding til G α -proteiner en nesten universell hendelse etter GPCR-aktivering, noe som betyr at måling av GTP-binding er et bredt anvendbart assay for overvåking av aktiviteten til de fleste GPCRer. Måling av GTP-binding er en enkel og rask tilnærming til å overvåke GPCR-signalering i celler som overuttrykker reseptor av interesse eller i naturlig vev. Den foreliggende protokoll beskriver en funksjonell GTP-bindingsanalyse ved bruk av en arketypisk GPCR, μ-opioidreseptoren (MOR1), for kvantitativt å bestemme aktiviteten til en agonist og antagonist på GPCR-signalering.
Denne protokollen skisserer først hvordan man isolerer råmembraner fra celler som overuttrykker MOR1. Merk degDenne protokollen er ikke begrenset til overekspresjons-systemer og kan påføres mange kilder til membran, inkludert nativt vev eller preparater som uttrykker flere reseptorer og G-proteiner 15 . Protokollen beskriver deretter hvordan man måler bindingen av en radioaktiv GTP-analog til disse membranene som respons på varierende konsentrasjoner av [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefalin (DAMGO) eller nalokson, en MOR1-agonist og antagonist, henholdsvis. GTP-analogen, [35S] guanosin-5'-0- (3-tio) trifosfat ([35S] GTPγS) er ikke hydrolyserbar. Denne egenskapen er kritisk fordi G a- underenheter utviser egen GTPase-aktivitet 7 og vil eliminere det merkede gammafosfat på en hydrolyserbar GTP-radiokjemisk. Membraner blir deretter fanget på glassfiberfiltre og vasket, hvorpå den radiomerkede GTP kvantiseres ved væskescintillasjonstelling. Flere farmakologiske parametere kan utledes av karakteristikkE-reseptor-ligand-interaksjonen, inkludert halv-maksimal respons (EC 50 ) og Hill-koeffisienten (n H ) for agonister og den halv maksimale inhibitoriske konsentrasjonen (IC 50 ) og likevektsdissociasjonskonstanten (K b ) for antagonister 16 , 17 , 18 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekspresjon av rekombinant HA-MOR1 i dyrkede celler
MERK: Følg alle cellekulturprotokollene i en steril laminarstrømshett.
- Steriliser cellekulturens laminære strømnings hette med 70% etanol og opprettholde steril teknikk gjennom cellekulturen.
- Forbered menneskelige embryonale nyreceller 293 (HEK293) cellekulturmedium, komplett Dulbecco-modifisert Eagle Medium (DMEM): DMEM, pH 7,4, tilsatt 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS ).
- Plate 2,5 x 10 6 HEK293 celler på en 10 cm vevskulturplate i 10 ml fullstendig DMEM og inkuber ved 37 ° C og 5% CO 2 til 70-80% konfluens er nådd (O / N).
MERK: For å samle nok protein til et komplett GTP-bindingsforsøk, plater minst 3 x 10 cm platene av celler. - Transfekter cellene med HA-MOR1 ved å bruke et transfeksjonsreagens av valg og ved å følge produsentens '; S retningslinjer. Inkubér i 36-48 timer.
MERK: Human MOR-1 cDNA (NCBI Reference Sequence: NM_000914.4) var en generøs gave fra Gavril Pasternak og ble klonet inn i pCMV-HA.
2. Cell Fraksjonering og Membran Collection
- Klargjør følgende lysisbuffere:
- Buffer 1: 10 mM 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES), pH 7,4; 1 mM etylenglykol-bis (P-aminoetyleter) -N, N, N ', N'-tetraeddiksyre (EGTA); 10% sukrose; Protease inhibitor cocktail; Og 1 mM ditiotreitol (DTT). Legg til DTT frisk på dagen for membranisolasjon.
- Buffer 2: 10 mM HEPES, pH 7,4; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2; Og 1 mM DTT. Legg til DTT frisk på dagen for membranisolasjon.
- Fjern de transfekterte cellene fra inkubatoren (trinn 1.4), aspirere mediet og skyll cellene med 5 ml iskald fosfatbuffert saltvann (PBS). Aspirer PBS og overflødig væske frafatet.
- Tilsett 600 μl buffer 1 til cellene. Bruk en celleskraper, løsne cellene fra plateoverflaten og pipett cellesuspensjonen i et 1,6 ml mikrocentrifugerør.
- Fjern øyeblikkelig mikrocentrifugerøret i flytende nitrogen. Når prøvene er frosset, tine lysatene på is eller plasser dem ved -80 ° C for langtidsoppbevaring.
- Gjenta trinn 2.3 og 2.4 med alle platene på celler.
- Når lysatene har tint, bruk en enkeltpuls mikro-rørhomogenisator for å bryte opp cellene. Pulse homogenisatoren 3-5 ganger i 10 s, plasser røret tilbake på is i 30 s mellom pulser.
- Samle 20 μL som hele cellefraksjon.
- Sentrifuger gjenværende prøve i 10 minutter ved 1000 xg og 4 ° C. Samle supernatanten og plasser i et nytt 1,6 ml mikrocentrifugerør på is.
- Resuspender pelleten i 100 μl buffer 1 og rehomogenisere med en pestle. Puls homoGenizer 3-5 ganger i 5 s, plasserer røret tilbake på is i 30 s mellom pulser.
- Sentrifuger prøven en gang i 10 minutter ved 1000 xg og 4 ° C. Kombiner supernatanten med supernatanten fra trinn 2.7.
MERK: Den gjenværende pellet inneholder kjernefysiske og membranproteiner.
- Sentrifuger prøven en gang i 10 minutter ved 1000 xg og 4 ° C. Kombiner supernatanten med supernatanten fra trinn 2.7.
- Sentrifuger de kombinerte supernatantene i 20 minutter ved 11.000 xg og 4 ° C. Separat supernatanten (den cytosoliske fraksjonen) inn i et nytt 1,6 ml mikrocentrifugerør.
- Resuspender pelleten i 200 μl buffer 2. Homogeniser pelleten ved å triturere den 3-5 ganger. Sentrifuger prøven i 20 minutter ved 21 100 xg og 4 ° C. Aspirer supernatanten. Resuspender pelleten som inneholder råmembranfraksjonen i 50 μl buffer 2.
- Gå straks videre til GTPγS-bindingsforsøkene (avsnitt 3) eller snap-fryse i flytende nitrogen og lagre ved -80 ° C.
3. [ 35 S] GTPγS Binding MERK: Bruk standard radiokjemisk sikkerhetsprotokoll når du håndterer [ 35 S] GTPγS og når du utfører [ 35 S] GTPγS bindingsforsøk. Bruk vernehansker og laboratoriejakke til enhver tid. Kontroller emballasjematerialet for lekkasjer eller sprekker. Kast avfall og overflødig reagenser i henhold til institusjonelle protokoller.
- Klargjør ufullstendig bindingsbuffer (IBB) ved å blande 50 mM HEPES, pH 7,4; 5 mM MgCl2; 100 mM NaCl; Og 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i destillert vann.
- Fortynn lager [ 35 S] GTPγS til 50 nM i 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 og 10 mM DTT. Lag 500 μl alikvoter og lagre dem ved -80 ° C. Bruk bare en nyopptunnet alikvot umiddelbart før du begynner eksperimentet. Tine alikvoter på is.
- Forbered ikkeradio-merket GTPγS ved å oppløse 1 mg GTPγS pulver i 177,62 μL rent vann for en bestandskonsentrasjon på 10 mM. Lag 10 μl alikvoter og lagre dem på-20 ° C.
- Klargjør fullstendig bindingsbuffer (CBB) ved å supplere IBB for å inkludere en sluttkonsentrasjon på 1 mM DTT, 0,1% (vekt / vol) bovint serumalbumin (BSA), 10 μM BNP og 0,1 nM [35S] GTPγS.
MERK: CBB inneholder nå radiomerket GTP. Ta passende forholdsregler når du arbeider med radioaktive løsninger. - Tør membranfraksjonen fra trinn 2.11 på is.
- Kvantifiser proteinkonsentrasjonen av membranfraksjonen via et Bradford-proteinassay ved bruk av et spektrofotometer ved 595 nm.
- Forbered en fortynningsserie med BSA-proteinstandarder med buffer 2, ved endelige konsentrasjoner på 0, 250, 500, 750, 1500, 2500 og 5000 μg / ml.
- Tilsett 2 μL av hver standard eller membran til 1 mL Bradford reagens i en kuvette. Bland grundig ved vortexing.
- Juster spektrofotometeret til en bølgelengde på 595 nm og blankt ved bruk av kuvetten med 0 μg / ml protein.
- Vent 5 min og rEad hver av standardene og hver av prøvene ved en 595 nm bølgelengde.
- Plot absorbansen av standardene i forhold til konsentrasjonen. Ved bruk av øl-Lambert-loven (A = εcl, hvor ε = ekstinksjonskoeffisient, l = kyvettens lengde og c = konsentrasjon), beregnes konsentrasjonen av membranprøver.
- Fortynn membranfraksjonene til en konsentrasjon på 100 ug protein / ml i IBB.
MERK: En 10 cm tallerken med HEK293-celler gir vanligvis mellom 1 og 3 mg protein / ml. - Forbered følgende eksperimentelle forhold i individuelle 1,6 ml mikrocentrifugerør: en ligandfortynningsserie, en basal aktivitetstilstand for å måle basal GTP-binding og en ikke-spesifikk bindende tilstand for å måle ikke-spesifikk GTP-binding.
- For ligandfortynningsserien, lag en fortynningsserie av liganden av interesse i et sluttvolum på 100 ul CBB. Forbered ligandserien ved 2x ønsket sluttkoncentrasjonons. Plasser ligandkonsentrasjonene til tilstrekkelig dekning av en rekke responser.
- For å analysere effekten av DAMGO på GTP-binding via MOR1, fremstill DAMGO-fortynninger på 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM og 2 pM i CBB Volum: 100 μl).
MERK: For eksempel, hvis liganden av interesse har en forventet EC50-verdi på 10 μM, fremstiller ligandfortynninger av 200 nM, 2 μM, 20 μM, 200 μM og 2 mM. Disse fem forholdene dekker et bredt spekter av konsentrasjoner og er 2 x konsentrasjonen som er ønsket for analysen.
- For å analysere effekten av DAMGO på GTP-binding via MOR1, fremstill DAMGO-fortynninger på 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM og 2 pM i CBB Volum: 100 μl).
- For basal binding, klargjør et rør med 100 μL CBB bare.
- For ikke-spesifikk binding, klargjør et rør med 99 μl CBB supplert med 1 μL 2 mM nonradio-merket GTPγS.
- For ligandfortynningsserien, lag en fortynningsserie av liganden av interesse i et sluttvolum på 100 ul CBB. Forbered ligandserien ved 2x ønsket sluttkoncentrasjonons. Plasser ligandkonsentrasjonene til tilstrekkelig dekning av en rekke responser.
- Tilsett 100 μl av den fortynnede membranoppløsningen (trinn 3.7) til hver eksperimentell tilstand.
- Inkuber membranene med de forskjellige eksperimenterEntal betingelser i 1,6 ml mikrocentrifugerør i 30 minutter ved 25 ° C i en termomixer eller på en orbital shaker.
4. Membranfiltrering
- Klargjør vaskebuffer ved å kombinere 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 5 mM MgCl2; Og 50 mM NaCl i destillert vann.
- Presoak glassfiberfiltrene i vann i 10 minutter.
MERK: Filtre har en porestørrelse på 1 μm, en diameter på 2,1 cm og en tykkelse på 675 μm. - Fjern prøvene fra termomixeren eller den orbitale shakeren (trinn 3.10). Puls-snurre prøvene i 5 sekunder for å samle hver prøve på bunnen av røret.
- Fjern lokket til vakuumfiltreringsapparatet. Legg de forhåndsbehandlede filtre på apparatets vakuumporter. Fest apparatlokket igjen for å danne en vakuumtetning. Slå på vakuumet.
- Pipetter 195 μL av hver 200 μL eksperimentell tilstand på filtre for å minimere feil fra adsorpsjon til rørets vegger og / eller fra pipettenTing.
- Vask filtre tre ganger med 1 ml iskall vaskebuffer.
5. Flytende scintillasjonstelling
- Plasser 5 ml scintillasjons tellende hetteglass i en tellehylle. Tilsett 5 ml scintillasjonsvæske til hvert hetteglass.
- Slå av vakuumet (trinn 4.4). Fjern lokket til vakuumfiltreringsapparatet. Ved hjelp av pincett, plukk filtrene fra vakuumportene til filtreringsapparatet og slipp hvert filter i et individuelt 5 ml scintillasjonshetteglass.
- Lag ett hetteglass med 195 μL CBB for å bestemme det maksimale signalet.
- Hett hvert hetteglass sikkert. Inkuber hetteglassene på en orbital shaker ved 25 ° C i 10 minutter.
- Slå på scintillationstelleren. Programmer scintillationstelleren for å måle 35 S isotoputslipp i 5 min per prøve ved hjelp av standard-tilknyttet scintillasjonsprogram.
- Trykk på "Start" for å telle.
- Når tellingen er ferdig, kast det telle hetteglassetS som farlig avfall.
6. Dataanalyse
- Skriv inn dataene i statistikk og analyse programvare.
- Subtrahere den ikke-spesifikke bindingen fra hver av de andre målingene for å bestemme den spesifikke bindingen.
MERK: Graden av ikke-spesifikk binding bestemmes av prøven inkubert med ikke-radioaktivt merket GTPγS (trinn 3.8.3). - Åpne statistikken og analysesoftware og velg en XY datasettoppføring.
- Skriv inn de spesifikke bindingsdataene fra [ 35 S] GTPγS-bindingsforsøkene i en datatabell i statistikken og analysesoftware. Angi agonistkonsentrasjoner, som molare konsentrasjoner, i "X" kolonnen. Skriv inn de tilknyttede 35 S-tallene som "Y" -verdier.
- Subtrahere den ikke-spesifikke bindingen fra hver av de andre målingene for å bestemme den spesifikke bindingen.
- Transform dataene.
- Konverter X-verdiene til deres respektive logaritme ved å klikke på "Analyser". Velg "Transform" fra den innebygdeN analyser.
- I dialogboksen "Transform" velger du "Transform X values using" og velg funksjonen "X = log (X)." Velg å lage en ny graf av resultatene.
- Klikk på "OK".
- Normaliser Y-verdiene.
- Med de viste transformerte resultatene klikker du på "Analyser". Velg "Normaliser" fra de innebygde analysene.
- I dialogboksen Normaliser velger du radioknappen for å definere 0% som "minste verdi i hvert datasett" og 100% som "største verdi i hvert datasett." Velg boksen for å presentere resultatene som prosentandel. Velg boksen for å lage en ny graf av resultatene.
- Klikk på "OK".
- Tilpass en ikke-lineær regresjonskurver til de plottede dataene. Utfør en ikke-lineær regresjonsanalyse.
- Med de normaliserte resultatene som vises, klikker du på "Analyser". Fra de innebygde analysene, Velg "Ikke-lineær regresjon (kurveformet)."
- Hvis du undersøker en agonist, velg "logg (agonist) vs. normalisert respons - variabel helling" fra dialogboksen.
- Hvis du undersøker en antagonist, velger du logg (antagonist) versus normalisert respons - variabel helling "fra dialogboksen.
- Klikk på "OK".
- Se gjennom grafen og resultatene for å sikre at passform og data er i rimelig enighet. Kontroller at regresjonen samsvarer med det generelle mønsteret til de plottede dataene og at residuene ikke er så store at de gjør dosisresponsskurven flatt.
MERK: Programvaren vil oppsummere resultatene av den ikke-lineære regresjonen og detaljer konsentrasjonen som fremkaller halvmaksimal respons (EC 50 ), Hill-koeffisient (n H ) og halv maksimal hemmerende konsentrasjon (IC 50 ). - Derivat agonist / antagonistparameter potens.
- Avled agonisten equIlibrium-dissosiasjonskonstanter (Kb) fra en av de følgende forsøk 16 , 17 , 18
- Vurder skiftet i dosisresponsen av en agonist i konkurranse med en fast konsentrasjon av antagonist. Her er EC 50 '= EC 50 (1 + [antagonist] / antagonist Kb ), hvor EC 50 ' er den høyreforskudde EC 50 .
- Vurder [ 35 S] GTPγS-binding med varierende konsentrasjoner av antagonist i konkurranse med en fast konsentrasjon av agonist. Her, Kb = IC50 / (2 + ([agonist] / agonist EC 50 ) n ) 1 / n - 1, hvor n er agonistens Hill-koeffisient.
- Avled agonisten equIlibrium-dissosiasjonskonstanter (Kb) fra en av de følgende forsøk 16 , 17 , 18
- Avhengig av variabiliteten av dataene, gjenta eksperimentet (trinn 3.8-5.6) for hver ligand ca 3-5 ganger og gjennomsnittsresultatene ved hjelp av en statistikk og analyse softwer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellfraksjonering kan brukes til å isolere og berikke membranassosierte proteiner fra cytosoliske og nukleare proteiner. Figur 1 er en Western blot som demonstrerer innholdet av de tre primære fraksjonene som kan samles under den subcellulære fraksjoneringsprosessen. Nærmere bestemt viser figur 1 at fraksjonering skiller rent membranproteiner ( dvs. Na + / K + ATPase, proteindisulfid-isomerase (PDI) og HA-MOR1) fra histon H2B og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), nukleære proteiner og cytosoliske proteiner, henholdsvis. I tillegg viser figur 1 anrikningen av proteiner (bane 1 sammenlignet med bane 4) i deres respektive subcellulære fraksjoner som et resultat av fraksjonering. En representativ Ponceau flekk demonstrerer lik proteinprotein i hver fraksjon. Det er viktig å merke seg at dette fractiOnation protokoll skiller ikke mellom forskjellige cellemembraner. PDI er vanligvis lokalisert til endoplasmatisk retikulum (ER), mens Na + / K + ATPase overveiende er ved plasmamembranen. Imidlertid er begge proteiner tilstede i den endelige råmembranfraksjonen ( figur 1 , felt 4). I tillegg, mens denne protokollen separerer kjernefysiske proteiner robust fra den cytosoliske og endelige membranfraksjonen ( Figur 1 , baner 2-4), inneholder fraksjonen anriket for nukleære proteiner noen membranproteiner ( Figur 1 , felt 2), muligens fra ER.
Flere farmakologiske parametere kan avledes for å karakterisere en GPCR-ligand-interaksjon via GTP-bindingsforsøk ( Tabell 1 ). For eksempel kan den halvmaksimale responsen (EC 50 ) og Hill-koeffisienten (nH) av en agonist avledes ved å overvåke GTP-binding iRespons på varierende doser av agonisten. Figur 3A demonstrerer dose-responsiv GTP-binding til MOR1 etter DAMGO-behandling. Når dataene passer til en fireparameter ikke-lineær regresjon, beskriver pasienten en receptor-ligand-interaksjon med en EC 50 på 185 ± 23 nM og en Hill-koeffisient på 0,46 ± 0,06. Den grunne GTP-bindingskurven observert etter DAMGO-behandling tyder på negativ kooperativitet mellom DAMGO og MOR1. Denne metoden kan også identifisere og beskrive farmakologien til en antagonist. Som figur 3A og B illustrerer, er naloxon en MOR1-antagonist. Agoniststyrken (Kb) av naloxon, 97 ± 20 nM, ble bestemt ved å variere konsentrasjonen av nalokson i konkurranse med en fast konsentrasjon av DAMGO ( figur 3A ). Nalokson viste en Hill-koeffisient på 0,88 ± 0,06, noe som tyder på uavhengig binding mellom naloxon og MOR1. Hvis ACTannelse av en ligand er ukjent, denne analysen kan diskriminere mellom en agonist, antagonist og invers agonist. Hvis liganden er en agonist, ville det være en økning i GTP-binding, som i figur 3A , etter DAMGO-søknad. Hvis liganden er en invers agonist, ville det være redusert binding av GTP i forhold til basal binding. Hvis liganden er en antagonist, ville det ikke være noen effekt ved behandling med ligand alene. Hvis det brukes samtidig med en agonist, vil en antagonist hemme agonistens evne til å stimulere GTP-binding. Figur 3A illustrerer antagonistaktiviteten til nalokson mot agonisten DAMGO.
Figur 1: Cellulær fraksjonering separerer membranassosierte, kjerne- og cytosoliske proteiner. ( Top ) Lane 1 representererProtein tilstede i hele cellen. Bane 2 inneholder kjernefysiske og membranassosierte proteiner separert under de første sentrifugeringstrinnene. Bane 3 er den cytosoliske fraksjon separert etter 20 min sentrifugering ved 11 000 x g. Bane 4 inneholder en råmembranfraksjon egnet for [35S] GTPγS-bindingsforsøk. ( Bunn ) Ponceau flekk av en vestlig membran demonstrerer proteinbelastning for hver cellefraksjon. Følgende antistoffer ble brukt til immunblotting: mus anti-Na + / K + -ATPase (1: 1000), mus anti-GAPDH (1: 5000), mus anti-H2B (1: 2500), kanin anti PDI : 1000) og rotte anti-HA (1: 2000). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Flytdiagram som beskriver fraksjoneringen og [35S] GTPγS-bindingsprosedyren. Først transfekterer cellene å uttrykke GPCR av interesse. Etter 48 timer, høste og fraksjonere cellene for å isolere reseptoren (rød) og tilhørende G-proteiner (grønn = G α , lilla = G β og oransje = G γ ). For å utføre GTP-bindingseksperimenter, legg til [35S] GTPγS og inkuber membranene med den aktuelle ligand. For å måle G-proteinaktivitet binder membranene til et filter for å vaske bort ubundet radiokjemisk og deretter kvantifisere den bundne [ 35 S] GTPyS ved væskescintillasjonstelling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Agonisme aNd-antagonisme ved μ-opioidreceptorer Definert ved [35S] GTPγS-binding. ( A ) [ 35 S] GTPγS dose-respons kurve til DAMGO alene (blå) eller nalokson i konkurranse med 2,5 μM DAMGO (grønn). [35S] GTPγS-binding ble normalisert til maksimal stimulering i hvert eksperiment og ble uttrykt som en prosentandel. Poengene som vises er gjennomsnittet av triplikatbestemmelser og uttrykkes som gjennomsnittlig ± SEM ( B ) -antagonisme av DAMGO-stimulert [35S] GTPγS Bindende av naloxon. [35S] GTPγS Bindingen ble kvantifisert etter tilsetning av naloxon alene (100 μM), DAMGO alene (10 μM) eller DAMGO (10 μM) i konkurranse med naloxon (100 μM). Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk på hanÅ se en større versjon av denne figuren.
| ligand | EC 50 eller IC 50 (nM) | N H | K b (nM) |
| DAMGO | 185 ± 23 | 0,46 ± 0,06 | |
| nalokson | 420 ± 87 | 0,88 ± 0,06 | 97 ± 20 |
Tabell 1: Farmakologiske parametere av DAMGO og naloksonaktivitet ved μ-opioidreceptorer. Den halvmaksimale responsen (EC 50 ) og Hill-koeffisienten (nH) for DAMGO ble avledet fra [35S] GTPγS-binding som svar på varierende doser DAMGO. Den halv-maksimale hemmende konsentrasjon(IC50) og likevektsdissociasjonskonstanten (Kb) for nalokson ble bestemt fra effekten av konkurranse mellom naloxon og 2,5 uM DAMGO på [35S] GTPγS-binding. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet ± SEM av tre uavhengige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreliggende protokollen beskriver to separate, men komplementære metoder: En enkel tilnærming til fraksjonering av celler og vev i brede, men tydelige rom og et middel for å undersøke GPCR-signalering ved å måle [35S] GTPγS-binding.
Effektiv cellulær fraksjonering har et bredt spekter av anvendelser, alt fra utvinning og anrikning av proteiner til vurdering av subcellulær lokalisering av proteiner til studier av reseptor farmakologi. Selv om alternative tilnærminger til fraksjonering av celler og vev finnes, er protokollen som presenteres her relativt billigere, raskere og enklere. I motsetning til mer etablerte metoder, er imidlertid denne metoden ikke i stand til å skille separate plasmamembranassosierte proteiner fra andre membranrom, som endosomer eller ER. Det må også bemerkes at mens ovennevnte protokoll bruker et forbigående overekspresjonssystem for å generere cellemembraner som inneholder GPCR avInteresse, denne protokollen er kompatibel med stabile overekspresjonssystemer, så vel som med dyr eller menneskevev 19 .
Prøvepreparering er kritisk for å maksimere fraksjonens utbytte og renhet. Det er spesielt viktig å sikre fullstendig homogenisering og å minimere overgangstider mellom sentrifugeringstrinn. Ved å bruke en pellethomogenisator / pestel for å fullstendig forstyrre cellemembranen, øker det råmembranutbyttet betydelig i den endelige cellefraksjonen. Hvis membranutbyttet er for lavt, ville de to enkleste løsningene være å skalere opp den opprinnelige cellekulturen og / eller homogenisere cellepelleten noen få ganger. Hvis individuelle fraksjoner viser en høy grad av urenhet, reduser overgangstider mellom sentrifugering og separasjon. Ikke la prøvene sitte etter sentrifugering, da proteiner kan diffunderes i prøven og redusere fraksjonens renhet.
Filtreringsbasert [ 35 S] GTPyS-binding er en rask og kvantitativ metode for å måle aktiveringen av G-proteiner ved hjelp av den tilhørende reseptoren. Måling av GTP-binding muliggjør en mer kvantitativ måling av GPCR-aktivitet enn det er generelt mulig når man overvåker nedstrøms prosesser. Det er imidlertid to kritiske begrensninger for metoden som er skissert her. Viktigst er filtreringsbasert [35S] GTPγS-kvantisering ikke like mulig med alle G a- isoformer 20 , 21 . Generelt er denne metoden begrenset til G i / o- koblede GPCRer som MOR1 22 . G s- og G q- koplede reseptorer har en tendens til å være mindre følsomme. Dette skyldes sannsynligvis kombinasjonen av den lavere overflaten av G s / G q og deres relativt langsommere nukleotidutveksling, noe som gjør det vanskelig å skille mellom ekte [ 35 S] GTPγS-binding over bakgrunnen. Denne begrensningen har blitt adressert til andre Ewhere ved bruk av G-protein antistoff fangst teknikker 20 . Noen grupper har funnet at eliminering av BNP fra reaksjonen forbedrer signal-støyforholdet for G s- eller G q- koplede reseptorer 23 . Den andre begrensningen er membranfølsomheten for lipofile agonister eller overflateaktive midler. [35S] GTPγS-analyser krever funksjonelle reseptor-G-proteinkomplekser, og tilsetningen av lipofile molekyler til reaksjonssystemet kan forstyrre strukturen av membranene eller disse kompleksene. Hvis dette er en potensiell bekymring, kan det være fordelaktig å teste om reagenset av interesse forstyrrer [35S] GTPγS-binding i et allerede godt karakterisert system, slik som i DAMGO-mediert MOR1-stimulering. Andre betingelser for å vurdere optimalisering inkluderer bindingsbuffertens pH, konsentrasjonene av Mg2 + og NaCl, proteinkonsentrasjonen og inkubasjonstiden 23 ,Ef "> 24.
Denne protokollen fokuserte på en godt karakterisert GPCR, MOR1, og velkarakteriserte stoffer, DAMGO (agonist) og naloxon (antagonist), som handler om MOR1. En av fordelene ved denne teknikken er imidlertid at den kan brukes til å karakterisere ukjente ligander som agonister, antagonister eller inverse agonister, avhengig av hvordan liganden modulerer GTP-binding. Ved utforming av eksperimenter er det kritisk å bruke en rekke konsentrasjoner av liganden av interesse og å være oppmerksom på utvalgets utfall: agonister vil forårsake en økning i GTP-binding over baseline, inverse agonister vil føre til en reduksjon i GTP-binding i forhold til Baseline, og antagonister vil ha liten eller ingen effekt når de legges isolert på baseline GTP binding.
Sammendrag beskriver denne protokollen en teknikk for å utføre subcellulær fraksjonering, innsamling av råmembranpreparater og undersøkelse av GPCR-aktivering ved å måle [35S] GTPγS-binding. Disse teknikkene kan lett tilpasses en rekke cellekultur- og vevsmodeller for å studere farmakologien til en av de viktigste reseptorfamiliene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health-stipend DA-000266 og Medisinforskerutdanningsprogram T32-stipend (CV, NWZ og PCS). Forfatterne vil også gjenkjenne somersault18: 24 (somersault1824.com) for biblioteket for naturvitenskapelige og medisinske illustrasjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in a 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Cell culture 10 cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), New York, NY. 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), New York, NY. 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), New York, NY. 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), New York, NY. 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , Springer. 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
