Summary
Guanosine triphosphate (GTP) 결합은 G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) 활성화에서 가장 초기의 사건 중 하나이다. 이 프로토콜은 방사성 표지 된 GTP 유사체 [ 35 S] 구아노 신 -5'-O- (3- 티오) 트리 포스페이트 ([ 35 S] GTPγS)의 결합을 모니터링함으로써 특정 GPCR- 리간드 상호 작용을 약리학 적으로 특성화하는 방법을 설명합니다. 관심있는 리간드에 대한 반응.
Abstract
G- 단백질 결합 수용체 ( G-Protein-Coupled Receptor , GPCRs)는 정상적인 세포 생리학에서 중요한 역할을하는 막 투석 수용체의 큰 계열이며 진통, 혈압 조절 및 정신병 치료와 같은 여러 적응증의 주요 약리학 적 표적을 구성합니다. 리간드 결합시, GPCR은 구아 노신 트리 포스페이트 (GTP)의 혼입을 자극하여 세포 내 G- 단백질의 활성화를 촉매한다. 활성화 된 G- 단백질은 세포 반응을 유도하는 신호 전달 경로를 자극합니다. GPCR 시그널링은 G- 단백질로 [ 35 S] 구아노 신 -5'-O- (3- 티오) 트리 포스페이트 ([ 35 S] GTPγS)의 방사성 표지 및 비 가수 분해성 형태의 결합을 측정함으로써 모니터 할 수있다. 더 많은 하류 신호 전달 과정을 평가하는 다른 방법과 달리, [ 35 S] GTPγS binding은 GPCR 신호 전달에서 근위 사건을 측정하며, 중요하게는,ts, 길항제 및 역작용 제를 포함한다. 현재의 프로토콜은 원형 GPCR, μ-opioid 수용체 (MOR1)의 조질 막 준비를 사용하여 GPCR 신호를 연구하기위한 민감하고 구체적인 방법을 개략적으로 설명합니다. 세포와 조직을 분별하는 대안적인 방법이 있지만, 비용이 많이 들고, 지루하고, 비표준 실험 장비가 필요합니다. 본 방법은 기능성 조 (crude) 막을 풍부하게하는 간단한 절차를 제공한다. MOR1을 분리 한 후, 그 작용제 인 [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] - 엔케팔린 (DAMGO) 및 길항제 인 나록 손의 다양한 약리학 적 성질을 결정 하였다.
Introduction
G- 단백질 결합 수용체 (G-Protein-Coupled Receptor, GPCRs)는 진통, 후각 및 행동을 포함하여 현저한 일련의 생리 학적 과정을 담당하는 세포 표면 수용체의 큰 계열입니다. GPCR은 특정 외부 신호를 감지하고이어서 세포 내 신호를 자극함으로써 작동합니다. 따라서 그들은 세포의 외부 환경과 내부 환경 사이의 주요 연결점을 표시합니다. GPCR이 생물학에서 중요한 역할을하기 때문에, 그들은 기초 연구와 약물 발견 둘 다에 대한 주요 표적이되었다.
이산 리간드에 결합하는 다른 수용체 계열과 달리 GPCR은 매우 다른 유형의 분자에 결합 할 수 있습니다. 하나의 GPCR은 펩타이드와 상호 작용할 수 있지만, 다른 GPCR은 펩티드와 상호 작용할 수 있지만, 다른 GPCR은 펩티드와 상호 작용할 수 있습니다. 그들의 리간드가 다양하지만, GPCR은 전체 건축가에게 통일되어 있습니다.기능 및 기능. 개별 GPCR은 세포 외 아미노 말단과 세포 내 카르 복실 말단을 갖는 7 개의 α 헬리컬 막 횡단 단백질로 이루어져있다. GPCR은 α, β 및 γ 서브 유닛으로 구성된 세포 내 G- 단백질 - 헤테로 트리 메릭 단백질 복합체와 결합되어 다양한 신호 전달 경로를 매개한다. G α 서브 유닛은 구아노 염기 결합 단백질로 guanosine diphosphate (GDP)에 결합 할 때 불활성이고 guanosine triphosphate (GTP) 8,9에 결합 될 때 활성화된다. GPCR이 리간드에 결합 할 때 Gα가 Gβγ로부터 해리되어 Gα가 GTP와 GTP를 교환 할 수 있도록하는 구조 변화가 일어난다. 수용체 그 자체는 다양한 세린 / 트레온에 의해 그의 카르 복실 말단에서 인산화된다ine 키나아제 10 , 11 및 내재화되어 수용체 신호 전달을 약화시킨다 12 , 13 , 14 . 한편 활성화 된 G α 모노머와 G βγ 이합체는 별개의 신호 전달 경로를 활성화시킵니다. 각 G 단백질 subunit에는 여러 가지 isoform이 있으며 각 isoform은 특정 하류 경로와 2 차 메신저 시스템을 대상으로합니다. 주요 G α isoforms에는 G s , G q , G i / o 및 G 12-13이 포함 됩니다. 전형적으로, 개별 GPCR은 특정 G α 이소 형과 결합하여, 외부 자극을 특정 세포 반응 1에 연결 시킨다.
GPCR- 리간드 상호 작용을 특성화하는 것은 수용체의 생물학적 특성을 이해하는 데 중요합니다. GDP / GTP 교환은 초기 이브 중 하나입니다.GTF 결합을 모니터링하는 것은 GPCR 활성화 또는 저해를 측정 할 수있다. GPCR 신호 전달에서 더 많은 하류 현상을 정량하는 것은 정량적 또는 화학량 론적이지 않은 경우가 많으며 전체 작용제를 부분적으로 구별하지 못할 수 있으며 값 비싼 시약이 필요할 수 있습니다. 또한, G α 단백질에 대한 증가 된 GTP 결합은 GPCR 활성화 후 거의 보편적 인 사건이며, 이는 GTP 결합을 측정하는 것이 대부분의 GPCR의 활성을 모니터링하기위한 널리 적용 가능한 분석임을 의미한다. GTP 결합 측정은 관심있는 수용체 또는 토착 조직을 과발현하는 세포에서 GPCR 신호 전달을 모니터링하는 간단하고 신속한 접근법입니다. 본 프로토콜은 GPCR 신호 전달 물질에 작용제와 길항제의 활성을 정량적으로 결정하기 위해 μ-opioid 수용체 (MOR1) 인 archetypal GPCR을 사용하여 기능적 GTP 결합 분석을 상세히 설명합니다.
이 프로토콜은 먼저 MOR1을 과발현하는 세포로부터 조막 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 주의 그쪽으로이 프로토콜은 과발현 시스템에 국한되지 않으며, 다중 수용체 및 G 단백질을 발현하는 천연 조직 또는 제제를 비롯한 많은 막 원천에 적용될 수있다. 프로토콜은 다양한 농도의 [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] - 엔케팔린 (DAMGO) 또는 날 록손 (MOR1 작동 제 및 길항제)에 반응하여 방사성 GTP 유사체의 이들 막에 대한 결합을 측정하는 방법을 상술하고, 각기. GTP 유사체 인 [ 35 S] guanosine-5'-O- (3- thio) triphosphate ([ 35 S] GTPγS)는 가수 분해되지 않는다. G α 서브 유닛은 내재적 인 GTPase 활성을 나타내며 가수 분해 가능한 GTP 방사성 화학 물질에서 표지 된 감마 인산염을 제거하기 때문에이 특성은 중요합니다. 멤브레인을 유리 섬유 필터에 트랩하고 세척 한 후, 방사성 표지 된 GTP를 액체 섬광 계수로 정량화합니다. 여러 약리학 적 매개 변수를 특성에 맞게 유도 할 수 있습니다.길항제 16, 17에 대한 작용제에 대한 절반 최대 반응 (EC 50 ) 및 Hill 계수 (n H ) 및 반감기 최대 억제 농도 (IC 50 ) 및 평형 해리 상수 (K b )를 포함하는 수용체 - , 18 .
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Protocol
1. 배양 된 세포에서의 재조합 HA-MOR1의 발현
참고 : 멸균 층류 후드의 모든 세포 배양 프로토콜을 따르십시오.
- 70 % 에탄올로 세포 배양 층류 후드를 소독하고 세포 배양을 통해 무균 기술을 유지합니다.
- 2mM L - 글루타민, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 10 % 태아 소 혈청 (FBS (1 %))을 보충 한 인간 배아 신장 세포 293 (HEK293) 세포 배양 배지, Dulbecco 's modified Eagle Medium (DMEM) ).
- 충분히 DMEM 10 ML에 10cm 조직 배양 플레이트에 플레이트 2.5 X 10 6 HEK293 세포 및 37- ° C 및 5 % CO 2 70-80 % confluency (O / N)에 도달 할 때까지 품어.
참고 : 완전한 GTP 결합 실험을위한 충분한 단백질을 수집하려면 적어도 3 x 10cm 세포 플레이트를 준비하십시오. - 선택의 transfection 시약을 사용하여 HA - MOR1로 세포를 transfect하고 제조 업체의 '; 지침. 36-48 시간 동안 품어 낸다.
주의 : 인간 MOR-1 cDNA (NCBI Reference Sequence : NM_000914.4)는 Gavril Pasternak로부터의 선물이었고 pCMV-HA에 클로닝되었다.
2. 세포 분획 및 막 수집
- 다음의 용해 완충액을 준비하십시오 :
- 완충액 1 : 10 mM 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), pH 7.4; 1mM 에틸렌 글리콜 - 비스 (β- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N ', N'- 테트라 아세트산 (EGTA); 10 % 수 크로스; 프로테아제 억제제 칵테일; 및 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT)을 포함한다. 막 분리 당일에 DTT를 새로 첨가하십시오.
- 완충액 2 : 10 mM HEPES, pH 7.4; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2; 및 1 mM DTT. 막 분리 당일에 DTT를 새로 첨가하십시오.
- 인큐베이터 (1.4 단계)에서 transfected 세포를 제거하고, 매체를 대기음, 얼음처럼 차가운 인산 버퍼 식염수 (PBS) 5 ML로 세포를 씻어. 에서 PBS와 과잉 액체를 기음접시.
- 세포에 600 μl의 버퍼 1을 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트 표면에서 세포를 분리하고 1.6 ML microcentrifuge 튜브에 세포 현탁액을 피펫.
- 즉시 마이크로 원심 분리 관을 액체 질소에서 급속 동결시킵니다. 일단 샘플이 동결되면, 얼음 위에 lysate를 녹이거나 장기 보관을 위해 -80 ° C에 두십시오.
- 모든 셀 플레이트에 대해 2.3 단계와 2.4 단계를 반복합니다.
- lysates가 해동되면, 단일 펄스 마이크로 튜브 균질기를 사용하여 세포를 파괴하십시오. 펄스 사이의 30 초 동안 얼음에 튜브를 다시 놓고 10 초 동안 3-5 번 균 질기에 펄스.
- 전체 세포 분획으로 20 μL를 수집합니다.
- 나머지 샘플을 1,000 xg 및 4 ° C에서 10 분간 원심 분리하십시오. 뜨는를 수집하고 얼음에 새로운 1.6 ML microcentrifuge 튜브에 놓으십시오.
- 완충액 100 μL에 펠렛을 Resuspend하고 유봉으로 rehomogenize. 호모를 자극하십시오.genizer 5 초 동안 3-5 회, 튜브를 얼음 사이에 30 초 동안 두었다.
- 1,000 xg 및 4 ° C에서 10 분 동안 두 번째 샘플을 원심 분리하십시오. 상층 액을 단계 2.7의 상층 액과 혼합한다.
참고 : 나머지 펠렛은 핵 및 막 단백질을 포함합니다.
- 1,000 xg 및 4 ° C에서 10 분 동안 두 번째 샘플을 원심 분리하십시오. 상층 액을 단계 2.7의 상층 액과 혼합한다.
- 11,000 xg 및 4 ° C에서 20 분 동안 상등액을 합하여 원심 분리하십시오. 새로운 1.6 ML의 microcentrifuge 튜브에 뜨는 (cytosolic 분수)를 분리하십시오.
- 완충액 200 μL에 펠렛을 Resuspend. 그것은 3-5 번 씹다하여 펠릿을 균질. 21,100 xg 및 4 ° C에서 20 분 동안 시료를 원심 분리하십시오. 뜨는을 대기음. 조제 막 분획을 포함하는 펠렛을 버퍼 2 50 μL에 Resuspend.
- 즉시 GTPγS 결합 실험 (섹션 3)으로 진행하거나 -80 ° C에서 액체 질소에서 급속 동결하고 저장하십시오.
3. [ 35 S] GTPγS 결합 참고 : [ 35 S] GTPγS를 처리 할 때 및 [ 35 S] GTPγS 결합 실험을 수행 할 때 표준 방사 화학 안전 프로토콜을 사용합니다. 항상 보호 장갑과 실험실 코트를 착용하십시오. 포장재에 새거나 균열이 없는지 확인하십시오. 기관 프로토콜에 따라 폐기물 및 과량의 시약을 폐기하십시오.
- 50 mM HEPES, pH 7.4를 혼합하여 불완전한 결합 완충제 (IBB)를 준비하십시오. 5 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 및 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 증류수에 용해시켰다.
- 10 mM Tris-HCl, pH 7.6 및 10 mM DTT에서 50 μM로 스톡 [ 35 S] GTPγS를 희석한다. 500 μL 분취 량을 만들고 -80 ° C에서 보관하십시오. 실험을 시작하기 직전에 갓 해동 된 분취 량만을 사용하십시오. 얼음 위에서 일정량을 녹이십시오.
- 10mM의 재고 농도에 대한 순수한 물 177.62 μL에 GTPγS 분말 1 MG를 용해하여 비 방사성 표지 GTPγS를 준비합니다. 10-μL 분취 량을 만들고-20 ° C.
- 1 mM DTT, 0.1 % (wt / vol) 소 혈청 알부민 (BSA), 10 μM GDP 및 0.1 nM [ 35 S] GTPγS의 최종 농도를 포함하도록 IBB를 보충하여 완전한 결합 완충액 (CBB)을 준비합니다.
참고 : 이제 CBB에는 방사성 표지 된 GTP가 포함됩니다. 방사능 솔루션을 사용하는 동안 적절한 안전 예방 조치를 취하십시오. - 얼음 위에서 단계 2.11의 멤브레인 분획을 녹입니다.
- 595 nm에서 분광 광도계를 사용하여 Bradford 단백질 분석을 통해 막 분획의 단백질 농도를 정량화하십시오.
- 완충액 2로 최종 농도가 0, 250, 500, 750, 1,500, 2,500 및 5,000 μg / mL 인 BSA 단백질 표준 희석 시리즈를 준비하십시오.
- 큐벳에서 Bradford 시약 1 ML에 각 표준 또는 멤브레인 2 μL를 추가합니다. 보텍스로 철저히 혼합하십시오.
- 분광 광도계를 595 nm의 파장으로 조정하고 0 μg / mL 단백질을 포함한 큐벳을 사용하여 블랭크합니다.
- 5 분간 기다렸다가 r595 nm 파장에서 각각의 표준 및 각 샘플을 얻는다.
- 농도 대 표준의 흡광도를 플롯하십시오. Beer-Lambert 법칙 (A = εcl, 여기서 ε = 흡광 계수, l = 큐벳의 길이, c = 농도)을 사용하여 막 샘플의 농도를 계산합니다.
- IBB에서 막 분획을 100 μg 단백질 / mL의 농도로 희석하십시오.
참고 : HEK293 세포의 10cm 접시 한 개는 일반적으로 1 & 3 mg protein / mL 사이에서 생성됩니다. - 개별 1.6 ML microcentrifuge 튜브에서 다음 실험 조건을 준비 : 리간드 희석 시리즈, 기초 GTP 결합을 측정하기위한 기초 활동 조건 및 비특이적 GTP 바인딩을 측정하는 비특이적 결합 조건.
- 리간드 희석 시리즈의 경우 CBB 100 μL의 최종 볼륨에서 관심의 리간드의 희석 시리즈를 준비합니다. 원하는 최종 농도의 2 배에서 리간드 계열을 준비하십시오.ons. 반응의 범위를 적절하게 커버하기 위해 리간드 농도를 배치하십시오.
- MOR1을 통한 GTP 결합에 대한 DAMGO의 영향을 분석하기 위해 CBB에서 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM 및 2 pM의 DAMGO 희석액을 준비하십시오 부피 : 100 μL).
참고 : 예를 들어 관심있는 리간드가 예상되는 EC 50 값이 10 μM이면 리간드 희석을 200 nM, 2 μM, 20 μM, 200 μM 및 2 mM로 준비하십시오. 이 5 가지 조건은 광범위한 농도를 포함하며 분석에 필요한 농도의 2 배입니다.
- MOR1을 통한 GTP 결합에 대한 DAMGO의 영향을 분석하기 위해 CBB에서 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM 및 2 pM의 DAMGO 희석액을 준비하십시오 부피 : 100 μL).
- 기초 바인딩의 경우 CBB 100 μL만으로 튜브를 준비하십시오.
- 비특이적 결합을 위해 2 mM nonradio-labeled GTPγS 1 μL가 첨가 된 CBB 99 μL가 들어있는 튜브를 준비하십시오.
- 리간드 희석 시리즈의 경우 CBB 100 μL의 최종 볼륨에서 관심의 리간드의 희석 시리즈를 준비합니다. 원하는 최종 농도의 2 배에서 리간드 계열을 준비하십시오.ons. 반응의 범위를 적절하게 커버하기 위해 리간드 농도를 배치하십시오.
- 각 실험 조건에 희석 막 용액 (단계 3.7) 100 μL를 추가합니다.
- 다양한 실험과 막을 품어Thermomixer 또는 궤도 진탕 기에서 30 분 동안 25 ℃에서 1.6 mL microcentrifuge tube에 넣었다.
4. 멤브레인 여과
- 50 MM Tris-HCl, pH 7.4를 혼합하여 세척 완충액을 준비한다. 5 mM MgCl2; 및 증류수 중 50 mM NaCl.
- 유리 섬유 필터를 물에 10 분간 예비 압착하십시오.
참고 : 필터의 기공 크기는 1 μm, 지름은 2.1 cm, 두께는 675 μm입니다. - Thermomixer 또는 Orbital Shaker에서 시료를 꺼냅니다 (3.10 단계). 튜브의 바닥에서 각 샘플을 수집하기 위해 샘플을 간단히 펄스 스핀 (5 초)합니다.
- 진공 여과 장치의 뚜껑을 제거하십시오. 장치의 진공 포트에 사전 필터를 놓으십시오. 장치 뚜껑을 다시 고정하여 진공 씰을 형성하십시오. 진공을 켜십시오.
- 튜브의 벽 및 / 또는 피펫으로부터의 흡착으로 인한 오차를 최소화하기 위해 필터에 200μL 실험 조건 195 μL 피펫팅.
- 필터를 1 mL의 차가운 세척 완충액으로 3 회 세척한다.
5. 액체 섬광 계수
- 계수 선반에 5 mL의 신틸레이션 계수기 바이알을 놓습니다. 각 유리 병에 5mL의 섬광 액을 첨가하십시오.
- 진공을 차단하십시오 (4.4 단계). 진공 여과 장치의 뚜껑을 제거하십시오. 핀셋을 사용하여 여과 장치의 진공 포트에서 필터를 가져와 각 필터를 개별 5 mL 섬광 바이알에 떨어 뜨립니다.
- 최대 신호를 결정하기 위해 CBB 195 μL와 함께 하나의 유리 병을 준비하십시오.
- 각 유리 병을 안전하게 뚜껑을 덮으십시오. 25 ℃에서 궤도 진탕 기 (vials)에 10 분간 항온 배양합니다.
- 섬광 카운터를 켭니다. 신틸레이션 카운터를 프로그램하여 표준 관련 섬광 프로그램을 사용하여 시료 당 5 분 동안 35S 동위 원소 방출을 측정하십시오.
- 카운트를 시작하려면 "시작"을 누르십시오.
- 계수가 끝나면 계산 된 유리 병을 폐기하십시오유해 폐기물로 분류됩니다.
6. 데이터 분석
- 통계 및 분석 소프트웨어에 데이터를 입력하십시오.
- 특정 바인딩을 결정하기 위해 다른 측정의 각각에서 비 특정 바인딩을 뺍니다.
비고 : 비특이적 결합 정도는 비 방사성 표지 된 GTPγS로 배양 한 시료에 의해 결정된다 (단계 3.8.3). - 통계 및 분석 소프트웨어를 열고 XY 데이터 세트 항목을 선택하십시오.
- 통계 및 분석 소프트웨어의 [ 35 S] GTPγS- 바인딩 실험에서 얻은 특정 바인딩 데이터를 데이터 테이블에 입력하십시오. "X"란에 몰 농도로서 작용제 농도를 입력하십시오. 연관된 35 S 카운트를 "Y"값으로 입력하십시오.
- 특정 바인딩을 결정하기 위해 다른 측정의 각각에서 비 특정 바인딩을 뺍니다.
- 데이터를 변환하십시오.
- "분석"을 클릭하여 X 값을 각각의 대수로 변환하십시오. 내장 i에서 "변환"을 선택하십시오.n 분석.
- "변환"대화 상자에서 "X 값 변환"을 선택하고 "X = log (X)"함수를 선택하십시오. 결과의 새로운 그래프를 만들도록 선택하십시오.
- "확인"을 클릭하십시오.
- Y 값을 표준화합니다.
- 변환 된 결과가 표시되면 "분석"을 클릭하십시오. 내장 분석에서 "표준화"를 선택하십시오.
- "Normalize"대화 상자에서 라디오 버튼을 선택하여 "각 데이터 세트에서 가장 작은 값"으로 0 %를 정의하고 "각 데이터 세트에서 가장 큰 값"으로 100 %를 정의합니다. 결과를 백분율로 표시하려면 상자를 선택하십시오. 결과의 새 그래프를 작성하려면 상자를 선택하십시오.
- "확인"을 클릭하십시오.
- 플롯 된 데이터에 비선형 회귀 곡선을 맞 춥니 다. 비선형 회귀 분석을 수행하십시오.
- 정규화 된 결과가 표시되면 "분석"을 클릭하십시오. 내장 분석"비선형 회귀 (곡선 적합)"를 선택하십시오.
- 작동 제를 조사하는 경우 대화 상자에서 "log (작동 제) 대 정규화 된 응답 - 가변 슬로프"를 선택하십시오.
- 길항제를 조사하는 경우, 대화 상자에서 "로그 선택 (길항제) 대 정규화 된 응답 - 가변 슬로프"를 선택하십시오.
- "확인"을 클릭하십시오.
- 그래프와 결과를 검토하여 적합성과 데이터가 합리적으로 일치하는지 확인하십시오. 회귀가 플롯 된 데이터의 일반적인 패턴과 일치하고 잔차가 너무 커서 선량 - 반응 곡선을 평평하게 만들지 않도록하십시오.
참고 :이 소프트웨어는 비선형 회귀의 결과를 요약하고 반 최대 반응 (EC 50 ), 힐 계수 (n H ) 및 최대 최대 억제 농도 (IC 50 )를 유도하는 농도에 대해 자세히 설명합니다. - 작용제 / 길항제 매개 변수 효능 유도.
- 작용제를 유도한다.하기 실험 16 , 17 , 18 중 어느 하나로부터의 평형 해리 상수 (K b )
- 적정 농도의 길항제와 경쟁에서 작용제의 용량 - 반응의 변화를 평가하십시오. 여기서, EC 50 '= EC 50 (1 + [길항제] / 길항제 Kb )이고, 여기서 EC 50 '은 우측 - 쉬프트 된 EC 50 이다.
- 고정 농도의 작용제와 경쟁하여 길항제 농도를 변화시켜 [ 35 S] GTPγS 결합을 평가하십시오. 여기서, Kb = IC50 / (2+ (길항제 / 작용제 EC50) n ) 1 / n -1, 여기서 n은 작용제의 힐 계수이다.
- 작용제를 유도한다.하기 실험 16 , 17 , 18 중 어느 하나로부터의 평형 해리 상수 (K b )
- 데이터의 가변성에 따라 각 리간드에 대해 약 3-5 회 실험 (단계 3.8-5.6)을 반복하고 통계 및 분석 소프트웨어를 사용하여 결과를 평균화합니다아르.
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Representative Results
세포 분획 화는 세포질 및 핵 단백질로부터 막 관련 단백질을 분리하고 풍부하게하는데 사용될 수 있습니다. 그림 1 은 subcellular 분별 과정에서 수집 할 수있는 세 가지 기본 분량의 내용을 보여주는 서양 얼룩입니다. 구체적으로 그림 1 은 히스톤 H2B와 글리세롤 알데히드 3 인산 탈수소 효소 (GAPDH), 핵 단백질 및 세포질 단백질에서 막 단백질 (Na + / K + ATPase, 단백질 이황화물 이소 머라 제 (PDI), HA-MOR1) 각기. 또한, 도 1은 분획 화의 결과로서 각각의 세포 아래 분획에서 단백질의 농축 (레인 1과 비교 한 레인 1)을 나타낸다. 대표적인 Ponceau 얼룩은 각 분획물에 동일한 단백질 로딩을 보여줍니다. 이 fractionation 프로토콜은 다른 세포막을 구분하지 않습니다. PDI는 일반적으로 소포체 (ER)에 국한되어 있지만, Na + / K + ATPase는 주로 세포막에 존재한다. 그러나, 두 단백질 모두 최종 조막 분획물에 존재한다 ( 그림 1 , 레인 4). 또한이 프로토콜은 cytosolic 및 최종 막 분획 ( 그림 1 , 레인 2-4)에서 핵 단백질을 견고하게 분리하지만, 핵 단백질에 대한 풍부한 분획은 ER에서 일부 막 단백질 ( 그림 1 , 레인 2)을 포함 할 수 있습니다.
GTP- 결합 실험을 통해 GPCR- 리간드 상호 작용을 특성화하기 위해 여러 약리학 적 매개 변수를 유도 할 수 있습니다 ( 표 1 ). 예를 들어, 작용제의 반 최대 반응 (EC 50 ) 및 힐 계수 (n H )는 다음에서 GTP 결합을 모니터링함으로써 유도 될 수있다 :작용제의 다양한 투여 량에 대한 반응. 그림 3A는 DAMGO 치료 후 MOR1에 대한 용량 반응 GTP 결합을 보여줍니다. 데이터가 4- 매개 변수 비선형 회귀에 적합 할 때, 적합은 EC 50 이 185 ± 23nM이고 Hill 계수가 0.46 ± 0.06 인 수용체 - 리간드 상호 작용을 나타냅니다. DAMGO 치료 후 관찰 된 얕은 GTP 결합 곡선은 DAMGO와 MOR1 사이의 부정적인 협력 성을 암시한다. 이 방법은 또한 길항제의 약리학을 확인하고 기술 할 수있다. 도 3A 및 B가 도시하는 바와 같이, 날 록산은 MOR1 길항제이다. Naloxone의 작용제 효능 (K b )은 고정 농도의 DAMGO ( 그림 3A )와의 경쟁에서 나일 록산의 농도를 변화시킴으로써 결정되었습니다 (97 ± 20 nM). Naloxone은 0.88 ± 0.06의 Hill 계수를 나타내었고, 이는 Naloxone과 MOR1 사이의 독립적 인 결합을 시사한다. AC리간드의 형성이 알려지지 않은 경우,이 분석은 작용제, 길항제 및 역 작용제를 구별 할 수있다. 리간드가 작동 제인 경우, 도 3a 에서와 같이, DAMGO 적용 후에 GTP 결합이 증가 될 것이다. 리간드가 역작용 제인 경우, 기저 결합에 비해 GTP의 결합이 감소 될 것이다. 리간드가 길항제 인 경우, 리간드 단독으로는 치료에 영향을주지 않을 것이다. 작용제와 함께 투여되는 경우, 길항제는 작용제가 GTP 결합을 자극하는 능력을 억제 할 것이다. 도 3A 는 작용제 인 DAMGO에 대한 나록 크론의 길항제 활성을 예시한다.
그림 1 : 세포 분획은 멤브레인 - 관련, 핵 및 세포질 단백질을 분리합니다. ( 위 ) 레인 1은단백질 전체 세포에 존재합니다. 레인 2는 첫 번째 원심 분리 단계에서 분리 된 핵 및 막 관련 단백질을 포함합니다. 레인 3은 11,000 x g에서 원심 분리 20 분 후에 분리 된 세포질 분획이다. 레인 4는 [ 35 S] GTPγS- 결합 실험에 적합한 조 막 분획을 함유한다. ( 아래쪽 ) Western membrane의 Ponceau stain은 각 세포 분획에 대한 단백질 적재량을 보여줍니다. mouse anti-Na + / K + -ATPase (1 : 1,000), 마우스 anti-GAPDH (1 : 5,000), 마우스 anti-H2B (1 : 2,500), 토끼 항 PDI (1 : : 1,000), 쥐 항 -HA (1 : 2,000). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 분획 및 [ 35 S] GTPγS 바인딩 절차 개요 흐름 차트. 먼저 관심있는 GPCR을 표현하기 위해 세포를 transfect하십시오. 48 시간 후 수용체 (적색)와 관련 G 단백질 (녹색 = Gα, 보라색 = Gβ 및 오렌지 = Gγ)을 분리하기 위해 세포를 수확하고 분별한다. GTP 결합 실험을 수행하려면 [ 35 S] GTPγS를 첨가하고 원하는 리간드와 함께 막을 배양하십시오. G- 단백질 활성을 측정하기 위해 멤브레인을 필터에 결합시켜 결합되지 않은 방사성 화학 물질을 씻어 낸 다음 액체 섬광 계수법으로 결합 [ 35 S] GTPγS를 정량화합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : Agonism aμ-opioid 수용체에서의 길항 작용 [ 35 S] GTPγS binding에 의해 정의된다. ( A ) [ 35 S] 2.5 μM DAMGO (녹색)와 경쟁하여 DAMGO 단독 (파란색) 또는 나록 크론에 대한 GTPγS 용량 - 반응 곡선. [ 35 S] GTPγS 결합을 각 실험에서 최대 자극에 대해 표준화하고 퍼센트로 나타내었다. 표시된 포인트는 3 회 측정의 평균이며 평균 ± SEM으로 표시됩니다 ( B ) DAMGO로 자극 된 [ 35 S] GTPγS의 길항 작용 naloxone에 의한 결합. [ 35 S] GTPγS (100 μM), DAMGO 단독 (10 μM) 또는 DAMGO (10 μM)를 첨가 한 후 결합을 정량화 하였다. 결과는 세 번의 독립적 인 실험의 평균 ± SEM으로 표현됩니다. 그 사람을 클릭하십시오.이 그림의 더 큰 버전을 보려면
| 리간드 | EC 50 또는 IC 50 (nM) | n H | Kb (nM) |
| DAMGO | 185 ± 23 | 0.46 ± 0.06 | |
| 나록 소네 | 420 ± 87 | 0.88 ± 0.06 | 97 ± 20 |
도표 1 : μ-opioid 수용체에 DAMGO와 Naloxone 활동의 약리학적인 매개 변수. DAMGO에 대한 절반 최대 반응 (EC 50 )과 Hill 계수 (n H )는 다양한 농도의 DAMGO에 반응하여 [ 35 S] GTPγS 결합으로부터 유래되었다. 반 최대 억제 농도( 35 ℃) GTPγS 결합에 대한 나로 크론과 2.5 μM DAMGO 사이의 경쟁 효과로부터 결정 핵산 (IC 50 ) 및 평형 해리 상수 (K b )를 결정 하였다. 결과는 세 번의 독립적 인 실험의 평균 ± SEM으로 표현됩니다.
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Discussion
현재의 프로토콜은 세포와 조직을 넓고 구별되는 구획으로 나누는 간단한 접근법과 [ 35 S] GTPγS 결합을 측정하여 GPCR 신호 전달을 조사하는 수단 인 두 가지 분리 된 그러나 보완적인 방법을 기술한다.
효율적인 세포 분획 화는 단백질의 추출 및 농축에서 단백질의 세포 내 지방화 평가, 수용체 약리학 연구에 이르기까지 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다. 세포와 조직을 분열시키는 다른 접근법이 존재하지만, 여기에 제시된 프로토콜은 비교적 저렴하고 빠르며 간단합니다. 그러나 기존의 방법과는 달리이 방법은 세포막 관련 단백질을 엔도 좀 (endosomes) 또는 ER과 같은 다른 막 구획과 깨끗하게 분리 할 수 없습니다. 또한 상기 프로토콜은 GPCR을 포함하는 세포막을 생성하기 위해 일시적 과발현 시스템을 사용하지만,이 프로토콜은 동물이나 사람의 조직과 마찬가지로 안정적인 과발현 시스템과도 호환됩니다 19 .
시료 준비는 분획 수율 및 순도를 극대화하는 데 중요합니다. 완전한 균질화를 보장하고 원심 분리 단계 사이의 전이 시간을 최소화하는 것이 특히 중요합니다. 펠릿 균질 기 / 유봉을 사용하여 세포막을 완전히 파괴 시키면 최종 세포 분획에서 조질 막 수율이 상당히 증가한다. 막 수율이 너무 낮 으면 두 가지 가장 간단한 해결책은 초기 세포 배양을 확대하고 /하거나 세포 펠렛을 몇 번 더 균질화하는 것입니다. 개별 분획물의 불순물 함량이 높으면 원심 분리와 분리 사이의 전이 시간을 줄이십시오. 단백질이 시료로 확산되어 분획물 순도를 떨어 뜨릴 수 있기 때문에 시료가 원심 분리 후 잘 앉지 않도록하십시오.
여과 기반 [ 35 S] GTPγS 결합은 관련 수용체를 사용하여 G- 단백질의 활성화를 측정하는 신속하고 정량적 인 방법입니다. GTP 결합을 측정하면 하류 공정을 모니터링 할 때 일반적으로 가능한 것보다 GPCR 활성을보다 정량적으로 측정 할 수 있습니다. 그러나 여기에 설명 된 방법에는 두 가지 중요한 제한 사항이 있습니다. 가장 중요한 것은 여과 기반의 [ 35 S] GTPγS 정량은 모든 G α 이소 형 20 , 21에서 동등하게 실행 가능하지 않다는 것이다. 일반적으로,이 방법은 MOR1 22 와 같은 G / O- 커플 링 된 GPCR로 제한된다. G s - 및 G q - 결합 수용체는 덜 민감한 경향이있다. 이는 Gs / Gq가 상대적으로 더 적게 존재하고 상대적으로 느린 뉴클레오타이드 환율이 결합되어 배경 위에 실제 [ 35 S] GTPγS 결합을 구별하기 어렵게하기 때문인 것으로 보인다. 이 제한은 els G- 단백질 항체 포착 기술을 사용하는 곳 20 . 일부 그룹은 반응에서 GDP를 제거하면 G s - 또는 G q - 결합 수용체의 신호 대 잡음비가 향상된다는 것을 발견했습니다. 두 번째 한계는 친 유성 작용제 또는 계면 활성제에 대한 막 민감성이다. GTPγS 분석은 기능성 수용체 -G- 단백질 복합체를 필요로하며, 반응 시스템에 친 유성 분자를 첨가하면 막 또는 이러한 복합체의 구조가 파괴 될 수 있습니다. 이것이 잠재적 인 관심사라면, DAMGO 매개 MOR1 자극과 같이 잘 특성화 된 시스템에서 [ 35 S] GTPγS 결합을 방해하는지 여부를 테스트하는 것이 유리할 수 있습니다. 최적화 고려해야 할 다른 조건으로는 결합 버퍼 pH, Mg 2+ 및 NaCl의 농도, 단백질 농도 및 배양 시간 23 ,ef "> 24.
이 프로토콜은 잘 특징 GPCR, MOR1, 잘 특징 약물, DAMGO (agonist) 및 Naloxone (길항제), MOR1에 대한 집중에 중점을 둡니다. 그러나이 기술의 장점 중 하나는 리간드가 GTP 결합을 조절하는 방법에 따라 미지의 리간드를 작용제, 길항제 또는 역 작용제로 특성화하는 데 사용될 수 있다는 것입니다. 실험을 계획 할 때 관심있는 리간드의 농도 범위를 사용하고 결과 범위를 염두에 두는 것이 중요합니다. 작동 제는 기준선보다 GTP 결합의 증가를 일으키고, 역작용 제는 다음과 비교하여 GTP 결합을 감소시킵니다. 기준선 및 길항제는 기준선 GTP 바인딩에서 단독으로 추가 될 때 거의 영향을 미치지 않습니다.
요약하면,이 프로토콜은 subcellular 분별을 수행하고, 조막 준비물을 수집하고, [ 35 S] G를 측정하여 GPCR 활성화를 조사하는 기술을 설명합니다TPγS 결합. 이러한 기술은 수용체의 가장 중요한 계열 중 하나의 약리학을 연구하기 위해 다양한 세포 배양 및 조직 모델에 쉽게 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 National Institutes of Health 보조금 DA-000266 및 Medical Scientist Training Program T32 보조금 (CV, NWZ 및 PCS)에 의해 지원되었습니다. 저자는 또한 과학 및 의료 삽화의 도서관에 대한 somersault1824 (somersault1824.com)을 인정하고자합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in a 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Cell culture 10 cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
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