Summary
Guanosintriphosphat (GTP) -binding er en af de tidligste begivenheder i G-protein-koblet receptor (GPCR) -aktivering. Denne protokol beskriver, hvordan man farmakologisk karakteriserer specifikke GPCR-ligandinteraktioner ved at overvåge bindingen af den radiomærkede GTP-analog, [35S] guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphat ([35S] GTPγS), i Svar på en ligand af interesse.
Abstract
G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) er en stor familie af transmembrane receptorer, som spiller kritiske roller i normal cellulær fysiologi og udgør et stort farmakologisk mål for flere indikationer, herunder analgesi, blodtryksregulering og behandling af psykiatrisk sygdom. Ved ligandbinding katalyserer GPCR'er aktiveringen af intracellulære G-proteiner ved at stimulere inkorporering af guanosintrifosfat (GTP). Aktiverede G-proteiner stimulerer derefter signaleringsveje, som fremkalder cellulære responser. GPCR-signalering kan overvåges ved at måle inkorporeringen af en radioaktivt mærket og ikke-hydrolyserbar form af GTP, [35S] guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphat ([35S] GTPγS) i G-proteiner. I modsætning til andre metoder, der vurderer flere downstream-signaleringsprocesser, måler [35S] GTPγS-binding en proximal begivenhed i GPCR-signalering og kan vigtigere adskille agonisTs, antagonister og inverse agonister. Den foreliggende protokol beskriver en følsom og specifik metode til undersøgelse af GPCR-signalering ved anvendelse af råmembranpræparater af en arketypisk GPCR, μ-opioidreceptoren (MOR1). Selv om der findes alternative tilgange til fraktionering af celler og væv, er mange kostprisforbudne, kedelige og / eller kræver ikke-standard laboratorieudstyr. Den foreliggende fremgangsmåde tilvejebringer en simpel procedure, der beriger funktionelle råmembraner. Efter isolering af MOR1 blev forskellige farmakologiske egenskaber af dets agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) og antagonist, naloxon, bestemt.
Introduction
G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) er en stor familie af celleoverfladereceptorer, der er ansvarlige for et bemærkelsesværdigt udvalg af fysiologiske processer, herunder analgesi, olfaction og adfærd 1 . GPCR'er virker ved at detektere specifikke eksterne signaler og efterfølgende stimulere intracellulær signalering. De markerer derfor et nøgleforbindelse mellem de eksterne og interne miljøer i en celle. På grund af den afgørende rolle, som GPCR'er spiller i biologi, er de blevet store mål for både grundforskning og narkotikaforskning 2 , 3 .
I modsætning til andre receptorfamilier, der binder diskrete ligander, kan GPCR'er binde meget forskellige typer af molekyler. Mens en GPCR kan interagere med peptider, kan en anden fornemme fotoner, små molekyler eller ioner 1 , 4 . Mens deres ligander er forskellige, er GPCR'er samlet i deres overordnede arkitektUre og funktion. Individuelle GPCR'er består af syv a-spiralformede transmembranproteiner med ekstracellulære aminoterminaler og intracellulære carboxylterminaler 5 , 6 . GPCR'er er koblet til intracellulære G-proteiner-heterotrimeriske proteinkomplekser sammensat af a, p- og y-underenheder, som medierer forskellige signaleringsveje 7 . G a- underenheden er et guaninukleotidbindende protein, der er inaktivt, når det er bundet til guanosindifosfat (BNP) og aktivt, når det bindes til guanosintrifosfat (GTP) 8 , 9 . Når GPCR'er binder deres ligander, undergår de en konformationsændring, der tillader G a at dissociere fra G β , hvorved G a kan udveksle BNP for GTP 7 . Receptoren selv er phosphoryleret ved sin carboxylterminal af forskellige serin / threonInin kinaser 10 , 11 og internaliseret til dæmpning af receptorsignalering 12 , 13 , 14 . I mellemtiden fortsætter den aktiverede G a- monomer og G- β- dimer for at aktivere forskellige signaleringsveje 7 . Der er flere isoformer af hver G-protein-underenhed, og hver isoform målretter bestemte nedstrømsveje og sekundære messenger-systemer. De store G a- isoformer indbefatter G s , G q , G i / o og G 12-13 . Typisk associeres individuelle GPCR'er med en bestemt G a- isoform, hvorved der kobles en ekstern stimulus til et specifikt cellulært respons 1 .
Karakterisering af en GPCR-ligandinteraktion er kritisk for forståelsen af receptorens biologi. Som BNP / GTP-udveksling er en af de tidligste aftenerNts, der følger ligandbindende, overvågning af GTP-binding kan måle GPCR-aktivering eller -inhibering. At analysere flere downstream-hændelser i GPCR-signalering er ofte ikke så kvantitativ eller støkiometrisk, må ikke skelne fuld agonister fra partielle, og kan kræve dyre reagenser. Endvidere er øget GTP-binding til G α -proteiner en næsten universel begivenhed efter GPCR-aktivering, hvilket betyder, at måling af GTP-binding er et bredt anvendeligt assay til overvågning af aktiviteten hos de fleste GPCR'er. Måling af GTP-binding er en simpel og hurtig tilgang til overvågning af GPCR-signalering i celler, der overudtrykker receptor af interesse eller i nativt væv. Den foreliggende protokol beskriver et funktionelt GTP-bindingsassay under anvendelse af en arketypisk GPCR, μ-opioidreceptoren (MOR1) for kvantitativt at bestemme aktiviteten af en agonist og antagonist ved GPCR-signalering.
Denne protokol beskriver først hvordan man isolerer råmembraner fra celler, der overudtrykker MOR1. Bemærk thaDenne protokol er ikke begrænset til overekspressionssystemer og kan påføres mange membrankilder, herunder nativt væv eller præparater, som udtrykker flere receptorer og G-proteiner 15 . Protokollen beskriver derefter hvordan man måler bindingen af en radioaktiv GTP-analog til disse membraner som reaktion på varierende koncentrationer af [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkephalin (DAMGO) eller naloxon, en MOR1-agonist og antagonist, henholdsvis. GTP-analogen, [35S] guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphat ([35S] GTPγS) er ikke hydrolyserbar. Denne egenskab er kritisk, fordi Ga-underenheder udviser egen GTPaseaktivitet 7 og eliminerer det mærkede gammafosfat på en hydrolyserbar GTP-radiokemisk. Membraner fanges derefter på glasfiberfiltre og vaskes, hvorefter den radioaktivt mærkede GTP kvantificeres ved væskescintillationstælling. Flere farmakologiske parametre kan udledes til karakteriseringE receptor-ligand-interaktionen, herunder halv-maksimal respons ( EC50 ) og Hill-koefficient (nH) for agonister og den halv maksimal inhiberende koncentration (IC50) og ligevægt dissociationskonstant (Kb) for antagonister 16 , 17 , 18 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ekspression af rekombinant HA-MOR1 i dyrkede celler
BEMÆRK: Følg alle cellekulturprotokoller i en steril laminarstrømshætte.
- Steriliser cellekulturens laminære strømningshætte med 70% ethanol og opretholde steril teknik i hele cellekulturen.
- Forbered menneskelige embryonale nyreceller 293 (HEK293) cellekulturmedium, komplet Dulbecco's-modificeret Eagle Medium (DMEM): DMEM, pH 7,4, suppleret med 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS ).
- Plad 2,5 x 10 6 HEK293 celler på en 10 cm vævskulturplade i 10 ml fuldstændig DMEM og inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 indtil 70-80% konfluens er nået (O / N).
BEMÆRK: For at indsamle nok protein til et komplet GTP-bindingsforsøg skal du pladen mindst 3 x 10 cm plader af celler. - Transfekter cellerne med HA-MOR1 ved hjælp af et valgt transfektionsreagens og ved at følge producentens 'S retningslinjer. Inkubér i 36-48 timer.
BEMÆRK: Human MOR-1 cDNA (NCBI Reference Sequence: NM_000914.4) var en generøs gave fra Gavril Pasternak og blev klonet ind i pCMV-HA.
2. Cell Fraktionering og Membranopsamling
- Forbered følgende lysisbuffere:
- Buffer 1: 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES), pH 7,4; 1 mM ethylenglycol-bis (P-aminoethylether) -N, N, N ', N'-tetraeddikesyre (EGTA); 10% saccharose; Protease inhibitor cocktail; Og 1 mM dithiothreitol (DTT). Tilsæt DTT frisk på dagen for membranisolering.
- Buffer 2: 10 mM HEPES, pH 7,4; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2; Og 1 mM DTT. Tilsæt DTT frisk på dagen for membranisolering.
- Fjern de transficerede celler fra inkubatoren (trin 1.4), aspirere mediet og skyll cellerne med 5 ml iskold phosphatbufret saltvand (PBS). Aspirere PBS og overskydende væske fratallerkenen.
- Tilsæt 600 μl buffer 1 til cellerne. Brug en celleskraber til at løsne cellerne fra pladeoverfladen og pipette cellesuspensionen i et 1,6 ml mikrocentrifugerør.
- Snør hurtigt mikrocentrifugerøret i flydende nitrogen. Når prøverne er frosset, optøn lysaterne på is eller læg dem ved -80 ° C til langtidsopbevaring.
- Gentag trin 2.3 og 2.4 med alle plader af celler.
- Når først lysaterne er optøet, skal du bruge en enkeltpuls mikro-rørhomogenisator til at bryde cellerne op. Pulse homogenisatoren 3-5 gange i 10 s, placere røret tilbage på is i 30 s mellem pulser.
- Saml 20 μL som helcellefraktion.
- Centrifug den resterende prøve i 10 minutter ved 1000 xg og 4 ° C. Saml supernatanten og sæt i et nyt 1,6 ml mikrocentrifugerør på is.
- Resuspender pelleten i 100 μl buffer 1 og rehomogeniseres med en pestle. Pulse homoGenizer 3-5 gange i 5 s, placerer røret tilbage på is i 30 s mellem pulser.
- Centrifugere prøven en anden gang i 10 minutter ved 1000 xg og 4 ° C. Kombiner supernatanten med supernatanten fra trin 2.7.
BEMÆRK: Den resterende pellet indeholder nukleare og membranproteiner.
- Centrifugere prøven en anden gang i 10 minutter ved 1000 xg og 4 ° C. Kombiner supernatanten med supernatanten fra trin 2.7.
- Centrifuger de kombinerede supernatanter i 20 minutter ved 11.000 xg og 4 ° C. Separat supernatanten (den cytosoliske fraktion) til et nyt 1,6 ml mikrocentrifugerør.
- Resuspender pelleten i 200 μl buffer 2. Homogeniser pelleten ved at triturere den 3-5 gange. Centrifuger prøven i 20 minutter ved 21.100 xg og 4 ° C. Aspirere supernatanten. Resuspender pelleten indeholdende den rå membranfraktion i 50 μl buffer 2.
- Fortsæt straks til GTPγS-bindingsforsøgene (sektion 3) eller snapfrysning i flydende nitrogen og opbevar ved -80 ° C.
3. [35S] GTPγS-binding BEMÆRK: Brug standard radiokemisk sikkerhedsprotokol, når du håndterer [ 35 S] GTPγS og når du fremkalder [ 35 S] GTPγS bindingsforsøg. Brug beskyttelseshandsker og en lab coat altid. Kontroller emballagematerialet for lækager eller revner. Kassér affald og overskydende reagenser i henhold til institutionelle protokoller.
- Forbered ufuldstændig bindingsbuffer (IBB) ved at blande 50 mM HEPES, pH 7,4; 5 mM MgCl2; 100 mM NaCI; Og 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i destilleret vand.
- Fortynd stamme [ 35 S] GTPγS til 50 nM i 10 mM Tris-HCI, pH 7,6 og 10 mM DTT. Lav 500 μl alikvoter og opbevar dem ved -80 ° C. Brug kun en frisk optøet alikvot umiddelbart før forsøget påbegyndes. Optø alikvoterne på is.
- Forbered ikkeradio-mærket GTPγS ved at opløse 1 mg GTPγS-pulver i 177,62 μL rent vand til en bestandskoncentration på 10 mM. Lav 10 μl alikvoter og gem dem på-20 ° C.
- Klargør fuldstændig bindingsbuffer (CBB) ved at supplere IBB for at indbefatte en slutkoncentration på 1 mM DTT, 0,1% (vægt / vol) bovint serumalbumin (BSA), 10 μM BNP og 0,1 nM [35S] GTPγS.
BEMÆRK: CBB indeholder nu radioaktivt mærket GTP. Tag passende sikkerhedsforanstaltninger under arbejdet med radioaktive opløsninger. - Optøn membranfraktionen fra trin 2.11 på is.
- Kvantificer proteinkoncentrationen af membranfraktionen via et Bradford-proteinassay under anvendelse af et spektrofotometer ved 595 nm.
- Forbered en fortyndingsserie af BSA-proteinstandarder med buffer 2 ved en slutkoncentration på 0, 250, 500, 750, 1.500, 2.500 og 5.000 μg / ml.
- Tilsæt 2 μL af hver standard eller membran til 1 ml Bradford reagens i en kuvette. Blandes grundigt ved vortexing.
- Juster spektrofotometeret til en bølgelængde på 595 nm og blankt ved hjælp af kuvetten med 0 μg / ml protein.
- Vent 5 min og rEad hver af standarderne og hver af prøverne ved en 595 nm bølgelængde.
- Plot absorbansen af standarderne i forhold til koncentrationen. Ved anvendelse af øl-lambertloven (A = εcl, hvor ε = ekstinktionskoefficient, l = kuvettens længde og c = koncentration) beregnes koncentrationen af membranprøverne.
- Fortynd membranfraktionerne til en koncentration på 100 μg protein / ml i IBB.
BEMÆRK: En 10 cm skål af HEK293 celler giver typisk mellem 1 og 3 mg protein / ml. - Forbered følgende forsøgsbetingelser i individuelle 1,6 ml mikrocentrifugerør: en ligandfortyndingsserie, en basal aktivitetstilstand til måling af basal GTP-binding og en uspecifik bindende tilstand til måling af uspecifik GTP-binding.
- Til ligandfortyndingsserien fremstilles en fortyndingsserie af liganden af interesse i et slutvolumen på 100 μl CBB. Forbered ligandserien ved 2x den ønskede endelige koncentrations. Placer ligandkoncentrationerne tilstrækkeligt til at dække en række svar.
- For at analysere virkningen af DAMGO på GTP-binding via MOR1 fremstilles DAMGO-fortyndinger på 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM og 2 pM i CBB Volumen: 100 μl).
BEMÆRK: For eksempel, hvis liganden af interesse har en forventet EC50- værdi på 10 μM, fremstilles ligandfortyndinger af 200 nM, 2 μM, 20 μM, 200 μM og 2 mM. Disse fem betingelser dækker en lang række koncentrationer og er 2x den ønskede koncentration til analysen.
- For at analysere virkningen af DAMGO på GTP-binding via MOR1 fremstilles DAMGO-fortyndinger på 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM og 2 pM i CBB Volumen: 100 μl).
- Til basal binding skal der kun fremstilles et rør med 100 μl CBB.
- For ikke-specifik binding skal der fremstilles et rør med 99 μl CBB suppleret med 1 μl 2 mM ikke-radiomærkede GTPγS.
- Til ligandfortyndingsserien fremstilles en fortyndingsserie af liganden af interesse i et slutvolumen på 100 μl CBB. Forbered ligandserien ved 2x den ønskede endelige koncentrations. Placer ligandkoncentrationerne tilstrækkeligt til at dække en række svar.
- Tilsæt 100 μl af den fortyndede membranopløsning (trin 3.7) til hver forsøgsbetingelse.
- Inkuber membranerne med de forskellige eksperimenterEntal betingelser i 1,6 ml mikrocentrifugerør i 30 minutter ved 25 ° C i en termomixer eller på en orbital shaker.
4. Membranfiltrering
- Forbered vaskebuffer ved at kombinere 50 mM Tris-HCI, pH 7,4; 5 mM MgCl2; Og 50 mM NaCl i destilleret vand.
- Presoak glasfiberfiltrene i vand i 10 minutter.
BEMÆRK: Filtre har en porestørrelse på 1 μm, en diameter på 2,1 cm og en tykkelse på 675 μm. - Fjern prøverne fra termomixeren eller kredsløbshakeren (trin 3.10). Puls-centrifuger prøverne i 5 sekunder for at samle hver prøve i bunden af røret.
- Fjern låget i vakuumfiltreringsapparatet. Anbring de foreskrevne filtre på apparatets vakuumporte. Genmonter apparatets låg for at danne en vakuumforsegling. Tænd for vakuumet.
- Pipetter 195 μL af hver 200 μL forsøgsbetingelse på filtre for at minimere fejl fra adsorption til rørets vægge og / eller pipetteTing.
- Vask filtre tre gange med 1 ml iskold vaskebuffer.
5. Flydende scintillationstælling
- Placer 5 ml scintillationstælling hætteglas i et tællestativ. Tilsæt 5 ml scintillationsvæske til hvert hætteglas.
- Sluk for vakuumet (trin 4.4). Fjern låget i vakuumfiltreringsapparatet. Ved hjælp af pincet skal filtrene fjernes fra filtreringsapparatets vakuumporte og dråbe hvert filter i et individuelt 5 ml scintillationsflaske.
- Forbered et hætteglas med 195 μL CBB for at bestemme det maksimale signal.
- Hætt hvert hætteglas sikkert. Inkuber hætteglassene på en orbital shaker ved 25 ° C i 10 minutter.
- Tænd scintillationstælleren. Program scintillationstælleren til at måle 35 S isotopemission i 5 minutter pr. Prøve ved hjælp af det standard-associerede scintillationsprogram.
- Tryk på "Start" for at tælle.
- Når tællingen er færdig, kassér det trukne hætteglasS som farligt affald.
6. Data analyse
- Indtast dataene i statistik og analysesoftware.
- Subtrahere den ikke-specifikke binding fra hver af de andre målinger for at bestemme den specifikke binding.
BEMÆRK: Graden af ikke-specifik binding bestemmes af prøven inkuberet med ikke-radioaktivt mærket GTPγS (trin 3.8.3). - Åbn statistik og analyse software og vælg en XY datasæt post.
- Indtast de specifikke bindingsdata fra [35S] GTPγS-bindingsforsøgene i en datatabel i statistikken og analysesoftwaren. Indtast agonistkoncentrationerne, som molære koncentrationer, i "X" søjlen. Indtast de tilknyttede 35 S-tællinger som "Y" -værdier.
- Subtrahere den ikke-specifikke binding fra hver af de andre målinger for at bestemme den specifikke binding.
- Transform dataene.
- Konverter X-værdierne til deres respektive logaritme ved at klikke på "Analyser". Vælg "Transform" fra den indbyggedeN analyser.
- Vælg "Transform X values using" i dialogboksen "Transform" og vælg funktionen "X = log (X)." Vælg at oprette en ny graf af resultaterne.
- Klik på "OK".
- Normaliser Y-værdierne.
- Når de viste transformerede resultater vises, skal du klikke på "Analyser". Vælg "Normaliser" fra de indbyggede analyser.
- I dialogboksen Normaliser skal du vælge radioknappen for at definere 0% som den "mindste værdi i hvert datasæt" og 100% som den "største værdi i hvert datasæt." Vælg feltet for at præsentere resultaterne som procentdele. Vælg feltet for at oprette en ny graf af resultaterne.
- Klik på "OK".
- Tilpas en ikke-lineær regressionskurver til de plottede data. Udfør en ikke-lineær regressionsanalyse.
- Med de normaliserede resultater vises, klik på "Analyser". Fra de indbyggede analyser, Vælg "Nonlinear regression (kurve fit)."
- Hvis du undersøger en agonist, skal du vælge "log (agonist) vs. normaliseret respons - variabel hældning" fra dialogboksen.
- Hvis du undersøger en antagonist, skal du vælge "log (antagonist) vs. normaliseret respons - variabel hældning" fra dialogboksen.
- Klik på "OK".
- Gennemgå grafen og resultaterne for at sikre, at passform og data er i rimelig aftale. Sørg for, at regressionen svarer til det generelle mønster for de plottede data, og at resterne ikke er så store, at de gør dosisresponskurven flad.
BEMÆRK: Softwaren vil opsummere resultaterne af den ikke-lineære regression og detaljer den koncentration, der fremkalder halv-maksimal respons (EC 50 ), Hill-koefficient (n H ) og halv maksimal hæmmende koncentration (IC 50 ). - Afled agonist / antagonistparameterstyrke.
- Afled agonisten ækIlibriumdissociationskonstanter (Kb) fra en af de følgende forsøg 16 , 17 , 18
- Vurder skiftet i dosisrespons af en agonist i konkurrence med en fast koncentration af antagonist. Her er EC 50 '= EC 50 (1 + [antagonist] / antagonist Kb ), hvor EC 50 ' er den højreforskydte EC 50 .
- Bedøm [ 35 S] GTPγS-binding med varierende koncentrationer af antagonist i konkurrence med en fast koncentration af agonist. Her er Kb = IC50 / (2 + ([agonist] / agonist EC 50 ) n ) 1 / n - 1, hvor n er agonistens Hillkoefficient.
- Afled agonisten ækIlibriumdissociationskonstanter (Kb) fra en af de følgende forsøg 16 , 17 , 18
- Afhængigt af dataens variabilitet gentages eksperimentet (trin 3.8-5.6) for hver ligand ca. 3-5 gange og gennemsnittet resultaterne ved hjælp af en statistik og analyse softwer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellefraktionering kan anvendes til at isolere og berige membranassocierede proteiner fra cytosoliske og nukleare proteiner. Figur 1 er et Western blot, der viser indholdet af de tre primære fraktioner, som kan opsamles under den subcellulære fraktioneringsproces. Specifikt viser figur 1 , at fraktioneringen rent separerer membranproteiner ( dvs. Na + / K + ATPase, proteindisulfidisomerase (PDI) og HA-MOR1) fra histon H2B og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH), nukleare proteiner og cytosoliske proteiner, henholdsvis. Derudover viser figur 1 berigelsen af proteiner (bane 1 sammenlignet med bane 4) i deres respektive subcellulære fraktioner som følge af fraktionering. En repræsentativ Ponceau-plet demonstrerer lige proteinindlæsning i hver fraktion. Det er vigtigt at bemærke, at denne fractiOnation protokol skelner ikke mellem forskellige cellulære membraner. PDI er generelt lokaliseret til det endoplasmatiske retikulum (ER), medens Na + / K + ATPase overvejende er ved plasmamembranen. Imidlertid er begge proteiner til stede i den endelige råmembranfraktion ( figur 1 , bane 4). Mens denne protokol robust adskiller kerneproteiner fra den cytosoliske og endelige membranfraktion ( figur 1 , bane 2-4), indeholder den fraktion beriget for nukleare proteiner nogle membranproteiner ( figur 1 , bane 2), eventuelt fra ER.
Flere farmakologiske parametre kan afledes for at karakterisere en GPCR-ligand interaktion via GTP-bindingsforsøg ( tabel 1 ). For eksempel kan den halv-maksimale respons ( EC50 ) og Hill-koefficienten (nH) af en agonist udledes ved at overvåge GTP-binding iSvar på forskellige doser af agonisten. Figur 3A demonstrerer dosis-responsiv GTP-binding til MOR1 efter DAMGO-behandling. Når dataene passer til en fireparameter ikke-lineær regression, beskriver pasformen en receptor-ligand interaktion med en EC 50 på 185 ± 23 nM og en Hill-koefficient på 0,46 ± 0,06. Den lave GTP-bindende kurve observeret efter DAMGO-behandling indikerer negativ kooperativitet mellem DAMGO og MOR1. Denne metode kan også identificere og beskrive farmakologien af en antagonist. Som figur 3A og B illustrerer, er naloxon en MOR1-antagonist. Agoniststyrken (Kb) af naloxon, 97 ± 20 nM, blev bestemt ved at variere koncentrationen af naloxon i konkurrence med en fast koncentration af DAMGO ( figur 3A ). Naloxon udviste en Hill-koefficient på 0,88 ± 0,06, hvilket tyder på uafhængig binding mellem naloxon og MOR1. Hvis acTion af en ligand er ukendt, kan dette assay diskriminere mellem en agonist, antagonist og invers agonist. Hvis liganden er en agonist, ville der være en stigning i GTP-binding, som i figur 3A , efter DAMGO-applikation. Hvis liganden er en invers agonist, ville der være formindsket binding af GTP i forhold til basal binding. Hvis liganden er en antagonist, ville der ikke være nogen virkning ved behandling med ligand alene. Hvis det anvendes samtidigt med en agonist, ville en antagonist hæmme agonistens evne til at stimulere GTP-binding. Figur 3A illustrerer antagonistaktiviteten af naloxon imod agonisten DAMGO.
Figur 1: Cellulær fraktionering adskiller membranassocierede, nukleare og cytosoliske proteiner. ( Top ) Lane 1 repræsentererProtein til stede i hele cellen. Bane 2 indeholder nukleare og membranassocierede proteiner adskilt under de første centrifugeringstrin. Bane 3 er den cytosoliske fraktion separeret efter 20 minutters centrifugering ved 11.000 x g. Bane 4 indeholder en rå membranfraktion egnet til [35S] GTPγS-bindingsforsøg. ( Nederste ) Ponceau-plet af en vestlig membran demonstrerer proteinbelastning for hver cellulær fraktion. De følgende antistoffer blev anvendt til immunblotting: mus anti-Na + / K + -ATPase (1: 1000), mus anti-GAPDH (1: 5000), mus anti-H2B (1: 2.500), kanin anti-PDI : 1.000) og rotte anti-HA (1: 2000). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Flowdiagram, der beskriver fraktionen og [35S] GTPγS-bindingsproceduren. Først transfekterer cellerne for at udtrykke GPCR af interesse. Efter 48 timer høstes og fraktioneres cellerne for at isolere receptoren (rød) og tilhørende G-proteiner (grøn = G α , lilla = G β og orange = G γ ). For at udføre GTP-bindingsforsøg tilsættes [35S] GTPγS og inkuberer membranerne med liganden af interesse. For at måle G-proteinaktivitet binder membranerne til et filter for at vaske bort ubundet radiokemisk og derefter kvantificere de bundne [35S] GTPyS ved væskescintillationstælling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Agonisme aNd-antagonisme ved μ-opioidreceptorer Defineret ved [35S] GTPγS-binding. ( A ) [ 35 S] GTPγS dosisresponsskurve til DAMGO alene (blå) eller naloxon i konkurrence med 2,5 μM DAMGO (grøn). [35S] GTPγS-binding normaliseredes til den maksimale stimulering i hvert forsøg og blev udtrykt som en procentdel. De viste punkter er middelværdien af triplikatbestemmelser og udtrykkes som den gennemsnitlige ± SEM ( B ) -antagonisme af DAMGO-stimuleret [35S] GTPγS Bindende af naloxon. [35S] GTPγS Binding blev kvantificeret efter tilsætningen af alene naloxon (100 μM), DAMGO alene (10 μM) eller DAMGO (10 μM) i konkurrence med naloxon (100 μM). Resultaterne udtrykkes som middelværdien ± SEM af tre uafhængige forsøg. Venligst klik på hanIgen for at se en større version af denne figur.
| ligand | EC50 eller IC50 (nM) | N H | Kb (nM) |
| DAMGO | 185 ± 23 | 0,46 ± 0,06 | |
| Naloxon | 420 ± 87 | 0,88 ± 0,06 | 97 ± 20 |
Tabel 1: Farmakologiske parametre af DAMGO og naloxonaktivitet ved μ-opioidreceptorer. Den halvmaksimale respons ( EC50 ) og Hill-koefficienten (nH) for DAMGO blev afledt af [35S] GTPγS-binding som svar på forskellige doser af DAMGO. Den halv-maksimale inhiberende koncentration(IC50) og ligevægtsdissociationskonstanten (Kb) for naloxon blev bestemt ud fra effekten af konkurrence mellem naloxon og 2,5 μM DAMGO på [35S] GTPγS-binding. Resultaterne udtrykkes som middelværdien ± SEM af tre uafhængige forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreliggende protokol beskriver to separate, men komplementære metoder: En simpel tilgang til fraktionering af celler og væv i brede, men særskilte rum og et middel til at undersøge GPCR-signalering ved at måle [35S] GTPγS-binding.
Effektiv cellulær fraktionering har en bred vifte af anvendelser, der spænder fra udvinding og berigelse af proteiner til vurdering af subcellulær lokalisering af proteiner til undersøgelse af receptorfarmakologi. Selv om alternative tilgange til fraktionering af celler og væv eksisterer, er den her præsenterede protokol forholdsvis billigere, hurtigere og enklere. I modsætning til mere etablerede metoder er denne metode imidlertid ikke i stand til at skille adskilt plasmamembranassocierede proteiner fra andre membranholdige rum, såsom endosomer eller ER. Det skal også bemærkes, at mens ovennævnte protokol anvender et forbigående overekspressionssystem til dannelse af cellemembraner indeholdende GPCR'en afInteresse, er denne protokol kompatibel med stabile overekspressionssystemer såvel som med animalsk eller humant væv 19 .
Prøveforberedelse er kritisk for at maksimere fraktionens udbytte og renhed. Det er især vigtigt at sikre fuldstændig homogenisering og minimere overgangstider mellem centrifugeringstrin. Ved anvendelse af en pellethomogenisator / pestle for fuldstændigt at forstyrre cellemembranen øges det rå membranudbytte væsentligt i den endelige cellefraktion. Hvis membranudbyttet er for lavt, ville de to enkleste løsninger være at opskalere den oprindelige cellekultur og / eller at homogenisere cellepellet et par gange mere. Hvis individuelle fraktioner viser en høj urenhed, reduceres overgangstiderne mellem centrifugering og separation. Lad ikke prøverne sidde efter centrifugering, da proteiner kan diffunderes i prøven og reducere fraktionens renhed.
Filtrationsbaseret [35S] GTPyS-binding er en hurtig og kvantitativ metode til måling af aktiveringen af G-proteiner under anvendelse af den associerede receptor. Måling af GTP-binding muliggør en mere kvantitativ måling af GPCR-aktivitet, end det generelt er muligt ved overvågning af downstream-processer. Der er imidlertid to kritiske begrænsninger for metoden beskrevet her. Vigtigst er, at filtreringsbaseret [35S] GTPγS-kvantificering ikke er lige mulig med alle G a- isoformer 20 , 21 . Generelt er denne metode begrænset til G i / o- koblede GPCR'er som MOR1 22 . G s- og G q- koblede receptorer har tendens til at være mindre følsomme. Dette skyldes sandsynligvis kombinationen af den lavere overflod af G s / G q og deres relativt langsommere nukleotid-vekselkurs, hvilket gør det vanskeligt at skelne ægte [ 35 S] GTPγS-binding over baggrunden. Denne begrænsning er blevet behandlet els Engang ved anvendelse af G-protein-antistoffangstteknikker 20 . Nogle grupper har fundet, at eliminering af BNP fra reaktionen forbedrer signal-støjforholdet for G s- eller G q- koblede receptorer 23 . Den anden begrænsning er membranfølsomheden over for lipofile agonister eller overfladeaktive stoffer. [35S] GTPγS assays kræver funktionelle receptor-G-proteinkomplekser, og tilsætningen af lipofile molekyler til reaktionssystemet kan forstyrre strukturen af membranerne eller disse komplekser. Hvis dette er en potentiel bekymring, kan det være fordelagtigt at teste om reagens af interesse afbryder [35S] GTPγS-binding i et allerede velkendetegnet system, såsom i DAMGO-medieret MOR1-stimulering. Andre betingelser for at overveje optimering indbefatter bindingsbufferens pH, koncentrationerne af Mg2 + og NaCl, proteinkoncentrationen og inkubationstiden 23 ,Ef "> 24.
Denne protokol fokuserede på en velkendetegnet GPCR, MOR1 og velkalkulerede lægemidler, DAMGO (agonist) og naloxon (antagonist), der handler om MOR1. En af fordelene ved denne teknik er imidlertid, at den kan anvendes til at karakterisere ukendte ligander som agonister, antagonister eller inverse agonister afhængigt af hvordan liganden modulerer GTP-binding. Ved udformning af eksperimenter er det kritisk at anvende en række koncentrationer af liganden af interesse og være opmærksomme på rækkevidden af resultater: agonister vil forårsage en forøgelse af GTP-bindingen over baseline, inverse agonister vil medføre et fald i GTP-binding i forhold til Baseline, og antagonister vil have ringe eller ingen effekt, når de tilsættes isoleret på baseline GTP-binding.
Sammenfattende beskriver denne protokol en teknik til udførelse af subcellulær fraktionering, indsamling af råmembranpræparater og undersøgelse af GPCR-aktivering ved måling af [35S] GTPγS-binding. Disse teknikker kan let tilpasses til en række cellekultur- og vævsmodeller for at studere farmakologien hos en af de vigtigste receptorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health grant DA-000266 og Medicinsk Videnskabsuddannelsesprogram T32 grant (CV, NWZ, og PCS). Forfatterne vil også gerne anerkende somersault18: 24 (somersault1824.com) for biblioteket for videnskab og medicinske illustrationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 10313021 | Warm in a 37°C water bath before use |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Warm in a 37°C water bath before use |
| Cell culture 10 cm plate | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| 1.6 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 2900 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DO632 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028-1 | |
| Pellet pestles motor | Sigma-Aldrich | Z359971 | |
| Pestles | Bel Art | F19923-0001 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Affymetrix | 10857 | |
| [35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS) | Perkin Elmer | NEG030H | |
| nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS) | Sigma-Aldrich | 89378 | |
| guanosine diphosphate (GDP) | Sigma-Aldrich | 51060 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| UV/VIS spectrophotometer | Beckman Coulter | DU640 | |
| spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 | |
| orbital shaker | Thermo Fisher Scientific | 2314 | |
| thermomixer | Eppendorf | 535027903 | |
| glass fiber filters | GE Healthcare Life Sciences | 1821-021 | |
| vacuum filtration apparatus | Millipore Corporation | XX2702550 | |
| desktop microcentrifuge | Eppendorf | 65717 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| scintillation fluid | Ecoscint A | LS-273 | |
| scintillation counter vials | Beckman Coulter | 592690 | |
| scintillation vial lids | Beckman Coulter | 592928 | |
| Prism 6 | GraphPad Software | PRISM 6 | |
| ATP1A1 antibody | Developmental Studies Hybridoma | a6F | 1:1000 in 3% BSA |
| GAPDH antibody | EMD Millipore | CB1001 | 1:5000 in 3% BSA |
| H2B antibody | Cell Signaling | 2934S | 1:2500 in 3% BSA |
| PDI antibody | Cell Signaling | 3501S | 1:1000 in 3% BSA |
| HA antibody | Roche | 11867423001 | 1:2000 in 3% BSA |
References
- Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (4), 794-807 (2007).
- Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238 (4827), New York, NY. 650-656 (1987).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), New York, NY. 739-745 (2000).
- Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80 (2), 249-257 (1995).
- Londos, C., Salomon, Y. 5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (8), 3087-3090 (1974).
- Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252 (20), 6966-6969 (1977).
- Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (11), 3173-3177 (1983).
- Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21 (12), 3014-3022 (1982).
- Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), New York, NY. 1547-1550 (1990).
- Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308 (5721), New York, NY. 512-517 (2005).
- Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25 (8), 413-422 (2004).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22 (23), 3099-3108 (1973).
- Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109 (4), 1110-1119 (1993).
- Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. , Springer. 55-65 (2011).
- Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325 (3), 869-874 (2008).
- Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24 (2), 87-90 (2003).
- Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74 (4), 489-508 (2003).
- Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47 (4), 848-854 (1995).
- GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , (2004).
- Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).
