Summary
Utilizou-se homogeneização simples para preparar novas nanopartículas imitando lipoproteínas de alta densidade para encapsular o factor de crescimento nervoso. Desafios, protocolos detalhados para a preparação de nanopartículas, caracterização in vitro e estudos in vivo são descritos neste artigo.
Abstract
O objetivo deste artigo é introduzir métodos de preparação e caracterização de nanopartículas (NPs) de nanopartículas de alta densidade, lipoproteínas (NPs) carregadas com fator de crescimento nervoso (NGF). As HDLs são NPs endógenas e foram exploradas como veículos para a administração de agentes terapêuticos. Vários métodos foram desenvolvidos para preparar NPs que imitam o HDL. No entanto, eles são geralmente complicados, demorados e difíceis para a escala industrial up. Neste estudo, a homogeneização em uma etapa foi utilizada para misturar os excipientes e formar o protótipo NPs. O NGF é uma proteína solúvel em água de 26 kDa. Para facilitar a encapsulação de NGF no ambiente lipídico de NPs que imitam HDL, utilizou-se protamina USP para formar um complexo de pares de iões com NGF para neutralizar as cargas na superfície de NGF. O NGF / complexo de protamina foi então introduzido no protótipo NPs. A apolipoproteína AI foi finalmente revestida na superfície dos NPs. NGF HDL imitando NPs mostraram propriedades preferíveis em termosS de tamanho de partícula, distribuição de tamanho, eficiência de aprisionamento, liberação in vitro , bioatividade e biodistribuição. Com o cuidadoso desenho e exploração da homogeneização em NPs que imitam HDL, o procedimento foi grandemente simplificado e as NPs foram feitas escalonáveis. Além disso, foram superados vários desafios, como separar o NGF não carregado dos NPs, realizar estudos confiáveis de liberação in vitro e medir a bioatividade dos NPs.
Introduction
As macromoléculas, como proteínas, peptídeos e ácidos nucleicos, têm emergido como medicamentos promissores e ganharam considerável atenção nas últimas décadas 1 , 2 . Devido à sua alta eficácia e modos de ação específicos, eles apresentam grande potencial terapêutico para os tratamentos de câncer, doenças imunes, HIV, e condições relacionadas 3 , 4 . No entanto, as propriedades físico-químicas, tais como o seu grande tamanho molecular, estrutura tridimensional, cargas de superfície e natureza hidrofílica, tornam a introdução in vivo destas macromoléculas muito desafiadora. Isto dificulta consideravelmente o seu uso clínico 4 . Avanços recentes em sistemas de libertação de fármacos, tais como micropartículas, nanopartículas de polímero (NPs), lipossomas e NPs lipídicos superaram estes desafios e melhoraram significativamente a administração in vivo de macromoléculas. HoAlgumas desvantagens quanto a estas cargas de entrega foram reveladas, incluindo baixa capacidade de carga de droga, baixa eficiência de aprisionamento, meia-vida curta, perda de bioatividade e efeitos colaterais indesejáveis 5 , 6 , 7 , 8 . Sistemas portadores eficazes continuam a ser uma área de interesse de pesquisa. Além disso, o desenvolvimento de métodos analíticos para caracterizar NPs carregados de fármaco é mais desafiador para macromoléculas do que para moléculas pequenas.
A lipoproteína de alta densidade (HDL) é um NP natural composto de um núcleo lipídico que é revestido por apolipoproteínas e uma monocamada de fosfolípidos. O HDL endógeno desempenha um papel crítico no transporte de lípidos, proteínas e ácidos nucleicos através da sua interacção com receptores alvo, tais como SR-BI, ABCAI e ABCG1. Foi explorado como um veículo para a distribuição de diferentes agentes terapêuticos 9, 10 , 11 , 12 . Vários métodos foram desenvolvidos para preparar NPs que imitam o HDL. A diálise é uma abordagem popular. Neste método, os NPs são formados por hidratação de um filme lipídico utilizando solução de colato de sódio. O sal é então removido através de uma diálise de 2 dias com três tampões 13 . Os métodos de sonicação fabricam NPs por sonicação de uma mistura de lípidos durante 60 min sob uma condição de aquecimento; As NPs são ainda purificadas através de cromatografia em gel 14 . Microfluídica gera NPs através de um dispositivo microfluídico, que mistura fosfolipídios e apolipoproteína AI (Apo AI) soluções, criando microvórtices em um padrão de focalização [ 15] . Claramente, estes métodos podem ser demorados, duros, e difíceis para o scale-up industrial.
Neste artigo, apresentamos a preparação e caracterização de novos NPs simuladores de HDL paraEncapsulamento de factor de crescimento (NGF). O NGF é um homodímero de polipéptido ligado por dissulfureto contendo dois monómeros de polipéptido de 13,6 kDa. Foi desenvolvido um novo procedimento para preparar as NPs por homogeneização, seguido pela encapsulação de NGF nas NPs. As NPs simuladoras de HDL de NGF foram caracterizadas quanto ao tamanho de partícula, distribuição de tamanho, potencial zeta e libertação in vitro . A sua bioactividade foi avaliada quanto ao crescimento de neurites em células PC12. A biodistribuição de NGF HDL-imitando NPs foi comparada com a de NGF livre após injecção intravenosa em ratinhos.
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Protocol
NOTA: Os estudos em animais incluídos em todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Norte de Texas.
1. Preparação de nanopartículas NGF HDL-imitando
- Dissolver os excipientes, fosfatidilcolina (PC), esfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), oleato de colesterilo (CO) e succinato de D-α-tocoferil polietilenoglicol (TPGS), em etanol para preparar soluções-mãe a 1 mg / mL.
NOTA: As soluções stock foram aliquotadas e armazenadas a -20 ° C. O oleato de colesterilo foi armazenado em garrafas escuras. As soluções mãe PC, SM, PS e CO foram estáveis até 6, 3, 12 e 12 meses, respectivamente, a -20 ° C. A solução de TPGS foi estável durante pelo menos 12 meses a -20 ° C. - Misturar 10 μL de NGF (1 mg / mL em água) com 10 μL de protamina USP (1 mg / mL em água) num tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e deixar repousar durante 10 minutos à temperatura ambiente paraForma o complexo.
NOTA: As soluções stock de NGF e protamina foram aliquotadas e armazenadas a -20 ° C. O congelamento e descongelamento repetidos não são recomendados para o stock de NGF. - Adicionar 59 μL de PC, 11 μL de SM, 4 μL de PS, 15 μL de CO e 45 μL de TPGS num frasco de vidro. Misturar e evaporar o etanol sob uma corrente de azoto suave durante cerca de 5 min; Todos os excipientes devem formar uma película fina e oleosa na parte inferior do frasco de vidro.
- Adicionar 1 mL de água ultrapura (tipo 1) ao frasco e homogeneizar a 9.500 rpm (8.600 xg) durante 5 min à temperatura ambiente para formar o protótipo NPs.
- Adicionar o complexo preparado no passo 1.2 ao protótipo de NPs e incubar a 37 ° C durante 30 min com agitação utilizando uma pequena barra de agitação no frasco de vidro.
- Arrefecer os NPs por agitação à temperatura ambiente durante mais 30 min. Após esta arrefecer, adicionar 106 μL de Apo AI (1,49 mg / mL) e agitar à temperatura ambiente durante a noite para formar a solução finalNGF HDL imitando NPs.
2. Caracterização de nanopartículas NGF HDL-imitando
- Medir o tamanho de partícula eo potencial zeta usando um analisador de partículas (veja a Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
- Utiliza-se uma coluna de cromatografia de filtração em gel de agarose reticulada para separar o NGF não carregado das NPs que imitam o HDL de NGF e determinar a eficiência de retenção do NGF.
- Para a preparação da coluna, transferir 15 mL de suspensão de Sepharose 4B-CL para um copo de 50 mL. Agitar a suspensão de pérolas usando uma haste de vidro e despejar um pouco em uma coluna (30 cm de comprimento x 1 cm de diâmetro, com uma frita de vidro na parte inferior). Toque suavemente a coluna para se livrar das bolhas. Permitir que o solvente para drenar e as pérolas para resolver por alguns minutos.
- Continue adicionando a suspensão restante. Enxágüe a parede interna da coluna para limpar os grânulos. Drenar o solvente até o nível de solvente ser ligeiramenteBove o topo da fase estacionária. Lavar e condicionar a coluna com 20 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS, contendo NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM e KH2PO4 2 mM).
- Para determinar as fracções contendo NGF não carregado, introduzir 200 μL de solução de NGF (10 μg / mL) na coluna de filtração em gel (25 cm de comprimento x 1 cm de diâmetro) e eluir com 1x PBS.
- Recolher um total de 12 fracções (1 mL para cada fracção) e medir a concentração de NGF em cada fracção utilizando um kit ELISA de Sandwich para NGF.
- Detectar NGF a partir das fracções 6 a 10 utilizando o kit Sandwich ELISA. Obter um cromatograma de NGF não carregado na coluna. Lavar a coluna com 20 mL de PBS.
- Para determinar as fracções contendo NPs que imitam o HDL de NGF, carregue 200 μL dos NPs sobre a coluna e elui-se com 1x PBS. Recolher um total de 12 frações (1 mL para cada fração) e medir a intensidade de partículas em cada fração uO analisador de tamanho de partícula. Detectar os NGF NPs das fracções 2 a 4.
NOTA: A intensidade é um parâmetro medido pelo analisador de partículas, que indica quantas nanopartículas podem existir na solução de teste. Quanto mais NPs existem em solução, maior a intensidade é. Por esta abordagem, podemos confirmar que a coluna pode separar NGF NPs de NGF não carregado. - Para medir a eficiência de retenção de NGF, carregue 200 μL de NPs que imitam o NGF HDL para a coluna e elui-se com 1x PBS. Recolher um total de 12 fracções (1 mL para cada fracção).
- Medir a concentração de NGF não descarregada das fracções 6 a 10 utilizando o kit Sandwich ELISA.
- Adicionar as quantidades de NGF medidas a partir das fracções 6 a 10 juntas como o NGF não carregado e calcular a eficiência de retenção de NGF utilizando a equação seguinte.
% EE = (1 - NGF não carregado / NGF total adicionado ao NP) x 100% Equação (1)
3. Libertação in vitro de NGF HDL-mimicando nanopartículas
- Estudo de NGF livre (10 μg / mL em água, n = 4) e NGF HDL imitando NPs (10 μg / mL, n = 4) em paralelo.
- Pre-treat 8 tubos de diálise (peso molecular de corte: 300 kDa), seguindo as instruções do fabricante.
- Preparar 5% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS como meio de libertação. Adicionar 30 mL de meio de libertação a um tubo de centrífuga de 50 mL e aquecer até 37 ° C num agitador com uma velocidade de agitação de 135 rpm. Coloque mais 50 ml de meio de liberação no agitador para substituição.
- Adicionar 400 μL de meio de libertação ao tubo de diálise e adicionar rapidamente 200 μL da amostra testada para obter volume suficiente para diálise.
- Feche o tubo e coloque rapidamente o tubo de diálise no meio de libertação (o tubo de centrífuga). Retire rapidamente 100 μL do meio de libertação do tubo de diálise exterior como amostra para o tempo 0. Coloque imediatamente a amostra em -20 ° C para análise posterior. Adicionar 100 μL deLeasing no tubo de centrifugação para substituir a amostra retirada. Inicie o temporizador.
- A 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 e 72 h, retirar 100 μL do meio de libertação e substituí-lo por 100 μL de meio fresco. Colocar imediatamente as amostras retiradas em -20 ° C para análise posterior.
- Após 72 h, retirar todas as amostras de -20 ° C e descongelá-las à temperatura ambiente. Meça as concentrações de NGF das amostras de libertação utilizando o kit Sandwich ELISA.
4. Bioatividade de nanopartículas que simulam HDL de NGF (Estudo de Crescimento de Neurite)
- Células PC12 de cultura em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro de cavalo inactivado pelo calor, 5% de soro de bovino fetal, 100 μg / mL de estreptomicina e 100 unidades / mL de penicilina. Manter as células numa incubadora humidificada a 37 ° C e com 5% de CO2.
- Quando as células atingem ~ 70-80% de confluência, remover o meio de cultura e lavar as células com 1x PBS (aproximadamente 2 mL por 10 cm <Sup> 2 área de superfície de cultura). Remover a solução de lavagem. Trypsinize as células por adição de 0,25% de solução de tripsina-EDTA (0,25% de tripsina e 1 mM EDTA, 0,5 mL por 10 cm 2 área de superfície de cultura) para o frasco e incubar a 37 ° C até a maioria das células são destacados.
- Adicionar dois volumes de meio de cultura e girar para baixo a 180 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 5 mL de meio de cultura. Filtrar as células através de uma agulha de 22 G, ½ polegada para quebrar clusters de células.
- Dividir as células numa proporção de 1: 3 num novo frasco de cultura de células. Após incubação durante a noite, remover as células PC12 não ligadas. Permitir que as células anexadas para permanecer para o crescimento.
- Repita este procedimento para 3 passagens para selecionar a subcultura de PC12 que tem uma forte propriedade de adesão. Pré-revestir uma placa de 6 poços com 800 μL / poço de colágeno de cauda de rato tipo I (100 μg / mL).
- Trypsinize as células PC12 selecionadas como descrito no passo 4.2 e filtrá-las através de um22 G, agulha de ½ polegada para quebrar os aglomerados de células. Conte as células com um hemocitômetro. Semear as células durante a noite a uma densidade de 10.000 células / poço na placa de 6 poços pré-revestida no passo 4.5 para permitir que as células se liguem à placa.
- Diluir NPs (10 μg / mL) com NGF livre (10 μg / mL) e NGF HDL com o meio de cultura (descrito no passo 4.1) para preparar concentrações de 0,5, 1, 5, 10, 50 e 100 ng / mL. Remover 2 mL de meio de cada poço e substituir com 2 mL do NGF livre diluído ou NGF HDL imitando NPs. Cultura durante 4 dias.
- No dia 4, mude o meio para meio fresco (descrito no passo 4.1) contendo o tratamento correspondente e continue o tratamento durante mais 3 dias.
- No dia 7, visualize as células com um microscópio de luz invertida e imagem cada poço em pontos aleatórios sob ampliação 10X.
5. Biodistribuição de nanopartículas NGF HDL-imitando
- Utilizar ratos BALB / c adultos (macho, 25-30 g) para tÉ a distribuição tecidual de NGF NPs. Distribua aleatoriamente os ratinhos em três grupos de 3 ratinhos por grupo. Use um sistema de retenção em forma de cone plástico ( por exemplo, decapicone) para restringir um mouse e limpe a cauda com etanol para promover a vasodilatação ea visibilidade da veia.
- Injectar 100 μL de NPs de solução salina, NGF livre ou NGF HDL-imitando cada grupo de ratinhos (3 grupos) através das veias da cauda numa dose de 40 μg / kg de NGF. Use uma agulha de 30½ G presa a uma seringa de 1 mL.
- Aos 30 minutos após a injecção, anestesiar os ratinhos utilizando isoflurano inalado a 3% (em oxigénio a uma taxa de fluxo de 2 L / min). Executar uma pinça de cauda e dedo do pé para determinar a profundidade da anestesia. Recolher sangue por punção cardíaca.
- Retirar aproximadamente 1 mL de sangue do coração. Eutanizar cada rato por deslocamento cervical.
- Coloque a carcaça do mouse em decúbito dorsal. Abra o abdômen com tesoura cirúrgica e mova a gordura eo intestino de ladoUsando um cotonete para expor o fígado, baço e rim. Colher estes tecidos e enxaguá-los em 1x PBS para limpar o sangue.
- Centrifugar imediatamente as amostras de sangue a 3,400 xg e 4 ° C durante 5 min para se obter o plasma. Armazenar o plasma e tecidos a -80 ° C até as análises.
- Para analisar as amostras de tecido, mover as amostras de -80 ° C para 4 ° C e suspender 100 mg de amostra de tecido num volume 10x de tampão de extracção (acetato de sódio 0,05 M, cloreto de sódio 1,0 M, 1% de triton X-100, 1% de BSA, 0,2 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo e 0,2 mM de cloreto de benzetónio). Homogeneizar a 10 000 rpm e 4 ° C durante 5 min.
- Sacrifique dois ratinhos não tratados para recolher plasma e tecidos em branco, como descrito nos passos 5.3 e 5.4. Preparar soluções padronizadas de NGF utilizando homogeneizados de plasma em branco ou de tecido em branco.
- Determine as concentrações de NGF nos homogeneizados de plasma e de tecido utilizando o kit ELISA de Sandwich, como descrito acima.
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Representative Results
O esquema de engenharia de NGF NPs revestidos com α-tocoferol, imitando o HDL, preparado por uma estratégia de pares de iões é mostrado na Figura 1 . Para neutralizar as cargas superficiais de NGF, utilizou-se a protamina USP como um agente de pares de iões para formar um complexo com NGF. Para proteger a bioatividade, os protótipos de NPs simuladores de HDL foram projetados, primeiro usando homogeneização; Depois, o complexo NGF / protamina foi encapsulado no protótipo NPs. A homogeneização proporcionou energia suficiente e promoveu com sucesso a mistura dos excipientes. Após uma homogeneização de 3 min, obtiveram-se tamanhos de partícula consistentes (cerca de 170 nm) para os protótipos NP ( Figura 2 ). Apo AI foi incubada com o protótipo de NP em diferentes condições, incluindo 2 h de agitação à temperatura ambiente; 4 h de agitação à temperatura ambiente; 4 h de agitação à temperatura ambiente, seguido por incubação durante a noite a 4 ° C; E agitação à temperatura ambienteNoite Mais de 26% de Apo AI foram incorporados nos NPs quando agitados à temperatura ambiente de um dia para o outro. Para adicionar o complexo NGF-protamina, o complexo foi incubado com o protótipo NPs durante 30 min a 37 ° C e depois adicionou-se Apo AI à mistura para terminar o revestimento final de Apo AI na superfície dos NPs. Utilizando o procedimento aqui descrito, as NPs de NGF HDL-imitando finais tinham tamanhos de partícula de 171,4 ± 6,6 nm (n = 3), com 65,9% de eficiência de aprisionamento de NGF ( Tabela 1 ). NGF HDL imitando NPs tinha uma ligeira carga negativa ( Tabela 1 ). As NPs tinham uma distribuição de tamanho estreita, e a incorporação de NGF nas NPs não afectou o tamanho de partícula ( Figura 3 ).
Para medir a eficiência de retenção de NGF, foram avaliados vários métodos para separar o NGF não descarregado das NPs que imitam o HGN de NGF. Inesperadamente, o NGF não pode passar por um filtro de separação (limite de peso molecular: 100 kDa). GelAs colunas de filtração, incluindo Sephadex G-50, Sephadex G-100 e Sephacryl S-100, não podem separar NGF descarregado e NGF HDL-imitando NPs, uma vez que ambos saem nas mesmas fracções após eluição. Uma coluna de Sepharose CL-4B realizou a separação com a carga de amostra optimizada, tampão de eluição e taxa de eluição. Conforme ilustrado na Figura 4 , as NPs de NGF e NGF HDL sem carga foram completamente separadas numa coluna de Sepharose CL-4B.
Utilizou-se um método de diálise para estudar a libertação in vitro de NPs imitando NGF-HDL em PBS com BSA a 5%, o qual foi incluído para imitar as condições fisiológicas no sangue. Ao aumentar o tamanho do dispositivo de diálise (limite de peso molecular: 300 kDa) e adicionando PBS e BSA ao meio de libertação, o NGF não se ligou com a membrana de diálise e livremente passou. Como resultado, a recuperação de NGF livre neste método de diálise foi superior a 85% ( Figura 5 ). NGFAs NPs que imitam o HDL apresentaram um perfil de libertação lenta, e cerca de 10% do NGF foi libertado das NPs durante 72 h ( Figura 5 ).
Para testar a bioactividade de NGF HDL imitando NPs, a subcultura de células PC12 que tinha uma forte propriedade de adesão foi selecionada para conduzir um neurite crescimento outgrowth. A Figura 6 representa a imagiologia do crescimento de neurites quando as células foram tratadas com 50 ng / mL de NGF livre ( Figura 6A ) e NGF HDL-imitando NPs ( Figura 6B ). Quando a concentração de tratamento era superior a 10 ng / mL, o crescimento de neurites foi claramente observado pelo microscópio. Nestas concentrações elevadas, NGF livre e NGF HDL-imitando NPs não mostraram uma diferença significativa no efeito de neurite outgrowth. Quando a concentração de NGF foi inferior a 10 ng / mL, o crescimento de neurites não pôde ser claramente observado, quer para NGF livre quer para NGF que imitam NPHs. BiodistribuiçãoUdies foram realizadas para comparar os comportamentos in vivo de livre NGF e NGF HDL imitando NPs. Conforme mostrado na Figura 7 , NGF HDL imitando NPs aumentou significativamente a concentração plasmática e diminuiu a captação no fígado, rim e baço.
Figura 1: Esquema de engenharia das nanopartículas simuladoras de NGF HDL preparadas por uma estratégia de pares de iões. O NGF é uma molécula hidrofílica carregada negativamente. Um péptido catiónico, protamina, foi usado para neutralizar as cargas e formou um complexo de pares de iões com NGF. Oleato de colesterol, fosfolípidos e TPGS formaram protótipos NPs de auto-montagem por homogeneização. O complexo NGF / protamina foi incorporado no protótipo NPs. Finalmente, a Apo AI foi revestida na superfície NP após incubação durante a noite. Esta figura foi modificada de Prathipati et al. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A influência da homogeneização sobre o tamanho de partícula das nanopartículas protótipo. Os excipientes PC, SM, PS, CO e TPGS, que foram dissolvidos em etanol, foram adicionados a frascos de vidro, e o solvente foi evaporado sob uma corrente de N2. Adicionou-se 1 mL de água e homogeneizou-se a 9.500 rpm durante diferentes tempos. Os tamanhos de partícula das nanopartículas subsequentes foram medidos. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (n = 4). Esta figura foi modificada de Prathipati et al. 16 . Por favor cliCk aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Tamanho de partícula e distribuição de tamanho de nanopartículas de imitação de HDL em branco e nanopartículas que simulam NGF HDL. Os tamanhos de partícula e as distribuições foram medidos utilizando um analisador de partículas. Esta figura foi modificada de Prathipati et al. 16 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Cromatogramas de nanopartículas NGF e NGF HDL-imitando livres numa coluna de Sepharose CL-4B eluída por PBS. 200 μL de solução de NGF livre (10 μg / mL) e solução de NGF NP foram carregados em tEm coluna de filtração em gel e eluiu-se com 1x PBS. Um total de doze fracções (1 mL para cada fracção) foram recolhidos para ambas as amostras. A intensidade de NP em cada fracção foi medida por um analisador de partículas e a concentração de NGF em cada fracção foi medida usando um kit de ELISA Sandwich. Esta figura foi modificada de Prathipati et al. 16 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Libertação in vitro de nanopartículas simuladoras de NGF HDL medidas por um método de diálise. Utilizou-se PBS com 5% de BSA como meio de libertação. 200 μL de solução de NGF livre (10 μg / mL) ou NGF NP foram adicionados a um tubo de diálise suplementado com 400 μL do meio de libertação. O tubo de diálise foi colocado em 30 mL de meio de libertação pré-aquecido. O estudo foi realizado a 37 ° C com agitação de 135 rpm. A 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 e 72 h, retirou-se 100 μL do meio de libertação e substituiu-se por 100 μL de meio fresco. A concentração de NGF em cada amostra foi medida usando um kit de ELISA Sandwich. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão (n = 4). Esta figura foi modificada de Prathipati et al. 16 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: A influência de NGF HDL-imitando nanopartículas no crescimento neurite em células PC12. As células foram tratadas com 50 ng / mL de NGF ( A ) livre D NGF nanopartículas que mimetizam HDL ( B ) durante 7 dias. A neurite foi fotografada utilizando um microscópio de luz invertida sob ampliação 10X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Comparação da biodistribuição entre nanopartículas NGF e NGF HDL-mímicas livres em ratinhos (n = 3). Os ratinhos foram administrados com 40 mg / kg de NGF por injecção na veia da cauda e sacrificados aos 30 min após a administração. O sangue, fígado, baço e rim foram recolhidos, e a concentração de NGF em cada amostra foi medida utilizando um kit de ELISA Sandwich. Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão. Esta figura foi modificada de Prathipati et al. 16 ."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55584/55584fig7large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
| Amostra | Tamanho de partícula (nm) | PI | EE% de NGF | Potencial Zeta (mV) |
| NGF HDL imitando NPs | 171,4 ± 6,6 | 0,239 ± 0,01 | 65,9 ± 1,4 | -12,5 ± 1,9 |
Tabela 1: Caracterização de NGF nanopartículas que simulam HDL (n = 3). Os dados são apresentados como a média ± desvio padrão. Esta tabela foi modificada de Prathipati et al. 16 .
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Discussion
Neste estudo, demonstramos um método simples para preparar NPs que imitam o HDL para o encapsulamento de NGF. Vários sistemas de libertação de NP foram estudados para fornecer proteínas. Atualmente, muitas preparações de NP envolvem diálise, precipitação com solvente e hidratação de filme. Esses processos são geralmente complicados e desafiadores na escala-up. Durante este desenvolvimento de NP, determinou-se que os lípidos tinham uma forte aderência à parede de vidro do recipiente, o que levou às dificuldades em hidratar a película fina e misturar eficientemente os excipientes. Dado os múltiplos componentes em HDL natural NPs, mistura tornou-se muito desafiador e crucial para a preparação de HDL-imitando NPs. De acordo com os resultados, o aumento da temperatura e do tempo de mistura não ajudou na formação de NP. O homogeneizador é um instrumento comum na fabricação industrial e fornece alta energia e força de cisalhamento para a mistura. Ao aplicar este instrumento à preparação de NP, os NPs monodispersos com aOs tamanhos adequados foram produzidos em 3 minutos ( Figura 2 e Figura 3 ), o que reduziu significativamente o tempo de fabrico e simplificou o processo de preparação.
O grande desafio para aplicar macromoléculas à administração terapêutica não é apenas a administração, mas também a formulação. As proteínas são normalmente solúveis em água e têm grandes dimensões e cargas em suas superfícies, que impedem a encapsulação de proteínas em NPs lipídicos. A protamina USP, um policatião, foi utilizada para formar um complexo de pares de iões com NGF. Após a mistura de NGF e protamina, o precipitado branco que indicou a formação do complexo insolúvel foi claramente observado. Com a ajuda do complexo, cerca de 70% do NGF foi aprisionado dentro das NPs, com uma distribuição de tamanho estreita ( Tabela 1 e Figura 3 ). Além disso, a estabilidade das proteínas teve de ser considerada durante o desenvolvimento da formulação. Para evitar a influência da homogeneizaçãoEm estabilidade de NGF, o procedimento foi ajustado para adicionar um complexo de NGF após homogeneização. Sob uma condição de incubação muito suave (30 min a 37 ° C), o complexo de NGF foi incorporado nas NPs. Procedimentos diferentes foram testados para adicionar Apo AI; Contudo, a incubação durante a noite à temperatura ambiente era ainda necessária para carregar suficiente Apo AI na superfície dos NPs. Com base nos resultados do ensaio de crescimento de neurites, a bioactividade do NGF após a preparação de NP foi mantida com sucesso com o procedimento aqui apresentado ( Figura 6 ). Além disso, o encapsulamento de NGF nas NPs que imitam HDL melhorou a circulação sanguínea de NGF, como indicado pelos estudos de biodistribuição ( Figura 7 ). Estes resultados demonstram que o NGF foi formulado com sucesso com um sistema de libertação NP. As PNs que imitam o HDL podem auxiliar o NGF, permitindo uma meia-vida longa e estabilidade in vivo .
Desenvolver métodos analíticos apropriados também éPara as nanomedicinas baseadas em proteínas. Para medir a eficiência de captura e a libertação in vitro , é obrigatório separar o fármaco não descarregado das nanopartículas carregadas com fármaco. As membranas com certos pontos de corte de peso molecular são comummente utilizadas para esta finalidade e funcionam bem para pequenas moléculas. No entanto, não é fácil separar proteínas não carregadas e nanopartículas carregadas de proteínas, principalmente devido aos tamanhos e propriedades de ligação semelhantes das proteínas. As NPs livres de NGF e NGF HDL não podem ser separadas usando o dispositivo de filtração à base de membrana, embora o peso molecular da membrana seja 100 kDa (o maior tamanho de poro para dispositivos de filtragem comerciais). Após várias colunas de filtração em gel terem sido testadas, as NPs que imitam NGF e NGF HDL livres foram finalmente separadas utilizando uma coluna Sepharose CL-4B. Contudo, o carregamento da amostra na coluna tinha de ser mantido a 200 μL de modo a obter-se cromatogramas reprodutíveis. Os agentes de eluição foram também importantes. Quando se utilizou águaPara eluir NGF, obteve-se um cromatograma muito largo; O NGF foi detectado a partir das fracções 5 a 20. O cromatograma alargado poderia ter sido causado pela forte interacção entre o NGF e as esferas. Após vários agentes de eluição, tais como NaCl 5 mM e NaCl 50 mM, foram testados, PBS foi confirmado como um agente de eluição suficiente. Além disso, o desafio de separação permaneceu para os estudos in vitro . A separação em coluna não é adequada para estudos de libertação in vitro devido ao número de amostras libertadas a serem medidas e ao potencial para a libertação adicional de NGF a partir das NPs quando passam a coluna. Depois de testar várias condições, determinou-se o método de diálise descrito no protocolo. De acordo com os resultados ( Figura 5 ), o NGF livre pode passar livremente a membrana passante (peso molecular de corte: 300 kDa) em PBS contendo 5% de BSA. Com este controlo positivo, o resultado da libertação de NGF HDL-imitando NPs tornou-se fiável. O aumento do tamanho dos poros eA ligação à membrana ased causada por PBS e BSA contribuiu para a livre penetração de NGF através da membrana de diálise.
Para além das questões acima mencionadas, surgiu outro desafio com o ensaio de crescimento de neurites. Existe um kit comercial de ensaio de crescimento de neurites que se baseia num subclone de células PC12. No entanto, o subclone de células PC12 já não está comercialmente disponível. Normal PC12 células são células flutuantes que não crescem neurites muito bem e que são fáceis de perder durante os procedimentos experimentais. Após várias falhas, foi descoberta uma pequena população de células PC12 que tinham uma forte propriedade de adesão. Assim, esta população de células foi seleccionada através de várias passagens, tal como descrito no protocolo. Consequentemente, o ensaio foi conduzido com sucesso e demonstra a bioactividade comparável de NGF HDL-imitando NPs com NGF livre ( Figura 6 ).
O método aqui relatado é um procedimento simples paraE preparação de NPs que imitam o HDL. Nós aprisionado mais de 26% de Apo AI sobre o NPs, que foi mais de 3 vezes maior do que o relatado na literatura [ 16] . Mais de 65% de NGF foi aprisionado nas NP, o que foi 2 vezes maior do que na literatura 16 . Com estes aumentos na eficiência de aprisionamento tanto para Apo AI como para NGF, pode não ser necessário purificar as NPs. Consequentemente, a preparação de NP foi simplificada. A Apo AI e o NGF não carregados na preparação de NP não influenciaram a libertação in vitro de NGF ( Figura 6 ) ea biodistribuição in vivo ( Figura 7 ), mas podiam influenciar a estabilidade e estudos de células in vitro . Os estudos aqui demonstram que é possível melhorar ainda mais a eficiência de aprisionamento de Apo AI e NGF através da modificação da composição NP e dos procedimentos de preparação. Além disso, o novo HDL imitando NPs e as estratégias nesses estudos poderiam ser usados para carregar outros grEmbora o agente de par iónico (protamina) possa ser alterado para se ajustar ao fator de crescimento específico. O armazenamento a longo prazo de formulações de proteínas é desafiador. A maneira preferida de manter NPs carregados de proteína é liofilizar-los em pós secos. Contudo, a liofilização pode aumentar o tamanho de partícula e diminuir a eficiência de aprisionamento da proteína após a reconstituição de NPs liofilizadas. Poucas publicações têm discutido a liofilização de NPs que imitam o HDL. Estamos estudando a liofilização de novas NPs que imitam o HDL. Eventualmente, as NPs que imitam as HDLs podem tornar-se clinicamente aplicáveis quando elas podem ser adequadamente armazenadas por um longo período de tempo (pelo menos 6 meses).
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi suportado por NIH R03 NS087322-01 a Dong, X.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-α-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
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