Подготовка и характеристика новых HDL-имитирующих наночастиц для инкапсуляции фактора роста нервов

Summary

Простую гомогенизацию использовали для получения новых наночастиц с высокой плотностью, имитирующих липопротеин для инкапсуляции фактора роста нервов. В этой статье описываются проблемы, подробные протоколы для подготовки наночастиц, характеристика in vitro и исследования in vivo .

Abstract

Целью данной статьи является введение методов подготовки и характеризации наночастиц (NP), нагружающих фактор роста нервной (NGF), высокой плотности, липопротеинов (HDL). ЛПВП являются эндогенными НП и изучены в качестве носителей для доставки терапевтических агентов. Разработаны различные методы получения HDL-имитирующих НП. Однако они, как правило, сложны, трудоемки и трудны для промышленного наращивания. В этом исследовании одноступенчатую гомогенизацию использовали для смешивания эксципиентов и образования прототипов NPs. NGF представляет собой водорастворимый белок массой 26 кДа. Для облегчения инкапсулирования NGF в липидную среду HDL-имитирующих NPs протамин USP использовали для образования комплекса ионной пары с NGF для нейтрализации зарядов на поверхности NGF. NGF / протаминовый комплекс затем вводили в прототипы NPs. Наконец, аполипопротеин AI был нанесен на поверхность НП. NGF-HDL-имитирующие NPs показали предпочтительные свойства в терминахС размером частиц, распределением по размерам, эффективностью захвата, высвобождением in vitro , биологической активностью и биораспределением. Благодаря тщательной разработке и исследованию гомогенизации в HD-имитирующих NP, процедура была значительно упрощена, и NP были сделаны масштабируемыми. Кроме того, были преодолены различные проблемы, такие как отделение незагруженного NGF от NP, проведение надежных исследований высвобождения in vitro и измерение биоактивности NP.

Introduction

Макромолекулы, такие как белки, пептиды и нуклеиновые кислоты, появились в качестве перспективных препаратов и в последние десятилетия получили значительное внимание ^{1 , 2} . Благодаря их высокой эффективности и специфическим режимам действия они обладают большим терапевтическим потенциалом для лечения рака, иммунных заболеваний, ВИЧ и связанных с ними состояний ^{3 , 4} . Однако физико-химические свойства, такие как их большие молекулярные размеры, трехмерная структура, поверхностные заряды и гидрофильная природа, делают in vivo доставку этих макромолекул очень сложной. Это значительно затрудняет их клиническое применение ⁴ . Недавние достижения в системах доставки лекарственных средств, таких как микрочастицы, полимерные наночастицы (NP), липосомы и липидные NP, преодолели эти трудности и значительно улучшили доставку макромолекул in vivo . эйБыли выявлены некоторые недостатки в отношении этих доставочных грузов, включая низкую загрузочную способность лекарства, низкую эффективность улавливания, короткий период полураспада, потерю биоактивности и нежелательные побочные эффекты ^{5 , 6 , 7 , 8} . Эффективные системы носителей остаются областью исследования. Более того, разработка аналитических методов для характеризации нагруженных препаратами НП более сложна для макромолекул, чем для малых молекул.

Липопротеины высокой плотности (HDL) представляют собой природные NP, состоящие из липидного ядра, покрытого аполипопротеинами и монослоем фосфолипидов. Эндогенный ЛВП играет критическую роль в транспорте липидов, белков и нуклеиновых кислот посредством его взаимодействия с рецепторами-мишенями, такими как SR-BI, ABCAI и ABCG1. Он был изучен как средство доставки различных терапевтических агентов ⁹, ^{10 , 11 , 12} . Разработаны различные методы получения HDL-имитирующих НП. Диализ - популярный подход. В этом способе НЧ образуются путем гидратации липидной пленки с использованием раствора холата натрия. Затем соль удаляют посредством 2-дневного диализа с тремя буферами ¹³ . Способы ультразвуковой обработки производят НП путем ультразвуковой липидной смеси в течение 60 мин при нагревании; НЧ далее очищают с помощью гель-хроматографии ¹⁴ . Микрофлюиды генерируют НП с помощью микрожидкостного устройства, которое смешивает фосфолипиды и растворы аполипопротеина AI (Apo AI) путем создания микровихрей в фокусирующей схеме ¹⁵ . Очевидно, что эти методы могут быть трудоемкими, жесткими и трудными для промышленного наращивания.

В этой статье мы вводим подготовку и характеристику новых HDL-имитирующих NP для нерваИнкапсуляция фактора роста (NGF). NGF представляет собой дисульфидсвязанный полипептидный гомодимер, содержащий два полипептидных мономера 13,6 кДа. Была разработана новая методика получения НП путем гомогенизации с последующим инкапсулированием NGF в NP. NGF-HDL-имитирующие NP характеризовались по размеру частиц, распределению по размерам, дзета-потенциалу и выделению in vitro . Их биоактивность оценивали на разрастание нейритов в клетках РС12. Биораспределение NGF HDL-имитирующих НП сравнивали с биосферным свободным NGF после внутривенной инъекции у мышей.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ. Исследования на животных, включенные во все процедуры, были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных при университете Северного Техаса.

1. Получение наночастиц, имитирующих NGF HDL

1. Растворяют эксципиенты, фосфатидилхолин (ПК), сфингомиелин (SM), фосфатидилсерин (PS), холестерин олеат (CO) и сукцинат D-α-токоферил полиэтиленгликоля (TPGS) в этаноле для приготовления исходных растворов в концентрации 1 мг / мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Исходные растворы разделяли на аликвоты и хранили при -20 ° С. Олеат холестерина хранили в темных бутылках. Исходные растворы ПК, SM, PS и CO были стабильными в течение 6, 3, 12 и 12 месяцев соответственно при -20 ° C. Раствор TPGS был стабильным в течение по меньшей мере 12 месяцев при -20 ° C.
2. Смешайте 10 мкл NGF (1 мг / мл в воде) с 10 мкл протамина USP (1 мг / мл в воде) в 1,5 мл микроцентрифужной пробирке и дайте ему постоять в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобыОбразуют комплекс.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Исходные растворы NGF и протамина разделяли по аликвоту и хранили при -20 ° C. Повторное замораживание и оттаивание не рекомендуется для запаса NGF.
3. Добавить 59 мкл ПК, 11 мкл SM, 4 мкл PS, 15 мкл CO и 45 мкл TPGS в стеклянный флакон. Перемешивают и выпаривают этанол под слабым потоком азота в течение примерно 5 мин; Все наполнители должны образовывать маслянистую тонкую пленку на дне стеклянной пробирки.
4. Добавить 1 мл сверхчистой (тип 1) воды в пробирку и гомогенизировать при 9500 об / мин (8600 мкг) в течение 5 мин при комнатной температуре для образования прототипов НП.
5. Добавить комплекс, полученный на стадии 1.2, в прототипные NPs и инкубировать при 37 ° C в течение 30 мин при перемешивании с помощью небольшого перемешивающего стержня в стеклянной пробирке.
   1. Охлаждают NPs путем перемешивания при комнатной температуре в течение еще 30 мин. После этого охлаждают, добавляют 106 мкл Apo AI (1,49 мг / мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, чтобы получить окончательныйNGF-HDL-имитирующие НП.

2. Характеристика наночастиц, имитирующих NGF HDL

1. Измерить размер частиц и дзета-потенциал с помощью анализатора частиц (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Используйте сшитую агарозную гель-фильтрационную хроматографическую колонку, чтобы отделить ненагруженный NGF от NGF HDL-имитирующих NP и определить эффективность захвата NGF.
   1. Для приготовления колонки переносите 15 мл суспензии Sepharose 4B-CL в стакан емкостью 50 мл. Размешайте суспензию шарика, используя стеклянный стержень, и вылейте часть в колонку (диаметр 30 см × 1 см, со стеклянной фриттой внизу). Аккуратно нажмите на колонку, чтобы избавиться от пузырьков. Дайте растворителю стечь и бусинки остыть в течение нескольких минут.
   2. Продолжайте добавлять оставшуюся подвеску. Промойте внутреннюю стенку колонны, чтобы очистить бусинки. Слейте растворитель, пока уровень растворителя не станет слегкаЗалейте верхнюю часть неподвижной фазы. Промывают и кондиционируют колонку 20 мл 1x фосфатно-буферного солевого раствора (PBS, содержащего 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ Na ₂ HPO ₄ и 2 мМ KH ₂ PO ₄ ).
   3. Для определения фракций, содержащих ненагруженный NGF, загрузите 200 мкл раствора NGF (10 мкг / мл) на колонку для гель-фильтрации (диаметр 25 см х 1 см) и элюируйте 1х PBS.
   4. Соберите в общей сложности 12 фракций (по 1 мл для каждой фракции) и измерьте концентрацию NGF в каждой фракции, используя набор для анализа сэндвич-ELISA для NGF.
   5. Определить NGF из фракций 6-10, используя набор Sandwich ELISA. Получают хроматограмму незагруженного NGF на колонке. Промойте колонку 20 мл PBS.
   6. Для определения фракций, содержащих NGF HDL-имитирующие NPs, загрузите 200 мкл NPs на колонку и элюируйте 1x PBS. Соберите в общей сложности 12 фракций (по 1 мл на каждую фракцию) и измерьте интенсивность частиц в каждой фракции uПеть анализатор размера частиц. Определите NPF NP от фракций 2 до 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Интенсивность - это параметр, измеряемый анализатором частиц, который показывает, сколько наночастиц может присутствовать в тестируемом растворе. Чем больше NP существует в растворе, тем выше интенсивность. При таком подходе мы можем подтвердить, что столбец может отделять NGF NPs от незагруженного NGF.
   7. Чтобы измерить эффективность захвата NGF, загрузите 200 мкл NGF HDL-имитирующих NPs на колонку и элюируйте 1x PBS. Соберите в общей сложности 12 фракций (по 1 мл на каждую фракцию).
   8. Измерить концентрацию ненагруженного NGF с фракций 6-10, используя набор Sandwich ELISA.
   9. Добавить суммы NGF, измеренные от фракций 6 до 10 вместе, в качестве незагруженного NGF и вычислить эффективность улавливания NGF, используя следующее уравнение.
      % EE = (1 - незагруженный NGF / общий NGF, добавленный в NP) x 100% Уравнение (1)

3. Выделение in vitro NGF HDL- имитация наночастиц

1. Исследование свободного NGF (10 мкг / мл в воде, n = 4) и NGF HDL-имитирующих НП (10 мкг / мл, n = 4) параллельно.
2. Предварительно обработать 8 диализных пробирок (ограничение молекулярной массы: 300 кДа), следуя инструкциям производителя.
3. Готовят 5% бычий сывороточный альбумин (BSA) в PBS в качестве среды высвобождения. Добавить 30 мл среды для выделения в центрифужную пробирку на 50 мл и разогреть ее до 37 ° С в шейкере со скоростью встряхивания 135 об / мин. Поместите еще 50 мл среды для выпуска в шейкер для замены.
4. Добавьте 400 мкл среды для выделения в диализную пробирку и быстро добавьте 200 мкл испытуемого образца, чтобы получить достаточный объем для диализа.
5. Закройте пробирку и быстро вставьте диализную пробирку в среду для выпуска (центрифужная пробирка). Быстро вытащите 100 мкл среды для выпуска из внешней диализной трубки в качестве образца для времени 0. Сразу же поставьте образец на -20 ° C для последующего анализа. Добавить 100 мкл свежего реСдайте среду в центрифужную пробирку, чтобы заменить отобранный образец. Запустите таймер.
6. Через 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 и 72 ч отводят 100 мкл среды высвобождения и заменяют ее 100 мкл свежей среды. Немедленно помещают отобранные образцы в -20 ° C для последующего анализа.
7. Через 72 ч вынимают все образцы от -20 ° С и оттаивают их при комнатной температуре. Измерьте концентрации NGF в образцах высвобождения с помощью набора для сэндвич-анализа ELISA.

4. Биоактивность NGF HDL-имитирующих наночастиц (исследование роста невритов)

1. Культура клеток PC12 в среде RPMI-1640, дополненной 10% инактивированной нагреванием лошадиной сывороткой, 5% фетальной бычьей сыворотки, 100 мкг / мл стрептомицина и 100 единиц / мл пенициллина. Поддерживайте клетки в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и 5% CO ₂ .
2. Когда клетки достигают ~ 70-80% слияния, удаляют культуральную среду и промывают клетки 1x PBS (приблизительно 2 мл на 10 см <Sup> 2 площадь поверхности культуры). Удалите промывочный раствор. Трипсинизируют клетки, добавляя 0,25% раствор трипсина-ЭДТА (0,25% трипсина и 1 мМ ЭДТА, 0,5 мл на площадь поверхности культуры 10 см ² ) в колбу и инкубируют при 37 ° С до тех пор, пока большинство клеток не отсоединятся.
3. Добавьте два объема культуральной среды и спин вниз при 180 xg в течение 5 мин. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 5 мл культуральной среды. Фильтруйте клетки через иглу 22 G, ½ дюйма, чтобы разбить кластеры клеток.
4. Разделите клетки в соотношении 1: 3 в новую колбу для культуры клеток. После инкубации в течение ночи удалите неприкрепленные клетки PC12. Позвольте прикрепленным клеткам оставаться для дальнейшего роста.
5. Повторите эту процедуру для 3 проходов, чтобы выбрать субкультуру PC12, которая обладает сильным свойством адгезии. Предварительно покрыть 6-луночный планшет с 800 мкл / лунку крысиного хвоста коллагена типа I (100 мкг / мл).
6. Трипсинизируйте выбранные клетки PC12, как описано в шаге 4.2, и отфильтруйте их через22 G, ½ дюйма иглу, чтобы разорвать кластеры клеток. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Посеяли клетки в течение ночи при плотности 10 000 клеток на лунку в предварительно покрытой 6-луночной планшете на этапе 4.5, чтобы клетки были прикреплены к пластине.
7. Разведите свободный NGF (10 мкг / мл) и NGF HDL-имитирующие NP (10 мкг / мл) с культуральной средой (описанной на шаге 4.1), чтобы получить концентрации 0,5, 1, 5, 10, 50 и 100 нг / мл. Удалите 2 мл среды из каждой лунки и замените их на 2 мл разбавленных свободных NGF или NGF HDL-имитирующих НП. Культура на 4 дня.
8. На 4-й день меняют среду на свежую среду (описанную на шаге 4.1), содержащую соответствующее лечение, и продолжают лечение еще в течение 3 дней.
9. На 7-й день визуализируйте клетки с помощью инвертированного светового микроскопа и просейте каждую лунку в случайных точках под 10-кратным увеличением.

5. Биораспределение NGF HDL-имитирующих наночастиц

1. Взрослым мышам BALB / c (самцы, 25-30 г) до tА также распределение тканевых NPF NP. В случайном порядке разделить мышей на три группы по 3 мыши на группу. Используйте конусообразный пластиковый ограничитель ( например, декапикон), чтобы удерживать мышь и протирать хвост этанолом, чтобы способствовать вазодилатации и видимости вен.
2. Внесите 100 мкл или физиологического раствора, свободного NGF, или NGF HDL-имитирующих НП каждой группе мышей (3 группы) через хвостовые вены в дозе 40 мкг / кг NGF. Используйте иглу 30 ½ G, прикрепленную к шприцу объемом 1 мл.
3. Через 30 мин после инъекции обезболивают мышей, используя 3% ингаляционного изофлурана (в кислороде при расходе 2 л / мин). Выполните пальто хвоста и пальца ноги, чтобы определить глубину анестезии. Соберите кровь при сердечной пункции.
   1. Вывести приблизительно 1 мл крови из сердца. Усыпите каждую мышь шейной дислокацией.
4. Поместите мышь в дорсальную спину. Откройте живот хирургическими ножницами и перемещайте жир и кишечник в сторонуИспользуя ватный тампон для выявления печени, селезенки и почек. Уберите эти ткани и промойте их в 1x PBS для очистки крови.
5. Немедленно центрифугируйте образцы крови при 3400 xg и 4 ° C в течение 5 минут, чтобы получить плазму. Хранить плазмы и тканей при -80 ° C до анализа.
6. Чтобы проанализировать образцы ткани, перемещайте образцы от -80 ° C до 4 ° C и суспендируйте 100 мг образца ткани в 10-кратном объеме экстракционного буфера (0,05 М ацетата натрия, 1,0 М хлорида натрия, 1% тритона Х-100, 1% BSA, 0,2 мМ фенилметансульфонилфторида и 0,2 мМ бензетониума хлорида). Гомогенизируют при 10000 об / мин и 4 ° С в течение 5 мин.
7. Пожертвуйте двух необработанных мышей для сбора пустых плазмы и тканей, как описано в шагах 5.3 и 5.4. Приготовьте стандартные растворы NGF, используя чистые плазменные или гомогенизированные чистые ткани.
8. Определите концентрации NGF в гомогенатах плазмы и тканей с использованием набора Sandwich ELISA, как описано выше.

Representative Results

На рис. 1 показана техническая схема HDL-имитирующих NPF NP, покрытых α-токоферолом, приготовленных по стратегии ионных пар. Чтобы нейтрализовать поверхностные заряды NGF, протамин USP использовали в качестве агента ионной пары для образования комплекса с NGF. Для защиты биоактивности были спроектированы прототипы NPL, имитирующие HDL, с использованием гомогенизации; Затем NGF / протаминовый комплекс инкапсулировали в прототипы NPs. Гомогенизация обеспечивала достаточную энергию и успешно способствовала перемешиванию эксципиентов. После гомогенизации в течение 3 мин для прототипов NPs были получены согласованные размеры частиц (около 170 нм) ( рисунок 2 ). Apo AI инкубировали с прототипами NPs в различных условиях, включая 2 ч перемешивания при комнатной температуре; 4 ч перемешивания при комнатной температуре; 4 ч перемешивания при комнатной температуре с последующей инкубацией в течение ночи при 4 ° С; И перемешивают при комнатной температуре вышеrnight. Более 26% Apo AI было включено в NPs при перемешивании при комнатной температуре в течение ночи. Чтобы добавить комплекс NGF-протамин, комплекс инкубировали с прототипом NPs в течение 30 мин при 37 ° C, а затем к смеси добавляли Apo AI для завершения окончательного покрытия Apo AI на поверхности NPs. В соответствии с процедурой, описанной здесь, конечные NGF-имитирующие NGF NGF имели размеры частиц 171,4 ± 6,6 нм (n = 3), с 65,9% эффективности улавливания NGF ( таблица 1 ). NGF-HDL-имитирующие НП имели небольшой отрицательный заряд ( табл. 1 ). У NPs было узкое распределение по размерам, и включение NGF в NP не влияло на размер частиц ( рис. 3 ).

Для измерения эффективности захвата NGF различные методы оценивали для отделения незагруженного NGF из NPF, имитирующих NGF HLD. Неожиданно NGF не может пройти разделительный фильтр (отсечка молекулярной массы: 100 кДа). Гель фиСтолбчатые колонны, в том числе Сефадекс G-50, Сефадекс G-100 и Сефакрил S-100, не могут отделять выгруженные NGF и NGF HDL-имитирующие НП, так как обе они выходят в тех же фракциях после элюирования. Сефароза CL-4B колонка выполняла разделение с оптимизированной загрузкой образца, элюирующим буфером и скоростью элюирования. Как показано на фиг. 4 , незагруженные NGF и NGF-липофильные NPs были полностью разделены на колонке Sepharose CL-4B.

Был применен метод диализа для изучения высвобождения in vitro NGF HDL-имитирующих NP в PBS с 5% BSA, который был включен для имитации физиологических условий в крови. Путем увеличения размера устройства диализа (обрезание молекулярной массы: 300 кДа) и добавления PBS и BSA к среде для высвобождения, NGF не связывался с диализной мембраной и свободно проходил через нее. В результате восстановление свободного NGF в этом методе диализа составило более 85% ( фиг. 5 ). NGFHD-имитирующие НП демонстрировали профиль медленного высвобождения, и около 10% NGF высвобождалось из НП за 72 часа ( рисунок 5 ).

Для проверки биоактивности NGF HDL-имитирующих NPs субкультура клеток PC12, которая обладала сильным свойством адгезии, была выбрана для проведения анализа разрастания нейритов. На рисунке 6 представлены изображения разрастания нейритов, когда клетки обрабатывались свободным NGF 50 нг / мл ( рис. 6A ) и NPF, имитирующим NGF ( рисунок 6B ). Когда концентрация обработки была выше 10 нг / мл, разрастание нейритов отчетливо наблюдалось под микроскопом. При таких высоких концентрациях свободные NGF и NGF-олигонуклеотиды, имитирующие HDL, не выявили существенной разницы в влиянии разрастания нейритов. Когда концентрация NGF была ниже, чем 10 нг / мл, разрастание нейритов не могло быть четко обнаружено, как для свободного NGF, так и для NGF HDL-имитирующих NP. Распределение биораспределенияБыли проведены сравнительные исследования поведения in vivo свободных NGF и NGF HDL-имитирующих NPs. Как показано на рисунке 7 , NGF HDL-имитирующие NPs значительно увеличивают концентрацию в плазме и уменьшают поглощение в печени, почках и селезенке.

Рисунок 1: Технологическая схема NGF HDL-имитирующих наночастиц, приготовленных по стратегии ионных пар. NGF представляет собой отрицательно заряженную гидрофильную молекулу. Катионный пептид, протамин, использовался для нейтрализации зарядов и образовывал ионно-парный комплекс с NGF. Холестериловый олеат, фосфолипиды и TPGS образовывали самосборные прототипы NPs путем гомогенизации. NGF / протаминовый комплекс был включен в прототипы NPs. Наконец, Apo AI покрывали на поверхности NP после инкубации в течение ночи. Эта цифра была изменена с Prathipati et al. ^{Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.}

Рисунок 2: Влияние гомогенизации на размер частиц наночастиц прототипа. Эксципиенты, ПК, SM, PS, CO и TPGS, которые растворяли в этаноле, добавляли в стеклянные пробирки и растворитель выпаривали в потоке N ₂ . Добавляли 1 мл воды и гомогенизировали при 9500 об / мин в разное время. Измеряли размеры частиц последующих наночастиц. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 4). Эта цифра была изменена с Prathipati et al. ¹⁶ . Пожалуйста, клиCk здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Размер частиц и распределение по размерам пустых HDL-имитирующих наночастиц и наночастиц, имитирующих NGF HDL. Размеры частиц и их распределение измеряли с помощью анализатора частиц. Эта цифра была изменена с Prathipati et al. ¹⁶ . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Хроматограммы свободных NGF и NGF HDL-имитирующих наночастиц на колонке Sepharose CL-4B, элюированной PBS. 200 мкл свободного раствора NGF (10 мкг / мл) и раствора NGF NP наносили на tГель-фильтрационной колонке и элюировали 1х PBS. Всего для обоих образцов было собрано 12 фракций (по 1 мл на каждую фракцию). Интенсивность NP в каждой фракции измеряли с помощью анализатора частиц, и концентрацию NGF в каждой фракции измеряли с использованием набора Sandwich ELISA. Эта цифра была изменена с Prathipati et al. ^{16 .} Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Высвобождение in vitro NGF HDL-имитирующих наночастиц, измеренных методом диализа. В качестве среды для выделения использовали PBS с 5% BSA. 200 мкл свободного раствора NGF (10 мкг / мл) или NPF NPs добавляли в диализную пробирку, дополненную 400 μЛ среды высвобождения. Диализную пробирку помещают в 30 мл предварительно нагретой среды для выделения. Исследование проводили при 37 ° С с встряхиванием 135 об / мин. Через 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 и 72 ч 100 мкл среды высвобождения удаляли и заменяли 100 мкл свежей среды. Концентрацию NGF в каждом образце измеряли с использованием набора Sandwich ELISA. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 4). Эта цифра была изменена с Prathipati et al. ¹⁶ . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Влияние NGF HDL-имитирующих наночастиц на разрастание нейритов в клетках PC12. Клетки обрабатывали 50 нг / мл свободного NGF ( A ) и D NGF HDL-имитирующие наночастицы ( B ) в течение 7 дней. Нейрит был визуализирован с использованием инвертированного светового микроскопа под 10-кратным увеличением. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Сравнение биораспределения между свободными NGF и NGF-имитирующими наночастицами мышами (n = 3). Мышам вводили 40 мг / кг NGF путем инъекции хвостовой вены и умерщвляли через 30 мин после введения. Кровь, печень, селезенка и почка были собраны, и концентрация NGF в каждом образце была измерена с использованием набора Sandwich ELISA. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Эта цифра была изменена с Prathipati et al. ¹⁶ ."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55584/55584fig7large.jpg" target = "_ blank"> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Образец	Размер частиц (нм)	ПИ	EE% NGF	Дзета-потенциал (мВ)
NGF-HDL-имитирующие NPs	171,4 & plusmn; 6,6	0,239 ± 0,01	65,9 ± 1,4	-12,5 ± 1,9

Таблица 1: Характеристика наночастиц, имитирующих NGF HDL (n = 3). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Эта таблица была изменена с Prathipati et al. ¹⁶ .

Discussion

В этом исследовании мы продемонстрировали простой метод приготовления HDL-имитирующих NP для инкапсуляции NGF. Были изучены различные системы доставки NP для доставки белков. В настоящее время многие препараты НП включают диализ, осаждение растворителя и гидратацию пленки. Эти процессы, как правило, сложны и сложны при масштабировании. Во время этой разработки NP было определено, что липиды обладают сильной адгезией к стеклянной стенке контейнера, что привело к трудностям в увлажнении тонкой пленки и эффективном перемешивании эксципиентов. Учитывая множественность компонентов в природных HDL NP, смешение стало очень сложным и решающим для приготовления HDL-имитирующих NP. Согласно результатам, увеличение температуры и времени смешивания не помогло в формировании NP. Гомогенизатор является общепринятым инструментом промышленного производства и обеспечивает высокую энергию и поперечную силу для перемешивания. Применяя этот инструмент к приготовлению НП, монодисперсные НП с aСоответствующие размеры были получены в течение 3 мин ( рис. 2 и рисунок 3 ), что значительно сократило время изготовления и упростило процедуру подготовки.

Большая проблема применения макромолекул для терапевтического применения заключается не только в доставке, но и в разработке. Белки обычно водорастворимы и имеют большие размеры и заряды на своих поверхностях, которые предотвращают инкапсулирование белков в липидные NP. Протамин USP, поликатион, был использован для образования комплекса ионных пар с NGF. После смешивания NGF и протамина отчетливо наблюдался белый осадок, который указывал на образование нерастворимого комплекса. С помощью комплекса около 70% NGF было захвачено внутри НП, с узким распределением по размерам ( Таблица 1 и Рисунок 3 ). Кроме того, стабильность белков должна была учитываться при разработке рецептуры. Чтобы избежать влияния гомогенизацииНа стабильность NGF, процедуру корректировали для добавления комплекса NGF после гомогенизации. При очень мягком состоянии инкубации (30 мин при 37 ° С) комплекс NGF включался в НП. Для добавления Apo AI были протестированы различные процедуры; Однако инкубация в течение ночи при комнатной температуре все еще была необходима для загрузки достаточного количества Apo AI на поверхности НП. Основываясь на результатах анализа разрастания нейритов, биоактивность NGF после приготовления НП была успешно поддержана с помощью процедуры, представленной здесь ( рисунок 6 ). Более того, инкапсулирование NGF в HDL-имитирующие NPs улучшало циркуляцию крови NGF, как показано исследованиями биораспределения ( рисунок 7 ). Эти результаты демонстрируют, что NGF был успешно составлен с системой доставки NP. HD-имитирующие НП могут помогать NGF, обеспечивая длительный период полураспада и in vivo .

Разработка соответствующих аналитических методов такжеТягу к наномедицинам на основе белков. Для измерения эффективности улавливания и высвобождения in vitro , необходимо отделить незагруженный препарат от наночастиц, нагруженных лекарственным средством. Для этой цели обычно используют мембраны с определенными отсечениями молекулярной массы и хорошо работают для малых молекул. Тем не менее, нелегко отделить ненагруженные белки и белковые наночастицы, главным образом, из-за сходных размеров и связывающих свойств белков. Свободные NPF и NGF-загруженные NPs не могут быть отделены с помощью мембранного фильтрационного устройства, хотя молекулярная отсечка мембраны составляет 100 кДа (самый большой размер пор для коммерческих фильтрующих устройств). После тестирования нескольких гель-фильтрационных колонн свободные NGF и NGF-липопротеиновые NP-волокна были окончательно отделены с использованием колонки Sepharose CL-4B. Однако для того, чтобы получить воспроизводимые хроматограммы, образец, загружаемый в колонку, должен был содержаться в количестве 200 мкл. Элюирующие агенты также были важны. Когда использовалась водаДля элюции NGF была получена очень широкая хроматограмма; NGF был обнаружен из фракций 5-20. Широкая хроматограмма могла быть вызвана сильным взаимодействием NGF с шариками. После проверки нескольких элюирующих агентов, таких как 5 мМ NaCl и 50 мМ NaCl, PBS был подтвержден как достаточный элюирующий агент. Более того, проблема выделения остается для исследований in vitro . Отделение колонки не подходит для исследований высвобождения in vitro из-за количества высвобождаемых образцов, подлежащих измерению, и потенциала для дальнейшего высвобождения NGF из НП, когда они проходят колонку. После тестирования различных условий был определен способ диализа, описанный в протоколе. Согласно результатам ( рис. 5 ), свободный NGF может свободно проходить через мембрану (отсечение веса молекулы: 300 кДа) в PBS, содержащем 5% BSA. Благодаря этому положительному контролю результат высвобождения NPF-HDL-имитирующих NP стал надежным. Увеличенный размер пор и уменьшениеВызванное PBS и BSA, способствовало свободному проникновению NGF через диализную мембрану.

В дополнение к вышеупомянутым проблемам возникла еще одна проблема с анализом разрастания нейритов. Существует коммерческий набор для анализа роста опухоли нейритов, который основан на субклоне клеток PC12. Однако субклоны клеток PC12 больше не коммерчески доступны. Нормальные клетки PC12 являются плавающими клетками, которые не очень хорошо растут нейриты и которые легко потерять во время экспериментальных процедур. После нескольких неудач была обнаружена небольшая популяция клеток PC12, которая обладала сильным свойством адгезии. Таким образом, эта популяция клеток была выбрана через несколько проходов, как описано в протоколе. Следовательно, анализ был успешно проведен и демонстрирует сопоставимую биоактивность NGF HDL-имитирующих NP со свободным NGF ( рисунок 6 ).

Описанный здесь метод - простая процедура для thE подготовка HDL-имитирующих NPs. Мы захватили более 26% Apo AI на NP, что было более чем в 3 раза выше, чем указано в литературе ¹⁶ . Более 65% NGF было захвачено NP, что в 2 раза выше, чем в литературе ¹⁶ . При таком увеличении эффективности захвата как для Apo AI, так и для NGF, нет необходимости очищать NP. Следовательно, препарат НП был упрощен. Не загруженные Apo AI и NGF в препарате NP не влияли на высвобождение NGF in vitro ( фиг. 6 ) и биораспределение in vivo ( фиг. 7 ), но это могло влиять на стабильность и исследования клеток in vitro . Проведенные здесь исследования демонстрируют, что можно еще более повысить эффективность захвата Apo AI и NGF путем изменения состава NP и процедур приготовления. Более того, новые HD-имитирующие NPs и стратегии в этих исследованиях могут быть использованы для загрузки других gr, Хотя ионно-парный агент (протамин) может быть изменен с учетом специфического фактора роста. Долгосрочное хранение белковых составов является сложным. Предпочтительный способ удержания белковых NPs заключается в лиофилизации их до сухих порошков. Однако лиофилизация может увеличить размер частиц и снизить эффективность захвата белка после восстановления лиофилизированных NP. В немногих публикациях обсуждалась лиофилизация HDL-имитирующих НП. Мы изучаем лиофилизацию новых HDL-имитирующих NP. В конце концов, HDL-имитирующие НП могут стать клинически применимыми, если их можно хранить в течение длительного периода времени (не менее 6 месяцев).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC)	Avanti	131601P	95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM)	Avanti	860062P	Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS)	Avanti	840032P	Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO)	Sigma	C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate	Sigma	P3369	meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma	Athens Research & Technology	16-16-120101	1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF	R&D system	DY008
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
RPMI-1640 medium	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
Horse serum	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
Fetal bovine serum	Gibco	10082147
PC12 cells	ATCC	CRL-1721
Rat tail collagen type I	Sigma	C3867
Sodium acetate	Sigma	S2889
Sodium chloride	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzethonium chloride	Sigma	B8879
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Homogenizer	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer	Beckman-Coulter	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device	Spectrum Laboratories	G235036	Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge	Eppendoff	5424R
Polytron homogenizer	Kinematica	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200