Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

إعداد وتوصيف رواية هدل-محاكاة الجسيمات النانوية لتغليف عامل النمو العصبي

Published: May 22, 2017 doi: 10.3791/55584
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center

Summary

تم استخدام التجانس بسيطة لإعداد رواية، عالية الكثافة، البروتينات الدهنية تحاكي الجسيمات النانوية لتغليف عامل نمو الأعصاب. يتم وصف التحديات، والبروتوكولات التفصيلية لإعداد جسيمات متناهية الصغر، توصيف في المختبر ، والدراسات في الجسم الحي في هذه المقالة.

Abstract

والهدف من هذه المادة هو تقديم أساليب إعداد وتوصيف لعامل نمو الأعصاب (نغف)، تحميل، عالية الكثافة، البروتين الدهني (هدل) - محاكاة الجسيمات النانوية (نبس). إن هدل هي نپس الذاتية وقد تم استكشافها كمركبات لتسليم العوامل العلاجية. وقد تم تطوير أساليب مختلفة لإعداد هدل-محاكيات نيبس. ومع ذلك، فهي معقدة عموما، وتستغرق وقتا طويلا، وصعبة على نطاق صناعي المتابعة. في هذه الدراسة، تم استخدام التجانس من خطوة واحدة لخلط سواغ وتشكيل نبس النموذج. نغف هو بروتين قابل للذوبان في الماء من 26 كيلو دالتون. لتسهيل تغليف نغف في البيئة الدهنية من هدل-محاكي نبس، تم استخدام بروتامين أوسب لتشكيل مجمع الأيونات الزوج مع نغف لتحييد الرسوم على سطح نغف. ثم تم إدخال مجمع نغف / بروتامين في النماذج الأولية. أبوليبوبروتين أي المغلفة أخيرا على سطح نبس. أظهرت نغف هدل-ميمكينغ نبيس خصائص مفضلة في المدىs من حجم الجسيمات، توزيع الحجم، كفاءة التخميد، في المختبر الافراج، النشاط الحيوي، و بيوديستريبوتيون. مع تصميم دقيق واستكشاف التجانس في هدل-محاكاة نيب، تم تبسيط الإجراء إلى حد كبير، وجعلت نبس قابلة للتطوير. وعلاوة على ذلك، تم التغلب على التحديات المختلفة، مثل فصل نغف تفريغها من نبس، وإجراء دراسات موثوقة في المختبر الإفراج، وقياس النشاط الحيوي لل نبس.

Introduction

جزيئات كبيرة، مثل البروتينات، والببتيدات، والأحماض النووية، وقد ظهرت كدواء واعدة واكتسبت اهتماما كبيرا في العقود الماضية 1 ، 2 . نظرا لفعاليتها عالية وطرق عمل محددة، فإنها تظهر إمكانات علاجية كبيرة لعلاج السرطان، والأمراض المناعية، وفيروس نقص المناعة البشرية، والظروف ذات الصلة 3 ، 4 . ومع ذلك، فإن الخصائص الفيزيوكيميائية، مثل حجمها الجزيئي الكبير، هيكل ثلاثي الأبعاد، ورسوم السطح، وطبيعة ماء، وجعل في تسليم الجسم الحي من هذه الجزيئات صعبة للغاية. هذا يعوق بشكل كبير استخدامها السريري 4 . التطورات الأخيرة في أنظمة تسليم المخدرات، مثل الجسيمات الدقيقة، الجسيمات النانوية البوليمر (نبس)، الجسيمات الشحمية، و نبس الدهون، تغلبت هذه التحديات وتحسين كبير في تسليم الجسم الحي من الجزيئات. هووقد تم الكشف عن بعض العيوب فيما يتعلق بشحنات التسليم هذه، بما في ذلك انخفاض قدرة تحميل الدواء، وانخفاض كفاءة الانحباس، ونصف العمر القصير، وفقدان النشاط الحيوي، والآثار الجانبية غير المرغوبة 5 و 6 و 7 و 8 . ولا تزال نظم الموجات الحاملة الفعالة مجالا للاهتمام البحثي. وعلاوة على ذلك، فإن تطوير أساليب تحليلية لتوصيف نبس محملة المخدرات هو أكثر تحديا للجزيئات الصغيرة من الجزيئات الصغيرة.

البروتين الدهني عالي الكثافة (هدل) هو نب الطبيعية تتكون من جوهر الدهون التي هي المغلفة من أبوليبوبروتينز وأحادي الطبقة الفوسفاتية. يلعب هدل الذاتية دورا حاسما في نقل الدهون والبروتينات والأحماض النووية من خلال تفاعلها مع المستقبلات المستهدفة مثل سر-بي و أبكاي و ABCG1. وقد تم استكشافه كوسيلة لتسليم مختلف العوامل العلاجية 9، 10 ، 11 ، 12 . وقد تم تطوير أساليب مختلفة لإعداد هدل-محاكيات نيبس. غسيل الكلى هو نهج شعبية. في هذه الطريقة، يتم تشكيل نبس عن طريق ترطيب فيلم الدهون باستخدام حل الصوديوم الصوديوم. ثم يتم إزالة الملح من خلال غسيل الكلى لمدة يومين مع ثلاثة مخازن 13 . طرق سونيكاتيون تلفيق نبس عن طريق سونيكاتينغ خليط الدهون لمدة 60 دقيقة تحت حالة التدفئة. يتم تنقية نبس أكثر من خلال اللوني هلام 14 . ميكروفليديكش يولد نبس عن طريق جهاز ميكروفلويديك، الذي يمزج الفوسفورية و أبوليبوبروتين أي (أبو أي) الحلول من خلال خلق ميكروفورتيسز في نمط التركيز 15 . ومن الواضح أن هذه الأساليب يمكن أن تكون مضيعة للوقت وقاسية وصعبة على النطاق الصناعي.

في هذه المقالة، ونحن نقدم إعداد وتوصيف رواية هدل-محاكاة نيب للأعصابعامل النمو (نغف). نغف هو مثبط ثنائي ببتيد هوموديمر تحتوي على اثنين من 13.6 كيلو دالتون ببتيد أحادية. وقد تم تطوير إجراء جديد لإعداد نبس عن طريق التجانس، تليها تغليف نغف في نبس. وقد تميزت نغف هدل-محاكاة نيبس لحجم الجسيمات، وتوزيع الحجم، وإمكانات زيتا، والإفراج في المختبر . تم تقييم نشاطها الحيوي لانتشار نيوريت في خلايا PC12. تمت مقارنة بيوديستريبوتيون من نغف هدل-محاكاة نيبس مع أن من نغف مجانا بعد الحقن في الوريد في الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: وقد تمت الموافقة على الدراسات الحيوانية المدرجة في جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في جامعة شمال تكساس مركز العلوم الصحية.

1. إعداد نغف هدل-محاكاة الجسيمات النانوية

  1. حل سواغ، فوسفهاتيديلكولين (بيسي)، سفينغومييلين (سم)، فسفاتيديل (بس)، أوليي الكوليستريل (كو)، و D- α- توكوفيريل البولي إثيلين غليكول سكسينات (تبغس)، في الإيثانول لإعداد حلول الأسهم في 1 ملغ / مل.
    ملاحظة: أليكوتد حلول الأسهم وتخزينها في -20 درجة مئوية. تم تخزين أوليات الكوليستريل في زجاجات داكنة. وكانت الحلول بيسي، سم، بس، وكو الأسهم مستقرة لمدة تصل إلى 6، 3، 12، و 12 شهرا، على التوالي، في -20 درجة مئوية. كان الحل تبغس مستقرة لمدة لا تقل عن 12 شهرا عند -20 درجة مئوية.
  2. مزيج 10 ميكرولتر من نغف (1 ملغ / مل في الماء) مع 10 ميكرولتر من بروتامين أوسب (1 ملغ / مل في الماء) في أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل والسماح لها الوقوف لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة إلىتشكل المجمع.
    ملاحظة: أليكوتد و نغف وحلول الأسهم بروتامين وتخزينها في -20 درجة مئوية. لا يوصى بالتجميد المتكرر والذوبان في مخزون نغف.
  3. إضافة 59 ميكرولتر من جهاز الكمبيوتر، 11 ميكرولتر من سم، 4 ميكرولتر من بس، 15 ميكرولتر من كو، و 45 ميكرولتر من تبغس إلى قارورة زجاجية. مزيج وتتبخر الإيثانول تحت تيار النيتروجين لطيف لمدة 5 دقائق. يجب أن تشكل جميع سواغ الزيتية، رقيقة في الجزء السفلي من قارورة زجاجية.
  4. إضافة 1 مل من الماء عالى النقاء (نوع 1) المياه إلى قارورة والتجانس في 9،500 دورة في الدقيقة (8،600 x ج) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتشكيل نبس النموذج.
  5. إضافة مجمع أعدت في الخطوة 1.2 إلى نبس النموذج واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع التحريك باستخدام شريط التحريك صغير في قارورة زجاجية.
    1. تبريد نبس أسفل عن طريق التحريك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أخرى. بعد هذا يبرد، إضافة 106 ميكرولتر من منظمة العفو الدولية أبو (1.49 ملغ / مل) ويقلب في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها لتشكيل المباراة النهائيةنغف هدل-ميمبيكينغ نبس.

2. توصيف نغف هدل-محاكاة الجسيمات النانوية

  1. قياس حجم الجسيمات وإمكانية زيتا باستخدام محلل الجسيمات (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. استخدام عبر ربط الاغاروز الترشيح هلام العمود الكروماتوغرافي لفصل نغف تفريغها من نغف هدل-محاكي نبس وتحديد كفاءة حبس من نغف.
    1. لإعداد العمود، ونقل 15 مل من سيفاروس 4B-كل تعليق لدورق 50 مل. تحريك تعليق حبة باستخدام قضيب زجاجي وتصب بعض في عمود (30 سم طول × 1 سم القطر، مع فريت الزجاج في الجزء السفلي). اضغط برفق على العمود للتخلص من الفقاعات. السماح للمذيب لاستنزاف وحبات لتسوية لبضع دقائق.
    2. تابع إضافة التعليق المتبقي. شطف الجدار الداخلي من العمود لتنظيف الخرز. استنزاف المذيب حتى مستوى المذيبات قليلابوف الجزء العلوي من المرحلة الثابتة. غسل وحالة العمود مع 20 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس، تحتوي على 137 ملي كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 8 ملي نا 2 هبو 4 ، و 2 ملي خ 2 بو 4 ).
    3. لتحديد الكسور التي تحتوي على نغف تفريغها، تحميل 200 ميكرولتر من حل نغف (10 ميكروغرام / مل) على عمود الترشيح هلام (25 سم طول × 1 سم القطر) وأزله مع برنامج تلفزيوني 1X.
    4. جمع ما مجموعه 12 كسور (1 مل لكل جزء) وقياس تركيز نغف في كل جزء باستخدام مجموعة ساندويتش إليسا ل نغف.
    5. كشف نغف من الكسور 6-10 باستخدام مجموعة ساندويتش إليسا. الحصول على كروماتوغرام من نغف تفريغها على العمود. غسل العمود مع 20 مل من برنامج تلفزيوني.
    6. لتحديد الكسور التي تحتوي على نغف هدل-محاكاة نيبس، تحميل 200 ميكرولتر من نبس على العمود ونزل مع برنامج تلفزيوني 1X. جمع ما مجموعه 12 كسور (1 مل لكل جزء) وقياس شدة الجسيمات في كل جزء شالغناء محلل حجم الجسيمات. كشف نبس نغف من الكسور 2 إلى 4.
      ملاحظة: شدة هي معلمة يقاسها محلل الجسيمات، الذي يقول كم عدد الجسيمات النانوية قد تكون موجودة في حل الاختبار. أكثر نبس موجودة في الحل، وارتفاع كثافة هو. من خلال هذا النهج، يمكننا أن نؤكد أن العمود يمكن فصل نغس نب من تفريغ نغف.
    7. لقياس كفاءة انحباس من نغف، تحميل 200 ميكرولتر من نغف هدل-محاكاة نيب على العمود ونزل مع برنامج تلفزيوني 1X. جمع ما مجموعه 12 كسور (1 مل لكل جزء).
    8. قياس تركيز نغف تفريغها من الكسور 6-10 باستخدام طقم ساندويتش إليسا.
    9. إضافة كميات نغف المقاسة من الكسور 6 إلى 10 معا باعتبارها نغف تفريغ وحساب كفاءة انغراب من نغف باستخدام المعادلة التالية.
      ٪ إي = (1 - تفريغ نغف / مجموع نغف تضاف إلى نب) × 100٪ المعادلة (1)

3. في المختبر الافراج عن نغف هدل- محاكاة الجزيئات النانوية

  1. دراسة نغف مجانا (10 ميكروغرام / مل في الماء؛ ن = 4) و نغف هدل-محاكاة نيب (10 ميكروغرام / مل = ن = 4) بالتوازي.
  2. قبل علاج 8 أنابيب غسيل الكلى (الوزن الجزيئي قطع: 300 كيلو دالتون) باتباع تعليمات الشركة الصانعة.
  3. إعداد 5٪ ألبومين المصل البقري (بسا) في برنامج تلفزيوني كوسيلة إطلاق. إضافة 30 مل من وسط التحرير إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل ودفئه حتى 37 درجة مئوية في شاكر مع 135 دورة في الدقيقة تهز السرعة. وضع 50 مل أخرى من وسط التحرير في شاكر لاستبدال.
  4. إضافة 400 ميكرولتر من وسط إطلاق في أنبوب غسيل الكلى وبسرعة إضافة 200 ميكرولتر من عينة اختبار لجعل حجم ما يكفي لغسيل الكلى.
  5. إغلاق أنبوب ووضع بسرعة أنبوب غسيل الكلى في وسط الافراج (أنبوب الطرد المركزي). سحب بسرعة 100 ميكرولتر من وسط الافراج عن أنبوب غسيل الكلى الخارجي كعينة للوقت 0. وضع على الفور العينة إلى -20 درجة مئوية لتحليل لاحق. إضافة 100 ميكرولتر من إعادة جديدةتأجير المتوسطة في أنبوب الطرد المركزي ليحل محل العينة المسحوبة. بدء الموقت.
  6. في 1 و 2 و 4 و 6 و 8 و 24 و 48 و 72 ساعة، اسحب 100 ميكرولتر من وسط التحرير واستبدلها ب 100 ميكرولتر من الوسط الطازج. وضعت على الفور العينات المسحوبة إلى -20 درجة مئوية لتحليلها لاحقا.
  7. بعد 72 ساعة، وأخرج جميع العينات من -20 درجة مئوية ويذوبان لهم في درجة حرارة الغرفة. قياس تركيزات نغف من عينات الافراج باستخدام مجموعة ساندويتش إليسا.

4. النشاط الحيوي من نغف هدل-محاكاة الجسيمات النانوية (نيوريت دراسة النمو)

  1. الثقافة خلايا PC12 في وسط رمي-1640 تستكمل مع 10٪ المصل الحصان المعطل الحرارة، 5٪ مصل بقري الجنين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 100 وحدة / مل البنسلين. الحفاظ على الخلايا في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية ومع 5٪ كو 2 .
  2. عندما تصل الخلايا ~ التقاء 70-80٪، وإزالة وسط الثقافة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X (حوالي 2 مل لكل 10 سم <سوب> 2 مساحة سطح الثقافة). قم بإزالة محلول الغسيل. تريبسينيز الخلايا عن طريق إضافة 0.25٪ تريبسين-إدتا الحل (0.25٪ التربسين و 1 ملي إدتا؛ 0.5 مل لكل 10 سم 2 مساحة سطح الثقافة) إلى قارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل معظم الخلايا.
  3. إضافة مجلدين من الوسط الثقافي وتدور باستمرار في 180 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من وسط الثقافة. تصفية الخلايا من خلال 22 G، ½ بوصة إبرة لكسر مجموعات الخلايا.
  4. تقسيم الخلايا بنسبة 1: 3 في قارورة ثقافة الخلية الجديدة. بعد احتضان بين عشية وضحاها، وإزالة خلايا PC12 غير مرتبط. السماح للخلايا المرفقة أن تبقى لمزيد من النمو.
  5. كرر هذا الإجراء لمدة 3 مقاطع لتحديد ثقافة فرعية من PC12 التي لديها خاصية التصاق قوية. قبل معطف لوحة 6 جيدا مع 800 ميكرولتر / بئر من نوع الفئران ذيل الكولاجين I (100 ميكروغرام / مل).
  6. تريبسينيز خلايا PC12 المحددة كما هو موضح في الخطوة 4.2 وتصفية لهم من خلال22 G، ½ بوصة إبرة لكسر مجموعات الخلايا. عد الخلايا مع عدادة الكريات. البذور الخلايا بين عشية وضحاها بكثافة 10،000 الخلايا / جيدا في لوحة المغلفة مسبقا 6-جيدا في الخطوة 4.5 للسماح للخلايا أن نعلق على لوحة.
  7. تمييع نغف مجانا (10 ميكروغرام / مل) و نغف هدل-محاكي نبس (10 ميكروغرام / مل) مع الوسط الثقافي (الموصوفة في الخطوة 4.1) لإعداد 0.5، 1، 5، 10، 50، و 100 نغ / مل تركيزات. إزالة 2 مل من المتوسطة من كل بئر واستبدالها مع 2 مل من نغف المخفف مجانا أو نغف هدل-محاكي نبس. الثقافة لمدة 4 أيام.
  8. في يوم 4، تغيير المتوسطة إلى الطازجة المتوسطة (وصفها في الخطوة 4.1) التي تحتوي على العلاج المقابلة ومواصلة العلاج لمدة 3 أيام أخرى.
  9. في يوم 7، تصور الخلايا مع مجهر الضوء مقلوب وصورة كل جيدا في بقع عشوائية تحت التكبير 10X.

5. بيوديستريبوتيون من نغف هدل-محاكاة الجسيمات النانوية

  1. استخدام الكبار بالب / ج الفئران (ذكور، 25-30 ز) إلى رإست توزيع الأنسجة من نغس نبس. تقسيم عشوائي الفئران إلى ثلاث مجموعات من 3 الفئران لكل مجموعة. استخدام ضبط على شكل مخروط البلاستيك (على سبيل المثال، ديكابيكون) لكبح الفأر ومسح الذيل مع الايثانول لتعزيز توسع الأوعية ووضوح الوريد.
  2. حقن 100 ميكرولتر من أي محلول ملحي، نغف مجانا، أو نغف هدل-محاكي نبس لكل مجموعة من الفئران (3 مجموعات) من خلال الأوردة الذيل بجرعة 40 ميكروغرام / كغ من نغف. استخدام إبرة 30½ G تعلق على حقنة 1 مل.
  3. في 30 دقيقة بعد الحقن، تخدير الفئران باستخدام 3٪ إيسوفلوران استنشاق (في الأكسجين بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة). أداء ذيل وأخمص القدمين قرصة لتحديد عمق التخدير. جمع الدم عن طريق ثقب القلب.
    1. سحب حوالي 1 مل من الدم من القلب. الموت ببطء كل ​​الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
  4. وضع الذبيحة الماوس في الاستلقاء الظهري. فتح البطن باستخدام مقص جراحي ونقل الدهون والأمعاء جانباباستخدام مسحة القطن لفضح الكبد والطحال والكلى. حصاد هذه الأنسجة وشطف لهم في برنامج تلفزيوني 1X لتنظيف الدم.
  5. على الفور الطرد المركزي عينات الدم في 3،400 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للحصول على البلازما. تخزين البلازما والأنسجة في -80 درجة مئوية حتى التحليلات.
  6. لتحليل عينات الأنسجة، ونقل العينات من -80 درجة مئوية إلى 4 درجات مئوية وتعليق 100 ملغ من عينة الأنسجة في حجم 10X من استخراج العازلة (0.05 M خلات الصوديوم، 1.0 M كلوريد الصوديوم، 1٪ تريتون X-100، 1٪ بسا، 0.2 ملي فينيل ميثان سلفونيل فلوريد، و 0.2 ملي كلوريد البنزيثونيوم). التجانس في 10،000 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. التضحية اثنين من الفئران غير المعالجة لجمع البلازما والأنسجة فارغة، كما هو موضح في الخطوات 5.3 و 5.4. إعداد الحلول القياسية نغف باستخدام البلازما فارغة أو تجانس الأنسجة الفارغة.
  8. تحديد تركيزات نغف في مجانس البلازما والأنسجة باستخدام عدة ساندويتش إليسا، كما هو موضح أعلاه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد مخطط الهندسة من هدل محاكاة، α توكوفيرول المغلفة نغس نبس أعدتها استراتيجية أيون زوج في الشكل 1 . لتحييد رسوم سطح نغف، تم استخدام بروتامين أوسب كعامل أيون زوج لتشكيل مجمع مع نغف. ولحماية النشاط الحيوي، تم تصميم النموذج الأولي لمحاكاة الخلايا النانوية (هدل)، وذلك باستخدام التجانس أولا؛ ثم، مغلف مجمع نغف / بروتامين في نبس النموذج. وقدم التجانس طاقة كافية ونجح في تعزيز خلط السواغات. بعد التجانس 3 دقائق، وأحجام الجسيمات متسقة (حوالي 170 نانومتر) تم الحصول عليها للنموذج نبس ( الشكل 2 ). تم تحضين أبو منظمة العفو الدولية مع نبس النموذج في ظروف مختلفة، بما في ذلك 2 ساعة من التحريك في درجة حرارة الغرفة. 4 ساعة من التحريك في درجة حرارة الغرفة. 4 ساعة من التحريك في درجة حرارة الغرفة، تليها الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. والتحريك في درجة حرارة الغرفة فوقrnight. تم دمج أكثر من 26٪ من أبو منظمة العفو الدولية في نبس عندما أثار في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. لإضافة مجمع نغف-بروتامين، تم تحضين المجمع مع نبس النموذج لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ثم أضيفت آو منظمة العفو الدولية إلى الخليط لإنهاء الطلاء النهائي من منظمة العفو الدولية أبو على سطح نبس. وباستخدام الإجراء الموصوف هنا، كانت أحجام الجسيمات النانوية (نغس) النهائية للغاز الطبيعي المضغوط (هغف) هدل تبلغ 171.4 ± 6.6 نانومتر (ن = 3)، مع 65.9٪ من كفاءة انزيم نغف ( الجدول 1 ). نغف هدل-ميمكينغ كان لدى نيبس شحنة سالبة طفيفة ( الجدول 1 ). كان ل نبس توزيع حجم ضيق، وإدراج نغف في نبس لم يؤثر على حجم الجسيمات ( الشكل 3 ).

ولقياس كفاءة الانحباس في الغاز الطبيعي المسال، تم تقييم أساليب مختلفة لفصل نغف تفريغها من نغف هلد - وهو ما يحاكي نبس. بشكل غير متوقع، نغف لا يمكن أن تمر مرشح فصل (الوزن الجزيئي قطع: 100 كيلو دالتون). جل فيلا يمكن فصل أعمدة الترشيح، بما في ذلك سيفادكس G-50، سيفادكس G-100، و سيفاكريل S-100 فصل نغف و نغف هدل-محاكاة نيبس، لأن كلا منهم يخرج في نفس الكسور بعد شطف. وأجرى عمود سيفاروس كل-4B الفصل مع تحميل العينة الأمثل، العازلة شطف، ومعدل شطف. كما هو مبين في الشكل (4) ، تفريغ نغف و نغف هدل-محاكي نبس تم فصلها تماما على عمود سيفاروس كل-4B.

تم استخدام طريقة غسيل الكلى لدراسة الافراج في المختبر من نغف هدل-محاكاة نيبس في برنامج تلفزيوني مع 5٪ بسا، والتي شملت لتقليد الظروف الفسيولوجية في الدم. عن طريق زيادة حجم جهاز غسيل الكلى (قطع الوزن الجزيئي: 300 كيلو دالتون) وإضافة بس و بسا إلى وسط إطلاق سراح، لم نغف لا يرتبط مع غشاء غسيل الكلى ومرت بحرية من خلال. ونتيجة لذلك، كان الانتعاش من نغف مجانا في هذه الطريقة غسيل الكلى أكثر من 85٪ ( الشكل 5 ). NGFأظهر هدل-ميميكينغ نبس بطيئة الإفراج عنهم، وحوالي 10٪ من نغف تم الافراج عن نبس على مدى 72 ساعة ( الشكل 5 ).

لاختبار النشاط الحيوي من نغف هدل-محاكاة نيب، تم اختيار ثقافة فرعية من خلايا PC12 التي لديها خاصية التصاق قوية لإجراء فحص نوريت نمو. الشكل 6 يمثل التصوير من نوريت ثمرة عندما تم علاج الخلايا مع 50 نانوغرام / مل حرة نغف ( الشكل 6A ) و نغف هدل-محاكاة نيب ( الشكل 6B ). عندما كان تركيز العلاج أعلى من 10 نانوغرام / مل، لوحظ نمو النوريت بوضوح من قبل المجهر. في هذه التركيزات العالية، لم يظهر نغف مجانا و نغف هدل-محاكاة نيب فرقا كبيرا على تأثير نمو نيوريت. عندما كان التركيز من نغف أقل من 10 نانوغرام / مل، لا يمكن ملاحظة نمو النوريت بوضوح، سواء لغف نغف الحرة و نغف هدل-محاكاة نيبس. بيوديستريبوتيون ستأجريت أوديس لمقارنة السلوكيات في الجسم الحي من نغف مجانا و نغف هدل-محاكاة نيبس. كما هو مبين في الشكل 7 ، نغف هدل-محاكاة نيب زيادة كبيرة في تركيز البلازما وخفض امتصاص في الكبد والكلى والطحال.

شكل 1
الشكل 1: مخطط الهندسة من نغف هدل-محاكاة الجسيمات النانوية التي أعدتها استراتيجية أيون زوج. نغف هو جزيء ماء سالبة الشحنة. واستخدمت الببتيد الموجبة، بروتامين، لتحييد التهم وتشكيل مجمع الأيونات الزوج مع نغف. تشوليستريل أوليات، الفوسفورية، و تبغس شكلت الذاتي التجميع نبس النموذج عن طريق التجانس. تم دمج مجمع نغف / بروتامين في النماذج الأولية. وأخيرا، كان المغلفة أبو منظمة العفو الدولية على سطح نب بعد حضانة بين عشية وضحاها. وقد تم تعديل هذا الرقم من براثيباتي وآخرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تأثير التجانس على حجم الجسيمات من الجسيمات النانوية النموذج. تم إضافة سواغ، بيسي، سم، بس، كو، و تبغس، والتي تم حلها في الإيثانول، إلى قارورة زجاجية، وتبخر المذيب تحت تيار N 2 . تم إضافة 1 مل من الماء وتجانسها عند 9500 دورة في الدقيقة لأوقات مختلفة. تم قياس أحجام الجسيمات النانوية اللاحقة. وتعرض البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري (n = 4). وقد تم تعديل هذا الرقم من براثيباتي وآخرون. 16 - يرجى كليسك هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: حجم الجسيمات وتوزيع حجم فارغة هدل-محاكاة الجسيمات النانوية و نغف هدل-محاكاة الجسيمات النانوية. تم قياس أحجام الجسيمات والتوزيعات باستخدام محلل الجسيمات. وقد تم تعديل هذا الرقم من براثيباتي وآخرون. 16 - الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4: كروماتوغرامز من نغف مجانا و نغف هدل-محاكاة الجسيمات النانوية على عمود سيفاروس كل-4B المخفية من قبل برنامج تلفزيوني. تم تحميل 200 ميكرولتر من محلول نغف مجانا (10 ميكروغرام / مل) ومحلول نغف نب على tانه عمود الترشيح هلام و إلوتد مع برنامج تلفزيوني 1X. تم جمع ما مجموعه اثني عشر كسور (1 مل لكل جزء) لكلا العينات. تم قياس كثافة نب في كل جزء بواسطة محلل الجسيمات، وتم قياس تركيز نغف في كل جزء باستخدام مجموعة ساندويتش إليسا. وقد تم تعديل هذا الرقم من براثيباتي وآخرون. 16 - الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5
الشكل 5: في المختبر الافراج عن نغف هدل-محاكاة الجسيمات النانوية قياسها بواسطة طريقة غسيل الكلى. تم استخدام برنامج تلفزيوني مع 5٪ بسا كوسيلة إطلاق. تم إضافة 200 ميكرولتر من محلول نغف مجانا (10 ميكروغرام / مل) أو نغف نبس إلى أنبوب غسيل الكلى تستكمل مع 400 μL من وسط التحرير. تم وضع أنبوب غسيل الكلى في 30 مل من وسط إطلاق سراح مسبق. أجريت الدراسة عند 37 درجة مئوية مع 135 دورة في الدقيقة تهز. في 1 و 2 و 4 و 6 و 8 و 24 و 48 و 72 ساعة، تم سحب 100 ميكرولتر من وسط التحرير واستبداله ب 100 ميكرولتر من الوسط الطازج. تم قياس تركيز نغف في كل عينة باستخدام مجموعة ساندويتش إليسا. وتعرض البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري (n = 4). وقد تم تعديل هذا الرقم من براثيباتي وآخرون. 16 - الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6
الشكل 6: تأثير نغف هدل-محاكاة الجسيمات النانوية على نمو نيوريت في خلايا PC12. تم علاج الخلايا مع 50 نانوغرام / مل خالية نغف ( A ) أ د نغف هدل-محاكاة الجسيمات النانوية ( B ) لمدة 7 أيام. تم تصوير نيوريت باستخدام مجهر الضوء مقلوب تحت التكبير 10X. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7
الشكل 7: المقارنة بين بيوديستريبوتيون بين نغف الحرة و نغف هدل-محاكاة الجسيمات النانوية في الفئران (ن = 3). تم إعطاء الفئران مع 40 ملغ / كغ من نغف عن طريق الحقن الذيل الوريد وتم التضحية في 30 دقيقة بعد تناوله. تم جمع الدم والكبد والطحال والكلى، وتم قياس تركيز نغف في كل عينة باستخدام مجموعة ساندويتش إليسا. وتظهر البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري. وقد تم تعديل هذا الرقم من براثيباتي وآخرون. 16 -"http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55584/55584fig7large.jpg" تارجيت = "_ بلانك"> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عينة حجم الجسيمات (نانومتر) PI إي٪ من نغف زيتا المحتملة (مف)
نغف هدل-ميمبيكينغ نبس 171.4 ± 6.6 0.239 ± 0.01 65.9 ± 1.4 -12.5 ± 1.9

الجدول 1: توصيف نغف هدل-محاكاة الجسيمات النانوية (ن = 3). وتظهر البيانات كمتوسط ​​± الانحراف المعياري. تم تعديل هذا الجدول من براثيباتي وآخرون. 16 -

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة، ونحن نبرهن على طريقة بسيطة لإعداد هدل-محاكاة نيبس للتغليف نغف. وقد تم دراسة مختلف أنظمة التسليم نب لتقديم البروتينات. حاليا، العديد من الاستعدادات نب تشمل غسيل الكلى، وهطول المذيبات، وترطيب الفيلم. وهذه العمليات معقدة عموما وتحديا عند توسيع نطاقها. خلال هذا التطور نب، تم تحديد أن الدهون لديها التصاق قوي للجدار الزجاجي للحاوية، مما أدى إلى صعوبات في ترطيب رقيقة و خلط سواغ كفاءة. وبالنظر إلى مكونات متعددة في نبس الطبيعية هدل، أصبح خلط صعبة للغاية وحاسمة لإعداد هدل-محاكي نبس. وفقا للنتائج، وزيادة درجة الحرارة والخلط الوقت لم تساعد في تشكيل نب. الخالط هو أداة مشتركة في الصناعة التحويلية ويوفر الطاقة العالية وقص القص لخلط. من خلال تطبيق هذا الصك لإعداد نب، مونوديسبيرزيد نبس معتم إنتاج الأحجام بوباتيد في غضون 3 دقائق ( الشكل 2 والشكل 3 )، مما أدى إلى انخفاض كبير في وقت التصنيع وتبسيط إجراءات التحضير.

التحدي الكبير لتطبيق الجزيئات على الإدارة العلاجية ليس فقط التسليم، ولكن أيضا صياغة. وعادة ما تكون البروتينات قابلة للذوبان في الماء ولها أحجام كبيرة ورسوم على أسطحها، مما يحول دون تغليف البروتينات إلى خلايا نبس قائمة على الدهون. تم استخدام بروتامين أوسب، وهو بوليكاتيون، لتشكيل مجمع أيون زوج مع نغف. بعد خلط نغف و بروتامين، لوحظ بوضوح راسب أبيض التي أشارت إلى تشكيل مجمع غير قابلة للذوبان. وبمساعدة المجمع، تم حصر حوالي 70٪ من الغاز الطبيعي المسال داخل المحطات النووية، مع توزيع ضيق الحجم ( الجدول 1 والشكل 3 ). وعلاوة على ذلك، كان يتعين النظر في استقرار البروتينات خلال تطوير الصياغة. لتجنب تأثير التجانسعلى استقرار نغف، تم تعديل الإجراء لإضافة مجمع نغف بعد التجانس. في ظل حالة حضانة خفيفة جدا (30 دقيقة عند 37 درجة مئوية)، تم دمج مجمع نغف في نبس. تم اختبار إجراءات مختلفة لإضافة أبو منظمة العفو الدولية. ومع ذلك، كانت الحضانة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لا تزال ضرورية لتحميل ما يكفي من منظمة العفو الدولية أبو على سطح نبس. استنادا إلى نتائج فحص نوريت فحص، تم الحفاظ على النشاط الحيوي من نغف بعد إعداد نب بنجاح مع الإجراء المقدم هنا ( الشكل 6 ). وعلاوة على ذلك، فإن تغلف نغف في محاذاة البروتينات الهيدروفلورية (هدل) يحسن الدورة الدموية للغاز الطبيعي المسال، كما هو مبين في دراسات التوزيع الحيوي ( الشكل 7 ). هذه النتائج تثبت أن نغف تم صياغتها بنجاح مع نظام تسليم نب. و هدل-محاكي نبس يمكن أن تساعد نغف، مما يسمح لمدة نصف العمر الطويل والاستقرار في الجسم الحي .

تطوير أساليب التحليل المناسبة هي أيضا تشايننغ للبروتينات نانومديسينس. لقياس كفاءة الانحباس والإفراج في المختبر ، فمن الضروري لفصل المخدرات تفريغها من الجسيمات النانوية المحملة المخدرات. الأغشية مع قطع الوزن الجزيئي معينة تستخدم عادة لهذا الغرض وتعمل بشكل جيد للجزيئات الصغيرة. ومع ذلك، فإنه ليس من السهل لفصل البروتينات تفريغها والجسيمات النانوية البروتين المحملة، وذلك أساسا بسبب أحجام مماثلة وملخص خصائص البروتينات. لا يمكن فصل نغف و نغف هدل محملة خالية من نبس باستخدام جهاز الترشيح القائم على الغشاء، على الرغم من أن قطع الوزن الجزيء من الغشاء هو 100 كيلو دالتون (أكبر حجم المسام لأجهزة الترشيح التجارية). بعد أن تم اختبار العديد من أعمدة الترشيح هلام، تم فصل أخيرا نغف و نغف هدل-محاكاة نيبس أخيرا باستخدام عمود سيفاروس كل-4B. ومع ذلك، كان تحميل العينة على العمود أن تبقى في 200 ميكرولتر من أجل الحصول على كروماتوغرامز استنساخه. وكان وكلاء شطف أيضا من الأهمية. عند استخدام المياهأن أزل نغف، تم الحصول على اللوني واسع جدا. تم الكشف عن نغف من الكسور 5 إلى 20. يمكن أن يكون سبب اللوني واسعة من التفاعل القوي بين نغف والخرز. بعد عدة وكلاء شطف، مثل 5 ملي كلوريد الصوديوم و 50 ملي كلوريد الصوديوم، تم اختبار، تم تأكيد بس كعامل شطف كافية. وعلاوة على ذلك، لا يزال التحدي الانفصال للدراسات في المختبر . فصل العمود ليست مناسبة لدراسات الافراج في المختبر بسبب عدد من العينات التي تم الافراج عنهم لقياسها وإمكانية إطلاق مزيد من نغف من نبس عند تمرير العمود. بعد اختبار ظروف مختلفة، تم تحديد طريقة غسيل الكلى الموصوفة في البروتوكول. وفقا للنتائج ( الشكل 5 )، نغف مجانا يمكن أن تمر بحرية من خلال الغشاء (جزيء الوزن قطع: 300 كيلو دالتون) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ بسا. مع هذا التحكم الإيجابي، أصبحت نتيجة الافراج عن نغف هدل-محاكاة نيب موثوقة. زيادة حجم المسام ونقصأسيد غشاء ملزمة الناجمة عن برنامج تلفزيوني و بسا ساهم في اختراق خالية من نغف من خلال غشاء غسيل الكلى.

بالإضافة إلى القضايا المذكورة أعلاه، ظهرت تحديا آخر مع فحص نوريت فحص. هناك نايريت التجاري مجموعة فحص فحوصات التي تقوم على سوبكلون من خلايا PC12. ومع ذلك، فإن سوبكلون من خلايا PC12 لم تعد متاحة تجاريا. خلايا PC12 العادية هي الخلايا العائمة التي لا تنمو نيوريتس جيدا جدا والتي من السهل أن تفقد أثناء الإجراءات التجريبية. بعد عدة فشل، تم اكتشاف عدد صغير من الخلايا PC12 التي لديها خاصية التصاق قوية. وهكذا، تم اختيار هذه المجموعة من الخلايا من خلال عدة مقاطع، كما هو موضح في البروتوكول. ونتيجة لذلك، تم إجراء مقايسة بنجاح ويظهر النشاط الحيوي للمقارنة من نغف هدل-محاكاة نيبس مع نغف مجانا ( الشكل 6 ).

الطريقة المذكورة هنا هو إجراء بسيط له إعداد هدل-محاكاة نيبس. نحن احتلنا أكثر من 26٪ من منظمة العفو الدولية منظمة العفو الدولية على نبس، الذي كان أعلى من 3 أضعاف مما ورد في الأدب 16 . أكثر من 65٪ من نغف كان محصورا في البرامج الوطنية، والتي كانت أعلى بضعفين مما كانت عليه في الأدب 16 . مع هذه الزيادات في كفاءة الانحباس لكل من أبو أي و نغف، قد لا يكون من الضروري لتنقية نبس. وبالتالي، تم تبسيط إعداد نب. لم تفريغ آبو منظمة العفو الدولية و نغف في إعداد نب لا تؤثر على نغف في المختبر الافراج عن ( الشكل 6 ) و بيوديستريبوتيون في الجسم الحي ( الشكل 7 )، ولكن يمكن أن تؤثر على الاستقرار ودراسات الخلايا المختبرية. الدراسات هنا تثبت أنه من الممكن لزيادة تحسين كفاءة انسداد آبو منظمة العفو الدولية و نغف عن طريق تعديل نب تكوين وإجراءات إعداد. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام رواية هدل-محاكي نبس والاستراتيجيات في هذه الدراسات لتحميل غر الأخرىأوث، على الرغم من أن وكيل أيون زوج (بروتامين) يمكن تغييرها لتناسب عامل النمو المحدد. إن تخزين تركيبات البروتين على المدى الطويل يمثل تحديا. الطريقة المفضلة للحفاظ على البروتينات المحملة البروتين هو تجفيفها على نحو جاف للمساحيق الجافة. ومع ذلك، ليوفيليزاتيون يمكن أن تزيد من حجم الجسيمات وتقليل كفاءة انسداد من البروتين بعد إعادة تشكيل نبس مجفف بالتجميد. وقد ناقش عدد قليل من املنشورات جتربة هدل - احلد من املواد النووية. نحن ندرس ليوفيليزاتيون من رواية هدل-محاكي نبس. وفي نهاية المطاف، يمكن أن يصبح محاآاة البروتينات الهيدروفلورية (هدل) قابلة للتطبيق سريريا عندما يمكن تخزينها بشكل مناسب لفترة طويلة من الزمن (6 أشهر على الأقل).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R03 NS087322-01 إلى دونغ، X.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recombinant Human Beta-NGF Creative Biomart NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC) Avanti 131601P 95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM) Avanti 860062P Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS) Avanti 840032P Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO) Sigma C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) BASF 9002-96-4 Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate Sigma P3369 meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma Athens Research & Technology 16-16-120101 1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL Sigma CL4B200 Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF R&D system DY008
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
RPMI-1640 medium GE Healthcare Life Science SH30096.02
Horse serum GE Healthcare Life Science SH30074.03
Fetal bovine serum Gibco 10082147
PC12 cells ATCC CRL-1721
Rat tail collagen type I Sigma C3867
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride Sigma 31414
Triton X-100 Sigma T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Benzethonium chloride Sigma B8879
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Homogenizer Tekmar T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer Beckman-Coulter Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device Spectrum Laboratories G235036 Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge Eppendoff 5424R
Polytron homogenizer Kinematica PT 1200C
DecapiCone  Braintree Scientific Inc. DC-M200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
  2. Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).
  3. Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle. Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).
  4. Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K. Long-term delivery of protein therapeutics. Expert Opin Drug Deliv. 12 (3), 415-440 (2015).
  5. Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. Medical application of liposomes. , Elsevier. (1998).
  6. Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).
  7. Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate. J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).
  8. Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles. Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).
  9. Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. High-density lipoproteins: nature's multifunctional nanoparticles. ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).
  10. Gursky, O. Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).
  11. McMahon, K. M., Thaxton, C. S. High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).
  12. McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy. Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).
  13. Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications. Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).
  14. Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting. Small. 6 (3), 430-437 (2010).
  15. Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics. ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).
  16. Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution. Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 123، جزيء، التجانس، هلام الترشيح الترشيح،
إعداد وتوصيف رواية هدل-محاكاة الجسيمات النانوية لتغليف عامل النمو العصبي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhu, J., Dong, X. Preparation and… More

Zhu, J., Dong, X. Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation. J. Vis. Exp. (123), e55584, doi:10.3791/55584 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter