Préparation et caractérisation de nouvelles nanoparticules imitant HDL pour l'encapsulation du facteur de croissance nerveuse

Summary

Une homogénéisation simple a été utilisée pour préparer des nanoparticules novatrices, à forte densité et à la lipoprotéine, à encapsuler le facteur de croissance nerveuse. Les défis, les protocoles détaillés pour la préparation des nanoparticules, la caractérisation in vitro et les études in vivo sont décrits dans cet article.

Abstract

L'objectif de cet article est d'introduire des méthodes de préparation et de caractérisation pour les nanoparticules de réduction des nanoparticules (NP) protégées par les facteurs de croissance nerveuse (NGF), à forte densité et à lipoprotéines (HDL). Les HDL sont des NP endogènes et ont été explorés comme des véhicules pour la délivrance d'agents thérapeutiques. Différentes méthodes ont été développées pour préparer les IPs mimés par HDL. Cependant, ils sont généralement compliqués, longs et difficiles à augmenter industriellement. Dans cette étude, l'homogénéisation en une étape a été utilisée pour mélanger les excipients et former les NP prototypes. Le NGF est une protéine hydrosoluble de 26 kDa. Pour faciliter l'encapsulation du NGF dans l'environnement lipidique des NPs mimant HDL, la protamine USP a été utilisée pour former un complexe de paire d'ions avec du NGF pour neutraliser les charges sur la surface de NGF. Le complexe NGF / protamine a ensuite été introduit dans les NP prototypes. L'apolipoprotéine AI a finalement été enduit à la surface des NP. NGF HDI-imitant NPs a montré des propriétés préférables en termeS de la taille des particules, de la distribution des tailles, de l'efficacité du piégeage, de la libération in vitro , de la bioactivité et de la biodistribution. Grâce à la conception minutieuse et à l'exploration de l'homogénéisation dans les NPs mimantant le HDL, la procédure a été grandement simplifiée et les NP ont été rendues évolutives. De plus, de nombreux défis, tels que la séparation du NGF déchargé des NP, la réalisation d'études fiables de libération in vitro et la mesure de la bioactivité des IP, ont été surmontés.

Introduction

Les macromolécules, telles que les protéines, les peptides et les acides nucléiques, sont devenues des médicaments prometteurs et ont attiré une attention considérable au cours des dernières décennies ^{1 , 2} . En raison de leur efficacité élevée et de leurs modes d'action spécifiques, ils présentent un excellent potentiel thérapeutique pour les traitements du cancer, des maladies immunitaires, du VIH et des affections apparentées ^{3 , 4} . Cependant, les propriétés physicochimiques, telles que leur grande taille moléculaire, leur structure tridimensionnelle, leurs charges de surface et leur nature hydrophile, rendent la livraison in vivo de ces macromolécules très difficile. Cela entrave considérablement leur utilisation clinique ⁴ . Les progrès récents dans les systèmes de délivrance de médicaments, tels que les microparticules, les nanoparticules de polymères (NP), les liposomes et les NP lipidiques, ont surmonté ces défis et amélioré significativement la livraison in vivo de macromolécules. HoCertains inconvénients concernant ces cargaisons d'expédition ont été révélés, y compris une faible capacité de chargement du médicament, une faible efficacité de piégeage, une demi-vie courte, une perte de bioactivité et des effets secondaires indésirables ^{5 , 6 , 7 , 8} . Les systèmes de transporteurs efficaces restent un domaine d'intérêt de recherche. En outre, le développement de méthodes analytiques pour caractériser les NP NP chargés de médicaments est plus difficile pour les macromolécules que pour les petites molécules.

La lipoprotéine de haute densité (HDL) est un NP naturel composé d'un noyau de lipide qui est recouvert d'apolipoprotéines et d'une monocouche de phospholipides. Le HDL endogène joue un rôle essentiel dans le transport des lipides, des protéines et des acides nucléiques grâce à son interaction avec les récepteurs cibles tels que SR-BI, ABCAI et ABCG1. Il a été exploré comme véhicule pour la livraison de différents agents thérapeutiques ⁹, ^{10 , 11 , 12} . Différentes méthodes ont été développées pour préparer les IPs mimés par HDL. La dialyse est une approche populaire. Dans cette méthode, les NP sont formés en hydratant un film lipidique à l'aide d'une solution de cholate de sodium. Le sel est ensuite éliminé par une dialyse de 2 jours avec trois tampons ¹³ . Les méthodes de sonication fabriquent des NP en faisant soigner un mélange de lipides pendant 60 min sous un état de chauffage; Les NP sont encore purifiés par Chromatographie sur gel ¹⁴ . La microfluidique génère des NP via un dispositif microfluidique, qui mélange les solutions de phospholipides et d'apolipoprotéine AI (Apo AI) en créant des micro-parrains dans un schéma de focalisation ¹⁵ . De toute évidence, ces méthodes peuvent prendre beaucoup de temps, difficiles et difficiles à augmenter industriellement.

Dans cet article, nous présentons la préparation et la caractérisation de nouvelles NPs mimantant HDL pour le nerfEncapsulation du facteur de croissance (NGF). Le NGF est un homodimère de polypeptide lié au disulfure contenant deux monomères polypeptidiques de 13,6 kDa. Une nouvelle procédure pour préparer les NP par homogénéisation, suivie de l'encapsulation du NGF dans les NP, a été développée. Les NNP de NGF ont été caractérisées pour la taille des particules, la distribution des tailles, le potentiel zêta et la libération in vitro . Leur bioactivité a été évaluée pour la croissance des neurites dans les cellules PC12. La biodistribution des NP NGF imitant les NP a été comparée à celle du NGF libre après injection intraveineuse chez la souris.

Protocol

NOTE: Les études sur les animaux inclus dans toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux au Centre des sciences de la santé de l'Université du Nord.

1. Préparation des Nanoparticules de NGF HDL-imitant

1. Dissoudre les excipients, la phosphatidylcholine (PC), la sphingomyéline (SM), la phosphatidylsérine (PS), l'oléate de colesteryle (CO) et le succinate de D-α-tocopheryl polyéthylène glycol (TPGS), dans l'éthanol pour préparer des solutions stock à 1 mg / mL.
   NOTE: Les solutions stock ont ​​été réparties en aliquotes et stockées à -20 ° C. L'oléate de cholesteryle a été stocké dans des bouteilles sombres. Les solutions de stockage PC, SM, PS et CO étaient stables jusqu'à 6, 3, 12 et 12 mois, respectivement, à -20 ° C. La solution TPGS était stable pendant au moins 12 mois à -20 ° C.
2. Mélanger 10 μL de NGF (1 mg / ml dans l'eau) avec 10 μL de protamine USP (1 mg / mL dans l'eau) dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL et laisser reposer pendant 10 minutes à température ambiante jusqu'àFormer le complexe.
   NOTE: Les solutions de stock de NGF et de protamine ont été réparties en aliquotes et stockées à -20 ° C. La congélation et la décongélation répétées ne sont pas recommandées pour le stock de NGF.
3. Ajouter 59 μL de PC, 11 μL de SM, 4 μL de PS, 15 μL de CO et 45 μL de TPGS dans un flacon en verre. Mélanger et évaporer l'éthanol sous un courant d'azote doux pendant environ 5 min; Tous les excipients doivent former un film huileux et mince au fond du flacon en verre.
4. Ajouter 1 ml d'eau ultrapure (type 1) dans le flacon et homogénéiser à 9 500 tr / min (8 600 xg) pendant 5 min à température ambiante pour former les NP prototypes.
5. Ajouter le complexe préparé à l'étape 1.2 aux NP prototypes et incuber à 37 ° C pendant 30 minutes sous agitation en utilisant une petite barre d'agitation dans le flacon en verre.
   1. Refroidir les NP bas en agitant à température ambiante pendant 30 minutes supplémentaires. Après cela, refroidir, ajouter 106 μL d'Apo AI (1,49 mg / mL) et agiter à température ambiante pendant la nuit pour former la finaleNGF HDI-imitant NPs.

2. Caractérisation des Nanoparticules de NGF HDL-imitant

1. Mesurez la taille des particules et le potentiel zêta à l'aide d'un analyseur de particules (voir la table Matériaux) selon les instructions du fabricant.
2. Utilisez une colonne de Chromatographie de filtration sur gel d'agarose réticulée pour séparer le NGF déchargé des NN de NGF HDI-imitant et déterminer l'efficacité de piégeage du NGF.
   1. Pour la préparation de la colonne, transférer 15 mL de suspension de Sepharose 4B-CL dans un bécher de 50 mL. Remuer la suspension de perles à l'aide d'une tige de verre et verser une partie dans une colonne (30 cm de longueur × 1 cm de diamètre, avec une fritte de verre en bas). Appuyez doucement sur la colonne pour éliminer les bulles. Laisser le solvant s'écouler et les perles se déposer pendant quelques minutes.
   2. Continuez à ajouter la suspension restante. Rincer le mur intérieur de la colonne pour nettoyer les perles. Vidangez le solvant jusqu'à ce que le solvant soit légèrementAu sommet de la phase stationnaire. Laver et conditionner la colonne avec 20 ml d'une solution salée tamponnée au phosphate (PBS, contenant NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HOPO 4 8 mM et KH ₂ PO ₄ 2 mM).
   3. Pour déterminer les fractions contenant du NGF déchargé, charger 200 μL de solution de NGF (10 μg / mL) sur la colonne de filtration sur gel (25 cm de longueur x 1 cm de diamètre) et éluer avec 1x PBS.
   4. Recueillir un total de 12 fractions (1 mL pour chaque fraction) et mesurer la concentration de NGF dans chaque fraction en utilisant un kit ELISA Sandwich pour NGF.
   5. Détecter le NGF des fractions 6 à 10 en utilisant le kit Sandwich ELISA. Obtenir un chromatogramme de NGF déchargé sur la colonne. Laver la colonne avec 20 ml de PBS.
   6. Pour déterminer les fractions contenant des NGP NGF imitant les cellules, chargez 200 μL des NP sur la colonne et élue avec 1x PBS. Recueillir un total de 12 fractions (1 mL pour chaque fraction) et mesurer l'intensité des particules dans chaque fractionChanter l'analyseur de granulométrie. Détecter les NGF NP des fractions 2 à 4.
      NOTE: L'intensité est un paramètre mesuré par l'analyseur de particules, qui indique combien de nanoparticules peuvent exister dans la solution d'essai. Plus les NP existent en solution, plus l'intensité est élevée. Par cette approche, nous pouvons confirmer que la colonne peut séparer les NP NGF du NGF déchargé.
   7. Pour mesurer l'efficacité de piégeage de NGF, charger 200 μL de NP NGF en imitant les HDL sur la colonne et éluer avec 1x PBS. Recueillir un total de 12 fractions (1 ml pour chaque fraction).
   8. Mesurer la concentration de NGF déchargée des fractions 6 à 10 en utilisant le kit Sandwich ELISA.
   9. Ajouter les quantités de NGF mesurées à partir des fractions 6 à 10 ensemble en tant que NGF déchargé et calculer l'efficacité de piégeage du NGF en utilisant l'équation suivante.
      % EE = (1 - NGF déchargé / NGF total ajouté en NP) x 100% Équation (1)

3. Version in vitro de HDL NGF-mimying Nanoparticles

1. Etudier en NGF libre (10 μg / mL dans l'eau, n = 4) et NGF HDI-imitant les NP (10 μg / mL; n = 4) en parallèle.
2. Prétraiter 8 tubes de dialyse (seuil de masse moléculaire: 300 kDa) en suivant les instructions du fabricant.
3. Préparer 5% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS comme milieu de libération. Ajouter 30 ml de milieu de libération dans un tube de centrifugation de 50 ml et le réchauffer à 37 ° C dans un agitateur avec une vitesse de trempe de 135 tr / min. Placez un autre 50 mL de milieu de libération dans le shaker pour le remplacer.
4. Ajouter 400 μL de milieu de libération dans le tube de dialyse et ajouter rapidement 200 μL de l'échantillon testé pour obtenir suffisamment de volume pour la dialyse.
5. Fermez le tube et placez rapidement le tube de dialyse dans le liquide de séparation (le tube de centrifugation). Retirez rapidement 100 μL du milieu de libération du tube de dialyse externe comme échantillon pour le temps 0. Mettez immédiatement l'échantillon dans -20 ° C pour une analyse ultérieure. Ajouter 100 μL de frais reRenvoyer le support dans le tube centrifuge pour remplacer l'échantillon retiré. Démarrez la minuterie.
6. À 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 et 72 h, retirer 100 μL du milieu de libération et le remplacer par 100 μL de milieu frais. Mettez immédiatement les échantillons prélevés dans -20 ° C pour une analyse ultérieure.
7. Après 72 h, retirer tous les échantillons de -20 ° C et les décongeler à température ambiante. Mesurer les concentrations de NGF des échantillons de rejet en utilisant le kit Sandwich ELISA.

4. Bioactivité des Nanoparticules de NGF HDL-imitant (étude de croissance des névres)

1. Cellules Culture PC12 dans du milieu RPMI-1640 additionné de 10% de sérum de cheval inactivé par la chaleur, 5% de sérum bovin fœtal, 100 μg / ml de streptomycine et 100 unités / mL de pénicilline. Maintenir les cellules dans un incubateur humidifié à 37 ° C et avec 5% de CO ₂ .
2. Lorsque les cellules atteignent ~ 70-80% de confluence, enlever le milieu de culture et laver les cellules avec 1x PBS (environ 2 mL par 10 cm <Sup> 2 surface de culture). Retirer la solution de lavage. Essayer les cellules en ajoutant 0,25% de solution de trypsine-EDTA (0,25% de trypsine et 1 mM d'EDTA, 0,5 mL par surface de culture de 10 cm ² ) dans le flacon et incuber à 37 ° C jusqu'à ce que la plupart des cellules soient détachées.
3. Ajouter deux volumes de milieu de culture et centrifuger à 180 xg pendant 5 min. Enlever le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de milieu de culture. Filtrer les cellules par une aiguille de 22 G, ½ pouce pour briser les grappes de cellules.
4. Diviser les cellules à un rapport de 1: 3 dans un nouveau flacon de culture cellulaire. Après l'incubation pendant la nuit, retirez les cellules PC12 non attachées. Permettre aux cellules attachées de rester pour une croissance supplémentaire.
5. Répétez cette procédure pour 3 passages pour sélectionner la sous-culture de PC12 qui possède une forte propriété d'adhérence. Préchauffer une plaque de 6 puits avec 800 μl / puits de collagène de queue de rat de type I (100 μg / mL).
6. Essaye les cellules PC12 sélectionnées comme décrit à l'étape 4.2 et filtrez-les à travers un22 G, aiguille 1/2 pouce pour casser les grappes de cellules. Comptez les cellules avec un hémocytomètre. Graine les cellules d'une nuit à une densité de 10 000 cellules / puits dans la plaque de 6 puits pré-revêtue à l'étape 4.5 pour permettre aux cellules de s'attacher à la plaque.
7. Diluer les NGF (10 μg / mL) libres et les NGF de NGF (10 μg / mL) avec le milieu de culture (décrit à l'étape 4.1) pour préparer des concentrations de 0,5, 1, 5, 10, 50 et 100 ng / mL. Enlevez 2 ml de milieu de chaque puits et remplacez-les par 2 ml de NPCs dilués ou NGF HDL-imitant NPs. Culture pendant 4 jours.
8. Le jour 4, changez le moyen à moyen frais (décrit à l'étape 4.1) contenant le traitement correspondant et continuez le traitement pendant 3 jours supplémentaires.
9. Le jour 7, visualisez les cellules avec un microscope optique inversé et imagez-vous chaque puits à des points aléatoires sous un grossissement 10X.

5. Biodistribution des Nanoparticules de NGF HDL-imitant

1. Utiliser des souris adultes BALB / c (hommes, 25-30 g) à tEst la distribution tissulaire des NGF NP. Diviser de manière aléatoire les souris en trois groupes de 3 souris par groupe. Utilisez un dispositif de retenue en plastique en forme de cône ( par exemple, décapicone) pour retenir une souris et essuyer la queue avec de l'éthanol pour favoriser la vasodilatation et la visibilité de la veine.
2. Injecter 100 μl de NIM, de NGF ou de NGF HD-Ig de NGF à chaque groupe de souris (3 groupes) à travers les veines de la queue à une dose de 40 μg / kg de NGF. Utilisez une aiguille 30½ G attachée à une seringue de 1 mL.
3. À 30 min après l'injection, anesthésier les souris en utilisant 3% d'isoflurane inhalé (en oxygène à un débit de 2 L / min). Effectuez une pincée de queue et de pied pour déterminer la profondeur de l'anesthésie. Recueillir le sang par ponction cardiaque.
   1. Retirer environ 1 mL de sang du coeur. Éuthaniser chaque souris par dislocation cervicale.
4. Placez la carcasse de la souris en décroissance dorsale. Ouvrez l'abdomen en utilisant des ciseaux chirurgicaux et déplacez les graisses et les intestins de côtéEn utilisant un coton-tige pour exposer le foie, la rate et le rein. Récoltez ces tissus et rincez-les dans 1x PBS pour nettoyer le sang.
5. Centrifuger immédiatement les échantillons de sang à 3 400 xg et 4 ° C pendant 5 minutes pour obtenir le plasma. Conservez le plasma et les tissus à -80 ° C jusqu'à l'analyse.
6. Pour analyser les échantillons de tissus, déplacez les échantillons de -80 ° C à 4 ° C et suspendez 100 mg d'échantillon de tissu dans un volume de 10x de tampon d'extraction (0,05 M d'acétate de sodium, 1,0 M de chlorure de sodium, 1% de triton X-100, 1% de BSA, fluorure de phénylméthanesulfonyle 0,2 mM et chlorure de benzéthonium 0,2 mM). Homogénéiser à 10 000 tr / min et 4 ° C pendant 5 min.
7. Sacrifiez deux souris non traitées pour collecter du plasma vierge et des tissus, comme décrit aux étapes 5.3 et 5.4. Préparer des solutions standard NGF en utilisant des échantillons blancs de plasma ou de tissu blanc.
8. Déterminer les concentrations de NGF dans les homogénats plasmatiques et tissulaires en utilisant le kit Sandwich ELISA, comme décrit ci-dessus.

Representative Results

Le schéma d'ingénierie des particules de NGF revêtues d'alpha-tocophérol par HDL, préparé par une stratégie de paire d'ions, est illustré à la figure 1 . Pour neutraliser les charges de surface du NGF, la protamine USP a été utilisée comme agent d'une paire d'ions pour former un complexe avec du NGF. Pour protéger la bioactivité, les prototypes d'IP recombinants HDL ont été conçus, en utilisant d'abord l'homogénéisation; Ensuite, le complexe NGF / protamine a été encapsulé dans les NP prototypes. L'homogénéisation a fourni une énergie suffisante et a favorisé le mélange des excipients. Après une homogénéisation de 3 min, des particules de particules constantes (environ 170 nm) ont été obtenues pour les NP prototypes ( Figure 2 ). Apo AI a été incubé avec les NP prototypes dans différentes conditions, y compris 2 h d'agitation à température ambiante; 4 h d'agitation à température ambiante; 4 h d'agitation à température ambiante, suivie d'une incubation pendant une nuit à 4 ° C; Et agiter à température ambiante oveRnight. Plus de 26% d'Apo AI ont été incorporés dans les NP lorsqu'ils sont agités à température ambiante pendant une nuit. Pour ajouter le complexe NGF-protamine, le complexe a été incubé avec les NP prototypes pendant 30 min à 37 ° C, puis Apo AI a été ajouté au mélange pour terminer le revêtement final d'Apo AI à la surface des NP. À l'aide de la procédure décrite ici, les NP NGF HDI imitant les particules ont une taille de particules de 171,4 ± 6,6 nm (n = 3), avec 65,9% de l'efficacité de piégeage de NGF ( tableau 1 ). NGF HDIM-imitant NP ont une légère charge négative ( tableau 1 ). Les NP ont une distribution de taille étroite, et l'incorporation de NGF dans les NP n'a pas affecté la taille des particules ( Figure 3 ).

Pour mesurer l'efficacité de piégeage du NGF, diverses méthodes ont été évaluées pour séparer le NGF déchargé des NGF NIMF imitant les IP. De manière inattendue, le NGF ne peut pas passer un filtre de séparation (seuil de poids moléculaire: 100 kDa). Gel fiLes colonnes de ltration, y compris Sephadex G-50, Sephadex G-100 et Sephacryl S-100, ne peuvent pas séparer les NGF déchargés et les NGF HDL-mimiant NPs, car les deux sortent dans les mêmes fractions après élution. Une colonne Sepharose CL-4B a effectué la séparation avec le chargement optimisé d'échantillon, le tampon d'élution et le taux d'élution. Comme le montre la figure 4 , les NGF déchargés de NGF et NGF ont été complètement séparés sur une colonne Sepharose CL-4B.

Une méthode de dialyse a été utilisée pour étudier la libération in vitro de NGF HDM-imitant NP dans PBS avec 5% de BSA, qui a été inclus pour imiter les conditions physiologiques dans le sang. En augmentant la taille du dispositif de dialyse (seuil de poids moléculaire: 300 kDa) et en ajoutant PBS et BSA au milieu de libération, le NGF ne s'est pas lié à la membrane de dialyse et a traversé librement. En conséquence, la récupération du NGF libre dans cette méthode de dialyse était supérieure à 85% ( figure 5 ). NGFLes IPs mimant le HDL ont montré un profil à libération lente, et environ 10% du NGF a été libéré des NP sur 72 h ( Figure 5 ).

Pour tester la bioactivité des NN de NGF imitant les HDL, la sous-culture de cellules PC12 ayant une forte propriété d'adhérence a été choisie pour effectuer un essai de croissance des neurites. La figure 6 représente l'imagerie de la croissance des neurites lorsque les cellules ont été traitées avec 50 ng / mL de NGF libre ( Figure 6A ) et NGF HDL-imitant les NP ( Figure 6B ). Lorsque la concentration du traitement était supérieure à 10 ng / mL, la croissance des neurites a été clairement observée au microscope. À ces concentrations élevées, les NP libres de NGF et de NGF HDL ne montrent pas une différence significative sur l'effet de l'excès de neurites. Lorsque la concentration de NGF était inférieure à 10 ng / mL, la croissance des neurites ne pouvait pas être observée clairement, à la fois pour le NGF gratuit et pour les NIP de NGF. Biodistribution stDes udies ont été effectués pour comparer les comportements in vivo des NGF libres et NGF HDL-imitant NPs. Comme le montre la figure 7 , les NP de NGF imitant les IP augmentent considérablement la concentration plasmatique et diminuent l'absorption dans le foie, le rein et la rate.

Figure 1: Le schéma d'ingénierie des nanoparticules NGF HDL-imitant préparées par une stratégie de paire d'ions. Le NGF est une molécule hydrophile chargée négativement. Un peptide cationique, la protamine, a été utilisé pour neutraliser les charges et a formé un complexe de paire d'ions avec du NGF. L'oléate de cholestérol, les phospholipides et le TPGS ont formé des prototypes NP auto-assemblés par homogénéisation. Le complexe NGF / protamine a été incorporé dans les NP prototypes. Enfin, Apo AI a été revêtu sur la surface NP après une incubation durant la nuit. Ce chiffre a été modifié de Prathipati et al. ^{Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.}

Figure 2: L'influence de l'homogénéisation sur la taille des particules des nanoparticules prototypes. Les excipients, PC, SM, PS, CO et TPGS, qui ont été dissous dans de l'éthanol, ont été ajoutés dans des flacons de verre et le solvant a été évaporé sous _un courant de N2. 1 ml d'eau a été ajouté et homogénéisé à 9 500 tr / min pour différents moments. La taille des particules des nanoparticules suivantes a été mesurée. Les données sont présentées comme la moyenne ± écart-type (n = 4). Ce chiffre a été modifié de Prathipati et al. ¹⁶ . CliCk ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Taille granulométrique et granulométrie des nanoparticules vierges HDL et des nanoparticules NGF HDL. Les granulométries et les distributions ont été mesurées à l'aide d'un analyseur de particules. Ce chiffre a été modifié de Prathipati et al. ¹⁶ . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4: Chromatogrammes de nanoparticules de NGF et de NGF HDL libres sur une colonne Sepharose CL-4B éluée par PBS. 200 μL de solution de NGF libre (10 μg / mL) et la solution de NGF NP ont été chargés sur tIl gélifie la colonne de filtration et élue avec 1x PBS. Au total, douze fractions (1 ml pour chaque fraction) ont été recueillies pour les deux échantillons. L'intensité NP dans chaque fraction a été mesurée par un analyseur de particules et la concentration de NGF dans chaque fraction a été mesurée à l'aide d'un kit ELISA Sandwich. Ce chiffre a été modifié de Prathipati et al. ^{16 .} Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5: Libération in vitro de nanoparticules de NGF imitant les HDL mesurées par une méthode de dialyse. Le PBS avec 5% de BSA a été utilisé comme support de libération. 200 μL de solution de NGF libre (10 μg / mL) ou de NGF NP ont été ajoutés à un tube de dialyse complété par 400 μL du support de sortie. Le tube de dialyse a été placé dans 30 ml de milieu de préchauffage. L'étude a été réalisée à 37 ° C avec secousse de 135 tr / min. A 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 et 72 h, 100 μL du milieu de libération ont été retirés et remplacés par 100 μL de milieu frais. La concentration de NGF dans chaque échantillon a été mesurée à l'aide d'un kit ELISA Sandwich. Les données sont présentées comme la moyenne ± écart-type (n = 4). Ce chiffre a été modifié de Prathipati et al. ¹⁶ . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6: L'influence des nanoparticules de NGF imitant les HDL sur la croissance des neurites dans les cellules PC12. Les cellules ont été traitées avec 50 ng / mL de NGF libre ( A ) et D NGF HDL-imitant les nanoparticules ( B ) pendant 7 jours. Le neurite a été imagé à l'aide d'un microscope optique inversé sous un grossissement 10X. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7: Comparaison de la biodistribution entre nanoparticules de NGF et de NGF HDL libres chez les souris (n = 3). Les souris ont été administrées avec 40 mg / kg de NGF par injection de queue-veine et ont été sacrifiées à 30 min après administration. Le sang, le foie, la rate et le rein ont été recueillis et la concentration de NGF dans chaque échantillon a été mesurée à l'aide d'un kit ELISA Sandwich. Les données sont indiquées en moyenne ± écart-type. Ce chiffre a été modifié de Prathipati et al. ¹⁶ ."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55584/55584fig7large.jpg" target = "_ blank"> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Échantillon	Taille des particules (nm)	PI	EE% de NGF	Potentiel Zeta (mV)
NGF HDI-imitant NPs	171,4 ± 6,6	0,239 ± 0,01	65,9 ± 1,4	-12,5 ± 1,9

Tableau 1: Caractérisation des nanoparticules de NGF HDL-imitant (n = 3). Les données sont indiquées en moyenne ± écart-type. Ce tableau a été modifié à partir de Prathipati et al. ¹⁶ .

Discussion

Dans cette étude, nous démontrons une méthode simple pour préparer les NP NP mimantant le HDL pour l'encapsulation de NGF. Divers systèmes de distribution de NP ont été étudiés pour délivrer des protéines. À l'heure actuelle, de nombreuses préparations NP nécessitent une dialyse, des précipitations au solvant et une hydratation du film. Ces processus sont généralement compliqués et difficiles à relever lors de l'extension. Au cours de ce développement de NP, il a été déterminé que les lipides avaient une forte adhérence à la paroi de verre du récipient, ce qui a entraîné des difficultés pour hydrater le film mince et mélanger efficacement les excipients. Étant donné les multiples composants dans les NPN HD naturels, le mélange est devenu très difficile et crucial pour la préparation de NPs imitant HDL. Selon les résultats, l'augmentation de la température et du temps de mélange n'affectait pas la formation de NP. L'homogénéisateur est un instrument commun dans la fabrication industrielle et fournit une énergie élevée et une force de cisaillement pour le mélange. En appliquant cet instrument à la préparation NP, les NP monodispersés avec le aDes tailles de propriétés ont été produites en 3 min ( Figure 2 et Figure 3 ), ce qui a considérablement réduit le temps de fabrication et simplifié la procédure de préparation.

Le grand défi d'appliquer des macromolécules à l'administration thérapeutique n'est pas seulement une livraison, mais aussi une formulation. Les protéines sont normalement solubles dans l'eau et ont de grandes tailles et charges sur leurs surfaces, ce qui empêche l'encapsulation des protéines dans les NP à base de lipides. Protamine USP, un polycation, a été utilisé pour former un complexe de paire d'ions avec du NGF. Après avoir mélangé le NGF et la protamine, le précipité blanc indiquant la formation du complexe insoluble a été clairement observé. Avec l'aide du complexe, environ 70% du NGF a été piégé dans les NP, avec une distribution de taille étroite ( tableau 1 et figure 3 ). En outre, la stabilité des protéines devait être considérée lors du développement de la formulation. Pour éviter l'influence de l'homogénéisationSur la stabilité du NGF, la procédure a été ajustée pour ajouter un complexe de NGF après homogénéisation. Dans un état d'incubation très doux (30 min à 37 ° C), le complexe NGF a été incorporé dans les NP. Différentes procédures ont été testées pour ajouter Apo AI; Cependant, une incubation pendant la nuit à température ambiante était encore nécessaire pour charger suffisamment d'Apo AI à la surface des IP. Sur la base des résultats du test de croissance des neurites, la bioactivité du NGF après la préparation de NP a été maintenue avec succès avec la procédure présentée ici ( Figure 6 ). De plus, l'encapsulation du NGF dans les NPs mimantant le HDL a amélioré la circulation sanguine du NGF, comme l'indiquent les études de biodistribution ( Figure 7 ). Ces résultats démontrent que le NGF a été formulé avec succès avec un système de livraison de NP. Les NPs mimantant le HDL peuvent aider le NGF, ce qui permet une longue vie et une stabilité in vivo .

L'élaboration de méthodes analytiques appropriées est également chaEn ce qui concerne les nanomédicaments à base de protéines. Pour mesurer l'efficacité du piégeage et la libération in vitro , il est obligatoire de séparer le médicament non chargé des nanoparticules chargées de médicaments. Les membranes avec certains seuils de poids moléculaire sont couramment utilisées à cet effet et fonctionnent bien pour les petites molécules. Cependant, il n'est pas facile de séparer les protéines déchargées et les nanoparticules chargées de protéines, principalement en raison des tailles et propriétés de liaison similaires des protéines. Les NP libres chargés de NGF et NGF HDL ne peuvent être séparés à l'aide du dispositif de filtration à base de membrane, bien que le seuil de poids de la membrane soit de 100 kDa (la plus grande taille de pores pour les dispositifs de filtration commerciaux). Une fois que plusieurs colonnes de filtration sur gel ont été testées, les NP libres de NGF et de NGF HDL ont été finalement séparés en utilisant une colonne Sepharose CL-4B. Cependant, l'échantillon chargé sur la colonne devait être maintenu à 200 μl pour obtenir des chromatogrammes reproductibles. Les agents d'élution étaient également importants. Lorsque l'eau a été utiliséePour éluer le NGF, un chromatogramme très large a été obtenu; Le NGF a été détecté à partir des fractions 5 à 20. Le chromatogramme général a pu être causé par la forte interaction entre le NGF et les perles. Après plusieurs essais d'élution tels que NaCl 5 mM et NaCl 50 mM, on a testé le PBS comme agent d'élution suffisant. En outre, le défi de séparation restait pour les études in vitro . La séparation des colonnes n'est pas appropriée pour les études de libération in vitro en raison du nombre d'échantillons libérés à mesurer et du potentiel de libération supplémentaire de NGF des IP lorsqu'ils passent la colonne. Une fois que diverses conditions ont été testées, la méthode de dialyse décrite dans le protocole a été déterminée. Selon les résultats ( figure 5 ), le NGF libre peut passer librement la membrane traversante (seuil de poids moléculaire: 300 kDa) dans du PBS contenant 5% de BSA. Avec ce contrôle positif, le résultat de la publication de NGF HDM-imitant NPs est devenu fiable. La taille des pores augmentée et décLa liaison membranaire provoquée par PBS et BSA a contribué à la pénétration libre de NGF à travers la membrane de dialyse.

En plus des problèmes susmentionnés, un autre défi avec le test de croissance des neurites a été soulevé. Il existe un kit de dosage de croissance de neurites commercial basé sur un sous-clone de cellules PC12. Cependant, le sous-clone de cellules PC12 n'est plus disponible dans le commerce. Les cellules PC12 normales sont des cellules flottantes qui ne poussent pas très bien les neurites et qui sont faciles à perdre pendant les procédures expérimentales. Après plusieurs échecs, une petite population de cellules PC12 ayant une forte propriété d'adhérence a été découverte. Ainsi, cette population de cellules a été sélectionnée à travers plusieurs passages, comme décrit dans le protocole. En conséquence, le dosage a été mené avec succès et démontre la bioactivité comparable des NNP de NGF imitant les HDL avec NGF gratuit ( Figure 6 ).

La méthode rapportée ici est une procédure simple pourE préparation de NPs imitant HDL. Nous avons piégé plus de 26% d'Apo AI sur les NP, ce qui était plus de 3 fois plus élevé que celui indiqué dans la littérature ¹⁶ . Plus de 65% des NGF ont été piégés dans les NP, ce qui était 2 fois plus élevé que dans la littérature ¹⁶ . Avec ces augmentations de l'efficacité de piégeage pour Apo AI et NGF, il peut ne pas être nécessaire de purifier les NP. Par conséquent, la préparation de NP a été simplifiée. L'Apo AI et le NGF non chargés dans la préparation NP n'ont pas influencé la libération in vitro de NGF ( Figure 6 ) et la biodistribution in vivo ( Figure 7 ), mais elle pourrait influencer la stabilité et les études cellulaires in vitro . Les études ici démontrent qu'il est possible d'améliorer encore l'efficacité de piégeage d'Apo AI et de NGF en modifiant la composition de NP et les procédures de préparation. En outre, les nouveaux IPs mimantant HDL et les stratégies dans ces études pourraient être utilisés pour charger d'autres grD'autres facteurs, bien que l'agent de paire d'ions (protamine) puisse être changé pour s'adapter au facteur de croissance spécifique. Le stockage à long terme des formulations de protéines est difficile. La manière préférée de garder les NP chargées de protéines est de les lyophiliser pour sécher des poudres. Cependant, la lyophilisation pourrait augmenter la taille des particules et diminuer l'efficacité de piégeage de la protéine après la reconstitution des NP lyophilisés. Peu de publications ont discuté de la lyophilisation des lymphocytes anti-HDL. Nous étudions la lyophilisation des nouveaux IPs mimés par HDL. Finalement, les IPs mimantant HDL pourraient devenir cliniquement applicables lorsqu'elles peuvent être stockées de manière appropriée pendant une longue période de temps (au moins 6 mois).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Recombinant Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-α-Phosphatidylcholine (PC)	Avanti	131601P	95%, Egg, Chicken
Sphingomyelin (SM)	Avanti	860062P	Brain, Porcine
Phosphatidylserine (PS)	Avanti	840032P	Brain, Porcine
Cholesteryl oleate (CO)	Sigma	C9253
D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate
Protamine sulfate	Sigma	P3369	meets USP testing specifications
Apolipoprotein A1, Human plasma	Athens Research & Technology	16-16-120101	1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4
Sepharose 4B-CL	Sigma	CL4B200	Cross-linked agarose,  gel filtration chromatography column filling material
Sandwich ELISA Kit for NGF	R&D system	DY008
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
RPMI-1640 medium	GE Healthcare Life Science	SH30096.02
Horse serum	GE Healthcare Life Science	SH30074.03
Fetal bovine serum	Gibco	10082147
PC12 cells	ATCC	CRL-1721
Rat tail collagen type I	Sigma	C3867
Sodium acetate	Sigma	S2889
Sodium chloride	Sigma	31414
Triton X-100	Sigma	T8787
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Benzethonium chloride	Sigma	B8879
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Homogenizer	Tekmar	T 25-S1
Delsa Nano HC particle analyzer	Beckman-Coulter	Delsa Nano HC
Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device	Spectrum Laboratories	G235036	Molecule Cutoff 300 kDa
Centrifuge	Eppendoff	5424R
Polytron homogenizer	Kinematica	PT 1200C
DecapiCone	Braintree Scientific Inc.	DC-M200