Summary
Basit homojenizasyon, sinir büyüme faktörünü kapsüllemek için yeni, yüksek yoğunluklu, lipoprotein-taklit nanoparçacıklar hazırlamak için kullanıldı. Bu makalede, nanoparçacık hazırlığı, in vitro karakterizasyon ve in vivo çalışmalar için zorluklar, ayrıntılı protokoller anlatılmıştır.
Abstract
Bu makalenin amacı, sinir büyüme faktörü (NGF) yüklü, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) -impek nanopartiküller (NP) için hazırlama ve karakterizasyon yöntemlerini tanıtmaktır. HDL'ler endojen NP'lerdir ve terapötik ajanlar verilmesi için araçlar olarak araştırılmıştır. HDL'yi taklit eden NP'leri hazırlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, genellikle karmaşıktır, zaman alıcıdır ve endüstriyel ölçeklendirme için zorlanmaktadır. Bu çalışmada, yardımcı maddeleri karıştırmak ve prototip NP'ler oluşturmak için bir adımlı homojenleştirme kullanılmıştır. NGF, 26 kDa'lık suda çözünür bir proteindir. NGF'nin HDL'yi taklit eden NP'lerin lipid ortamına kapsüllenmesini kolaylaştırmak için protamin USP, NGF yüzeyindeki yükleri nötralize etmek için NGF ile bir iyon-çift kompleksi oluşturmak için kullanıldı. Daha sonra NGF / protamin kompleksi, prototip NP'lere sokuldu. Apolipoprotein AI nihayet NP yüzeyinde kaplandı. NGF HDL'yi taklit eden NP'ler terimde tercih edilen özellikleri gösterdiBoyut dağılımı, tuzaklanma verimi, in vitro serbest bırakma, biyo-aktivite ve biyo-dağılım. HDL'yi taklit eden NP'lerde dikkatli bir tasarım ve homojenleştirme araştırması ile prosedürü büyük ölçüde basitleştirildi ve NP'ler ölçeklenebilir hale getirildi. Üstelik boşaltılan NGF'nin NP'lerden ayrılması, güvenilir in vitro salınım çalışmaları yapılması ve NP'lerin biyoaktivitesinin ölçülmesi gibi çeşitli zorluklar aşılmıştır.
Introduction
Proteinler, peptitler ve nükleik asitler gibi makromoleküller umut verici ilaçlar olarak ortaya çıkmakta ve son on yılda 1 , 2 önemli derecede ilgi görmüştür. Yüksek etkililiği ve spesifik hareket modları nedeniyle, kanser, bağışıklık sistemi hastalıkları, HIV ve ilgili koşullar 3 , 4'ün tedavileri için mükemmel tedavi potansiyeline sahiptirler. Bununla birlikte, büyük molekül boyutu, üç boyutlu yapı, yüzey yükleri ve hidrofilik doğa gibi fizyokimyasal özellikler, bu makromoleküllerin in vivo dağıtılmasını zorlaştırmaktadır. Bu onların klinik kullanımını önemli ölçüde engeller 4 . Mikropartiküller, polimer nanopartikülleri (NP), lipozomlar ve lipid NP'leri gibi ilaç dağıtım sistemlerinde son zamanlarda kaydedilen ilerlemeler, bu güçlükleri aştı ve makro moleküllerin in vivo teslimatını önemli ölçüde geliştirdi. HoDüşük ilaç yükleme kapasitesi, düşük tuzaklanma verimi, kısa yarılanma ömrü, biyoaktivite kaybı ve istenmeyen yan etkiler de dahil olmak üzere, bu teslim kargolarıyla ilgili bazı dezavantajlar ortaya çıkmıştır 5 , 6 , 7 , 8 . Etkili taşıyıcı sistemler, araştırma konusu olmaya devam etmektedir. Ayrıca, uyuşturucu yüklü NP'leri karakterize etmek için analitik yöntemlerin geliştirilmesi makromoleküller için küçük moleküllerden ziyade daha zorlayıcıdır.
Yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL), apolipoproteinler ve bir fosfolipid tek tabaka tarafından kaplanan bir lipid çekirdeğinden oluşan doğal bir NP'dir. Endojen HDL, SR-BI, ABCAI ve ABCG1 gibi hedef reseptörlerle etkileşimi yoluyla lipidlerin, proteinlerin ve nükleik asitlerin taşınmasında kritik bir rol oynamaktadır. Farklı terapötik ajanların verilmesi için bir araç olarak araştırılmıştır 9, 10 , 11 , 12 . HDL'yi taklit eden NP'leri hazırlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Diyaliz, popüler bir yaklaşımdır. Bu yöntemde, NPs, bir lipid filmi sodyum klorür çözeltisi kullanarak hidratlayarak oluşturulur. Tuz 3 saatlik tamponlarla 2 günlük bir diyaliz vasıtasıyla uzaklaştırılır. Sonikasyon yöntemleri, lipid karışımını ısıtma koşullarında 60 dakika sonikleştirerek NP'leri üretir; NP'ler jel kromatografisiyle ( 14) daha da arıtılır. Mikroakışkanlar, odaklanma modelinde mikrovorteks yaratarak fosfolipidleri ve apolipoprotein AI (Apo AI) solüsyonlarını karıştıran bir mikroakışkan cihaz aracılığıyla NP üretir. Açıkçası, bu yöntemler, endüstriyel ölçeklendirme için zaman alıcı, sert ve zor olabilir.
Bu yazıda, sinir için yeni HDL'yi taklit eden NP'lerin hazırlanması ve karakterize edilmesiBüyüme faktörü (NGF) kapsülleme. NGF, iki 13.6-kDa polipeptid monomeri ihtiva eden bir disülfid bağlı polipeptid homodimeridir. NP'leri homojenizasyon ile hazırlamaya yönelik yenilikçi bir prosedür, ardından NP'ler içine NGF'nin kapsüllenmesi geliştirildi. NGF HDL'yi taklit eden NP'ler parçacık boyutu, boyut dağılımı, zeta potansiyeli ve in vitro salım için karakterize edildi. Biyolojik aktiviteleri, PC12 hücrelerinde nörit büyümesi için değerlendirildi. NGF HDL'yi taklit eden NP'lerin biyolojik dağılımı, farelerde intravenöz enjeksiyondan sonra serbest NGF'nin biyolojik dağılımı ile karşılaştırıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bütün prosedürlere dahil edilen hayvan çalışmaları Kuzey Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. NGF HDL'yi taklit eden nanoparçacıkların hazırlanması
- 1 mg / mL'de stok solüsyonları hazırlamak için etanol içinde yardımcı maddeler olan fosfatidilkolin (PC), sfingomiyelin (SM), fosfatidilserin (PS), kolesteril oleat (CO) ve D-α-tokoferil polietilen glikol süksinat (TPGS) çözündürülür.
NOT: Stok çözeltileri aliquoted ve -20 ° C'de saklanır. Kolesteril oleat koyu renk şişelerde saklandı. PC, SM, PS ve CO stok çözeltileri -20 ° C'de sırasıyla 6, 3, 12 ve 12 ay boyunca sabit kalmıştır. TPGS çözeltisi -20 ° C'de en az 12 ay boyunca stabildi. - 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 10 μL protamin USP (suda 1 mg / mL) ile NGF (su içerisinde 1 mg / mL) 10 μL karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.Kompleksi oluştur.
NOT: NGF ve protamin stok solüsyonları aliquoted edildi ve -20 ° C'de saklandı. NGF stokları için tekrarlanan donma ve çözme önerilmez. - Bir cam flakona 59 μL PC, 11 μL SM, 4 μL PS, 15 μL CO ve 45 μL TPGS ekleyin. Etanolü yaklaşık 5 dakika nazik azot akımı altında karıştırın ve buharlaştırın; Tüm eksipiyanlar, cam flakonun alt kısmında yağlı, ince bir film oluşturmalıdır.
- Şişeye 1 mL ultrapure (tip 1) su ekleyin ve prototip NP'leri oluşturmak için oda sıcaklığında 5 dakika 9,500 rpm'de (8,600 xg) homojenize edin.
- Adım 1.2'de hazırlanan kompleksi prototip NP'lere ekleyin ve cam flakon içerisinde küçük bir karıştırma çubuğu kullanarak karıştırarak 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- NP'leri 30 dakika daha oda sıcaklığında karıştırarak soğutun. Bu soğumadan sonra, 106 uL Apo AI (1.49 mg / mL) ilave edin ve gece boyunca oda sıcaklığında karıştırarak nihaiNGF HDL'yi taklit eden NP'ler.
2. NGF HDL-taklit eden Nanopartiküllerin Karakterizasyonu
- Üreticinin talimatlarına göre bir parçacık analizcisi kullanarak parçacık boyutunu ve zeta potansiyelini ölçün (Malzeme Tablosuna bakın).
- NGF HDL'yi taklit eden NP'lerden boşaltılan NGF'yi ayırmak ve NGF'nin tuzaklanma verimliliğini belirlemek için çapraz bağlı bir agaroz jel filtrasyon kromatografısi sütunu kullanın.
- Kolon hazırlığı için, 15 mL Sepharose 4B-CL süspansiyonunu 50 mL'lik bir behere aktarın. Boncuk süspansiyonunu bir cam çubuk yardımıyla karıştırın ve bazılarını bir sütuna (30 cm uzunluğunda × 1 cm çapında, alt kısmında cam frit ile birlikte) boşaltıp içine dökün. Kabarcıklardan kurtulmak için hafifçe dokunun. Çözücünün boşaltılmasına ve boncukların birkaç dakika çökelmesine izin verin.
- Kalan süspansiyonu ilave etmeye devam edin. Boncukları temizlemek için kolonun iç cidarını durulayın. Solventi, solvent seviyesi hafifçeDurağan fazın üstünü kaldırın. Kolonu 20 mL 1x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 8 mM Na2HPO4 ve 2 mM KH2PO4 içeren) ile yıkayıp kondüsyonlayın.
- Boşalan NGF içeren fraksiyonları belirlemek için, jel filtrasyon sütununa (25 cm uzunluk x 1 cm çap) 200 μL NGF solüsyonu (10 μg / mL) yükleyin ve 1x PBS ile elute edin.
- Toplam 12 fraksiyon (her fraksiyon için 1 mL) toplayın ve NGF için bir Sandwich ELISA kiti kullanarak her bir fraksiyonda NGF konsantrasyonunu ölçün.
- Sandwich ELISA kiti kullanılarak 6 ila 10 fraksiyonlarından NGF'yi tespit edin. Sütun üzerine boşaltılan NGF'nin bir kromatogramı elde edin. Kolonu 20 mL PBS ile yıkayın.
- NGF HDL'yi taklit eden NP'leri içeren fraksiyonları belirlemek için kolona 200 uL NP yükleyin ve 1x PBS ile elute edin. Toplam 12 fraksiyon toplamak (her fraksiyon için 1 mL) ve her fraksiyondaki partiküllerin yoğunluğunu ölçün uParçacık boyutu analizörünü söyle. NGF NP'lerini fraksiyonlar 2-4'ten tespit edin.
NOT: Yoğunluk, test çözeltisinde kaç nanopartikül bulunabileceğini belirten parçacık analizcisi tarafından ölçülen bir parametredir. Çözümde ne kadar çok NP var ise yoğunluk o kadar yüksek olur. Bu yaklaşımla, sütunun NGF NP'lerini boşaltılan NGF'den ayırt edebildiğini doğrulayabiliriz. - NGF'nin tuzaklanma verimliliğini ölçmek için 200 μL NGF HDL'yi taklit eden NP'leri kolona yükleyin ve 1x PBS ile elute edin. Toplam 12 fraksiyon toplamak (her fraksiyon için 1 mL).
- Sandwich ELISA kiti kullanılarak 6'dan 10'a kadar olan fraksiyonlardan boşaltılan NGF konsantrasyonunu ölçün.
- Boşaltılan NGF olarak 6 ila 10 fraksiyonlarından ölçülen NGF miktarlarını ekleyin ve aşağıdaki denklem kullanılarak NGF'nin yakalama verimliliğini hesaplayın.
% EE = (1 - boşaltılan NGF / NP'ye eklenen toplam NGF) x% 100 Denklem (1)
3. In vitro NGF HDL salınımıKötüye Kullanan Nanopartiküller
- Serbest NGF (su içerisinde 10 μg / mL; n = 4) ve NGF HDL'yi taklit eden NP'leri (10 μg / mL; n = 4) paralel çalışın.
- Üreticinin talimatlarına uyarak 8 diyaliz borusunu (molekül ağırlığı kesilmesi: 300 kDa) önceden muamele edin.
- Serbest bırakma ortamı olarak PBS'de% 5 bovin serum albümini (BSA) hazırlayın. 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 30 mL serbest bırakma ortamı ekleyin ve 135 rpm'de çalkalama hızı olan bir çalkalayıcıda 37 ° C'ye kadar ısıtın. Değiştirilmek üzere çalkalayıcıya başka bir 50 mL boşaltma ortamı yerleştirin.
- Diyaliz tüpüne 400 μL serbest bırakma ortamı ekleyin ve diyaliz için yeterli hacim elde etmek için hızlıca 200 μL test numunesini ekleyin.
- Tüpü kapatın ve diyaliz borusunu serbest bırakma ortamına (santrifüj tüpü) hızlıca yerleştirin. Zaman 0 için numune olarak dış diyaliz borusundan 100 uL serbest bırakma ortamını hızla geri çekin. Sonradan analiz için numuneyi -20 ° C'ye derhal koyun. 100 μL taze reGeri alınan numunenin yerini almak için orta santrifüj tüpüne koyun. Zamanlayıcıyı çalıştır.
- 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 ve 72 saatte, 100 uL serbest bırakma ortamını geri çekin ve 100 uL taze ortam ile değiştirin. Geri alınan örnekleri derhal analiz için -20 ° C'ye getirin.
- 72 saat sonra, tüm numuneleri -20 ° C'den çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün. Salınım numunelerinin NGF konsantrasyonlarını Sandwich ELISA kiti kullanarak ölçün.
4. NGF HDL-taklit eden Nanopartiküllerin Biyoaktivitesi (Nörit Gelişme Çalışması)
- % 10 ısı ile inaktive edilmiş at serumu,% 5 sığır fetüsü serumu, 100 ug / mL streptomisin ve 100 ünite / mL penisilin ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamında PC12 hücreleri kültür. 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile nemli bir kuluçka hücresinde hücreleri muhafaza edin.
- Hücreler ~% 70-80 konfluansa ulaştığında, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri 1x PBS ile yıkayın (yaklaşık 10 mL /Sup> 2 kültür yüzey alanı). Yıkama çözeltisini çıkarın. Şişeye% 0.25 Trypsin-EDTA solüsyonu (0.25% tripsin ve 1 mM EDTA; 0.5 mL / 10 cm 2 kültür yüzeyi alanı) ilave ederek hücreleri Trypsinize edin ve çoğu hücre ayrılıncaya kadar 37 ° C'de inkübe edin.
- Kültür ortamı iki hacim ekleyin ve 180 xg'de 5 dakika aşağı doğru döndürün. Süpernatantı çıkarın ve hücre topağını 5 mL kültür ortamında tekrar süspanse edin. Hücre kümelerini kırmak için hücreleri 22 G, ½ inç iğne ile filtreleyin.
- Hücreleri yeni bir hücre kültürü şişesi içine 1: 3 oranında bölün. Gecelik inkübe edildikten sonra, bağlanmamış PC12 hücrelerini çıkarın. Ekteki hücrelerin daha fazla büyüme için kalmasına izin verin.
- Güçlü bir yapışma özelliğine sahip PC12'nin altkültürünü seçmek için bu prosedürü 3 pasaj için tekrarlayın. 800 μL / kuyucuk sıçan kuyruğu kolajeni tip I (100 μg / mL) ile 6 oyuklu bir plakayı önceden kaplayın.
- Seçilen PC12 hücrelerini aşama 4.2'de açıklandığı gibi deneyin ve bunları birHücre kümelerini kırmak için 22 G, ½ inç iğne. Hemocytometer ile hücreleri sayın. Hücreleri, plakaya yapışmalarına izin vermek için adım 4.5'te önceden kaplanmış 6 oyuklu plakada gece boyunca 10.000 hücre / oyuk yoğunluğunda tohumlandı.
- 0.5, 1, 5, 10, 50 ve 100 ng / mL konsantrasyonlarını hazırlamak için kültür ortamı (adım 4.1'de açıklandığı şekilde) ile serbest NGF (10 ug / mL) ve NGF HDL'yi taklit eden NP'leri (10 ug / mL) seyreltin. Her oyuktan 2 mL ortam çıkarın ve sulandırılmış serbest NGF veya NGF HDL'yi taklit eden NP'lerin 2 mL'si ile değiştirin. Kültür 4 gün boyunca.
- 4. günde, ortamı uygun tedaviyi içeren taze ortama (adım 4.1'de açıklanmıştır) değiştirin ve tedaviyi 3 gün daha devam ettirin.
- 7. günde hücreleri ters ışık mikroskopu ile görselleştirin ve her birinin 10X büyütme altında rasgele noktalar halinde görüntüsünü alın.
5. NGF HDL'yi taklit eden nanoparçacıkların biyolojik dağılımı
- Yetişkin BALB / c farelerini (erkek, 25-30 g) to tNGF NP'lerin doku dağılımı. Fareler, grup başına 3 fareden oluşan üç gruba rasgele bölünürler. Vazodilatasyon ve damarın görünürlüğünü desteklemek için bir fareyi kısıtlamak ve kuyrukluğunu etanol ile silmek için koni şekilli bir plastik tutucu ( örn. Dekapikon) kullanın.
- Her bir fareye (3 grup) 100 μL salin, serbest NGF veya NGF HDL'yi taklit eden NP'leri 40 μg / kg NGF dozunda kuyruk damarları yoluyla enjekte edin. 1 mL'lik şırıngaya bağlı 30½ G'lik bir iğne kullanın.
- Enjeksiyondan 30 dakika sonra,% 3 inhale izofluran (2 L / dakika akış oranında oksijen) kullanarak farelere anestezi uygulayın. Anestezi derinliğini belirlemek için bir kuyruk ve ayak parmakları tutturun. Kalp ponksiyonuyla kan toplayın.
- Kalpten yaklaşık 1 mL kan alın. Her fareyi servikal çıkıkla euthanize edin.
- Fare karkasını sırt sırta oturtun. Karnınızı cerrahi makas kullanarak açın ve yağ ve bağırsağı kenara çekin.Karaciğer, dalak ve böbrekleri açığa vurmak için pamuklu çubuk kullanarak. Bu dokuları hasat edin ve kanı temizlemek için 1x PBS içinde durulayın.
- Plazmayı elde etmek için hemen kan örneklerini 3,400 xg'de ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Analizler oluncaya kadar plazmayı ve dokuları -80 ° C'de saklayın.
- Doku örneklerini analiz etmek için, numuneleri -80 ° C'den 4 ° C'ye hareket ettirin ve 100 mg doku örneğini 10x hacimlik bir ekstraksiyon tamponunda (0.05 M sodyum asetat, 1.0 M sodyum klorür,% 1 triton X-100, % 1 BSA, 0.2 mM fenilmetansülfonil fluorür ve 0.2 mM benzetonyum klorid) ile yıkandı. 10,000 rpm'de ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca homojenize edin.
- Adım 5.3 ve 5.4'te açıklandığı gibi boş plazma ve dokuları toplamak için iki muamele edilmemiş fareyi kurban edin. Boş plazma veya boş doku homojenatları kullanarak NGF standart solüsyonları hazırlayın.
- Plazma ve doku homojenatlarındaki NGF konsantrasyonlarını yukarıda tarif edildiği gibi Sandwich ELISA kiti kullanarak belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir iyon çift stratejisi ile hazırlanan, HDL'yi taklit eden α-tokoferol kaplı NGF NP'lerin mühendislik şeması Şekil 1'de gösterilmektedir. NGF'nin yüzey yüklerini nötralize etmek için, protamin USP, NGF ile bir kompleks oluşturmak için bir iyon çift ajan olarak kullanılmıştır. Biyoaktiviteyi korumak için HDL'yi taklit eden prototip NP'ler ilk önce homojenleştirme kullanılarak üretildi; Daha sonra, NGF / protamin kompleksi, prototip NPS içine kapsüllendi. Homojenizasyon, yeterli miktarda enerji sağladı ve yardımcı maddelerin karıştırılmasını başarılı bir şekilde ilerletti. 3 dakika homojenizasyondan sonra, prototip NP'ler için tutarlı parçacık boyutları (yaklaşık 170 nm) elde edildi ( Şekil 2 ). Apo AI, prototip NP'ler ile, oda sıcaklığında 2 saat karıştırma dahil olmak üzere farklı koşullarda inkübe edildi; Oda sıcaklığında 4 saat karıştırma; Oda sıcaklığında karıştırma 4 saat sonra, 4 ° C'de gece boyunca inkübe edildi; Ve oda sıcaklığında karıştırma overnight. Apo AI'nın% 26'sından fazlası oda sıcaklığında gece boyunca karıştırılarak NP'lere dahil edildi. NGF-protamin kompleksini eklemek için, kompleks prototip NP'ler ile 37 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edildi ve daha sonra Apo AI, karışım yüzeyine eklendi ve NP'lerin yüzeyinde Apo AI'nın son kaplaması tamamlandı. Burada açıklanan prosedürü kullanarak, nihai NGF HDL-taklit NP'leri partikül boyutları 171.4 ± 6.6 nm (n = 3), NGF yakalama verimliliğinin% 65.9'u ile ( Tablo 1 ) vardı. NGF HDL'yi taklit eden NP'lerin hafif bir negatif yükü vardı ( Tablo 1 ). NP'lerin dar bir boyut dağılımı vardı ve NFS'yi NP'lere dahil etmek parçacık boyutunu etkilemiyordu ( Şekil 3 ).
NGF'nin yakalama verimliliğini ölçmek için, boşaltılan NGF'yi NGF HLD'yi taklit eden NP'lerden ayırmak için çeşitli yöntemler değerlendirildi. Beklenmedik bir şekilde NGF, bir ayırma filtresi (molekül ağırlığı kesilmesi: 100 kDa) geçemez. Jöle fiSephadex G-50, Sephadex G-100 ve Sephacryl S-100'ü içeren filtreleme kolonları boşaltılan NGF ve NGF HDL'yi taklit eden NP'leri ayıramaz çünkü her ikisi de elüsyon sonrası aynı fraksiyonlarda ortaya çıkar. Bir Sepharose CL-4B kolonu, optimize numune yükleme, elüsyon tamponu ve elüsyon oranı ile ayırmayı gerçekleştirdi. Şekil 4'te gösterildiği gibi, boşaltılmış NGF ve NGF HDL'yi taklit eden NP'ler, bir Sepharose CL-4B kolonu üzerinde tamamen ayrılmıştır.
Bir diyaliz yöntemi, kan içindeki fizyolojik koşulları taklit etmek üzere dahil edilen% 5 BSA ile PBS'de NGF HDL'yi taklit eden NP'lerin in vitro salımını incelemek için kullanıldı. Diyaliz cihazının boyutunu arttırarak (molekül ağırlığı kesme: 300 kDa) ve serbest bırakma ortamına PBS ve BSA ekleyerek, NGF diyaliz zarına bağlanmadı ve serbestçe geçti. Sonuç olarak, bu diyaliz yönteminde serbest NGF'nin düzelmesi% 85'in üzerindeydi ( Şekil 5 ). NGFHDL'yi taklit eden NP'ler yavaş bir salınım profili gösterdi ve NGF'nin yaklaşık% 10'u NP'lerden 72 saat sonra serbest bırakıldı ( Şekil 5 ).
NGF HDL'yi taklit eden NP'lerin biyoaktivitesini test etmek için güçlü bir yapışma özelliğine sahip olan PC12 hücrelerinin altkültürü, bir nevrit büyüme tahlili yapmak için seçildi. Şekil 6 , hücreler, 50 ng / mL serbest NGF ( Şekil 6A ) ve NGF HDL-taklit NP'leri ( Şekil 6B ) ile muamele edildiğinde nörit büyümesinin görüntüsünü temsil etmektedir. Tedavi konsantrasyonu 10 ng / mL'den yüksek olduğunda, nevrit çıkışı mikroskopta açıkça gözlenmiştir. Bu yüksek konsantrasyonlarda, serbest NGF ve NGF HDL'yi taklit eden NP'ler, nevrit büyüme etkisinde önemli bir fark göstermedi. NGF konsantrasyonu 10 ng / mL'den düşük olduğunda hem serbest NGF hem de NGF HDL'yi taklit eden NP'ler için nevrit büyüme gözlemlenemedi. Biyolojik çeşitlilik stSerbest NGF ve NGF HDL'yi taklit eden NP'lerin in vivo davranışlarını karşılaştırmak için udies yapıldı. Şekil 7'de gösterildiği gibi, NGF HDL'yi taklit eden NP'ler, plazma konsantrasyonunu önemli ölçüde arttırdı ve karaciğer, böbrek ve dalaktaki alım miktarını azalttı.
Şekil 1: İyon-çift stratejisi ile hazırlanan NGF HDL-taklit nanopartiküllerin mühendislik şeması. NGF negatif yüklü bir hidrofilik moleküldür. Katyonik bir peptid, protamin, yükleri nötralize etmek için kullanıldı ve NGF ile bir iyon-çift kompleksi oluşturdu. Kolesteril oleat, fosfolipidler ve TPGS, homojenleştirme ile kendinden montaj prototip NP'leri oluşturdu. NGF / protamin kompleksi prototip NP'lerine dahil edildi. Son olarak, Apo AI, gece boyunca inkübasyondan sonra NP yüzeyinde kaplandı. Bu rakam Prathipati ve diğerleri tarafından değiştirildi . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Homojenleşmenin prototip nanoparçacıkların partikül boyutu üzerindeki etkisi. Etanol içinde çözülen yardımcı maddeler, PC, SM, PS, CO ve TPGS cam şişelere ilave edildi ve çözücü N2 akımı altında buharlaştırıldı. 1 mL su ilave edildi ve farklı zamanlarda 9,500 rpm'de homojenize edildi. Sonraki nanoparçacıkların parçacık boyutları ölçülmüştür. Veriler, ortalama ± standart sapma (n = 4) olarak sunulmuştur. Bu rakam Prathipati ve diğerleri tarafından değiştirildi . 16 . Lütfen cliBu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3: Boş HDL'yi taklit eden nanopartiküllerin ve NGF HDL'yi taklit eden nanopartiküllerin tane büyüklüğü ve boyut dağılımı. Parçacık boyutları ve dağılımları bir parçacık analizcisi kullanılarak ölçülmüştür. Bu rakam Prathipati ve diğerleri tarafından değiştirildi . 16 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: PBS ile elüt edilen bir Sefaroz CL-4B kolonu üzerinde serbest NGF ve NGF HDL'yi taklit eden nanoparçacıkların kromatogramları. 200 uL serbest NGF solüsyonu (10 ug / mL) ve NGF NP solüsyonu tJel filtrasyon kolonu ve 1x PBS ile yıkandı. Her iki numunede toplam on iki fraksiyon (her fraksiyon için 1 mL) toplandı. Her fraksiyondaki NP yoğunluğu bir partikül analiz cihazı ile ölçülmüş ve her bir fraksiyonda NGF konsantrasyonu bir Sandwich ELISA kiti kullanılarak ölçülmüştür. Bu rakam Prathipati ve diğerleri tarafından değiştirildi . 16 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Diyaliz yöntemi ile ölçülen NGF HDL'yi taklit eden nanopartiküllerin in vitro salınımı. Serbest bırakma ortamı olarak% 5 BSA içeren PBS kullanıldı. 200 uL serbest NGF solüsyonu (10 ug / mL) veya NGF NP'leri, 400 u desteklenmiş bir diyaliz tüpüne eklenmiştirL serbest bırakma ortamı. Diyaliz tüpü 30 mL önceden ısıtılmış salım ortamına kondu. Çalışma 37 ° C'de 135 rpm'de çalkalama ile gerçekleştirildi. 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 ve 72 saatte, 100 uL serbest bırakma ortamı geri çekildi ve 100 ul'lık taze ortam ile değiştirildi. Her numunedeki NGF konsantrasyonu bir Sandwich ELISA kiti kullanılarak ölçüldü. Veriler, ortalama ± standart sapma (n = 4) olarak sunulmuştur. Bu rakam Prathipati ve diğerleri tarafından değiştirildi . 16 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: NGF HDL-taklit eden nanoparçacıkların PC12 hücrelerinde nörit büyümesine etkisi. Hücreler, 50 ng / mL serbest NGF ( A ) ve D NGF HDL-taklit nanoparçacıklar ( B ) 7 gün boyunca. Nörit 10X büyütme altında ters ışık mikroskop kullanılarak görüntülendi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 7: Farelerde serbest NGF ve NGF HDL-taklit eden nanoparçacıklar arasındaki biyolojik dağılımın karşılaştırılması (n = 3). Farelere, kuyruk-ven enjeksiyonu ile 40 mg / kg NGF verildi ve verildikten sonra 30 dakika sonra kurban edildi. Kan, karaciğer, dalak ve böbrek toplandı ve her bir numunedeki NGF konsantrasyonu bir Sandwich ELISA kiti kullanılarak ölçüldü. Veriler, ortalama ± standart sapma olarak gösterilmiştir. Bu rakam Prathipati ve diğerleri tarafından değiştirildi . 16 ."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55584/55584fig7large.jpg" target = "_ blank"> Bu figürde daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
| Numune | Tane boyutu (nm) | PI | NGF'nin EE oranı | Zeta potansiyeli (mV) |
| NGF HDL-taklit NP'leri | 171.4 ± 6.6 | 0.239 ± 0.01 | 65.9 ± 1.4 | -12.5 ± 1.9 |
Tablo 1: NGF HDL'yi taklit eden nanoparçacıkların karakterizasyonu (n = 3). Veriler, ortalama ± standart sapma olarak gösterilmiştir. Bu tablo Prathipati ve diğerleri tarafından değiştirilmiştir . 16 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, NGF kapsüllemesi için HDL'yi taklit eden NP'leri hazırlamak için basit bir yöntem gösteriyoruz. Proteinleri vermek için çeşitli NP dağıtım sistemleri incelenmiştir. Günümüzde birçok NP preparatı diyaliz, çözücü çöktürme ve film hidrasyonunu içermektedir. Bu işlemler genellikle karmaşıktır ve büyütme konusunda zorlayıcıdır. Bu NP gelişiminde, lipidlerin konteynırın cam duvarı ile kuvvetli yapışması olduğu ve bunun ince filmin hidratasyonunda ve katkı maddelerinin etkili bir şekilde karıştırılmasında zorluklara neden olduğu saptanmıştır. Doğal HDL NP'lerindeki çoklu bileşenler göz önüne alındığında, karıştırma, HDL'yi taklit eden NP'lerin hazırlanması için çok zorlu ve kritik hale geldi. Sonuçlara göre, sıcaklığın ve karıştırma süresinin arttırılması, NP oluşumuna yardımcı olmadı. Homojenizatör endüstriyel üretimde yaygın bir araçtır ve karıştırma için yüksek enerji ve kesme kuvveti sağlar. Bu aleti NP preparatına uygulayarak, monodispers NP'ler aUygun boyutlar 3 dakika içinde üretildi ( Şekil 2 ve Şekil 3 ), bu da imalat süresini büyük ölçüde düşürdü ve hazırlama prosedürünü basitleştirdi.
Makromolekülleri terapötik uygulamaya uygulamak için büyük zorluk sadece teslimat değil aynı zamanda formülasyondur. Proteinler normal olarak suda çözünebilir ve yüzeylerinde büyük boyutlar ve yükler oluştururlar ve proteinlerin lipid esaslı NP'lere kapsüllenmesini önlerler. NGF ile bir iyon çift kompleksi oluşturmak için USP, bir polikatom kullanıldı. NGF ve protamin karıştırıldıktan sonra, çözünmeyen kompleks oluşumunu gösteren beyaz çökelti açıkça görülmüştür. Kompleks yardımıyla, NGF'nin yaklaşık% 70'i, dar boyut dağılımı ile NP içine sıkıştı ( Tablo 1 ve Şekil 3 ). Dahası, formülasyonun geliştirilmesi sırasında proteinlerin kararlılığı dikkate alınmalıdır. Homojenizasyon etkisinden kaçınmakNGF stabilitesi üzerine, prosedür homojenizasyondan sonra bir NGF kompleksi eklemek üzere ayarlandı. Çok hafif bir inkübasyon koşulunda (37 ° C'de 30 dakika) NGF kompleksi NP'ler içine dahil edildi. Apo AI eklemek için farklı prosedürler test edildi; Bununla birlikte, oda sıcaklığında gece boyu inkübasyon, NP'lerin yüzeyinde yeterli Apo AI yüklemek için hala gerekli olmuştur. Nörit büyüme tahlilinin sonuçlarına dayanarak, NP preparatından sonra NGF'nin biyoaktivitesi burada sunulan prosedürle başarıyla muhafaza edildi ( Şekil 6 ). Dahası, HDGF'yi taklit eden NP'lere NGF'nin kapsüllenmesi, biyolojik dağılım çalışmaları ile gösterildiği gibi NGF'nin kan dolaşımını arttırmıştır ( Şekil 7 ). Bu sonuçlar NGF'nin bir NP iletim sistemi ile başarıyla formüle edildiğini göstermektedir. HDL'yi taklit eden NP'ler NGF'ye uzun yarı ömrü ve in vivo stabiliteye izin verecek şekilde yardımcı olabilir.
Uygun analitik yöntemlerin geliştirilmesi deProtein bazlı nanomedikler için çok şey. Tutulum verimliliğini ve in vitro salınımı ölçmek için, boşaltılan ilacı, ilaç yüklü nanopartiküllerden ayırmak zorunludur. Belli molekül ağırlığı kesintileri olan zarlar bu amaç için yaygın olarak kullanılır ve küçük moleküller için iyi çalışır. Ancak, boşaltılan proteinleri ve protein yüklü nanopartiküller, esas olarak proteinlerin benzer boyutları ve bağlanma özellikleri nedeniyle ayrılması kolay değildir. Zarın molekül ağırlığı kesilmesi 100 kDa (ticari filtrasyon cihazları için en büyük gözenek boyutu) olmasına rağmen, serbest NGF ve NGF HDL yüklü NP'ler membran esaslı filtreleme cihazı kullanılarak ayrılabilir. Birkaç jel filtrasyon kolonu test edildikten sonra, serbest NGF ve NGF HDL'yi taklit eden NP'ler nihayet bir Sepharose CL-4B kolonu kullanılarak ayrıldı. Bununla birlikte, tekrarlanabilir kromatogramlar elde etmek için kolona yüklenen numune 200 mcL'de muhafaza edilmelidir. Çözücü ajanlar da önem taşımaktadır. Su kullanıldığındaNGF'nin elute edilmesi için, çok geniş bir kromatogram elde edildi; NGF, fraksiyonlar 5-20 arasında tespit edildi. Geniş kromatogram NGF ve boncuklar arasındaki güçlü etkileşimden kaynaklanmış olabilir. 5 mM NaCl ve 50 mM NaCl gibi birkaç elüsyon ajanı test edildikten sonra, PBS yeterli bir elüsyon maddesi olarak teyit edildi. Üstelik, in vitro çalışmalar için ayırma zorunluluğu kaldı. Kolon ayrımı, ölçülecek serbest bırakılan numune sayısı ve kolondan geçtiklerinde NGF'nin NP'lerden daha fazla salınması için potansiyel olması nedeniyle, in vitro salım çalışmaları için uygun değildir. Çeşitli koşullar test edildikten sonra, protokolde tarif edilen diyaliz yöntemi belirlendi. Sonuçlara göre ( Şekil 5 ), serbest NGF,% 5 BSA ihtiva eden PBS'de zar boyunca serbestçe geçebilir (molekül ağırlığı kesilmesi: 300 kDa). Bu pozitif kontrol ile, NGF HDL'yi taklit eden NP'lerin salınım sonucu güvenilir hale geldi. Artan gözenek boyutu ve azalmasıPBS ve BSA'nın neden olduğu membran bağlanması diyaliz zarından NGF'nin serbestçe nüfuz etmesine katkıda bulundu.
Bahsedilen konulara ek olarak, nörit gelişme tahlili ile ilgili bir başka zorluk ortaya çıktı. PC12 hücrelerinin bir alt klonuna dayanan ticari bir nevrit büyüme test kiti vardır. Bununla birlikte, PC12 hücrelerinin alt klonu artık piyasada bulunmamaktadır. Normal PC12 hücreleri, nöritleri çok iyi büyümeyen ve deneysel işlemler sırasında kaybedilen kolay kayan hücrelerdir. Çeşitli arızalardan sonra güçlü yapışma özelliğine sahip küçük bir PC12 hücresi popülasyonu keşfedildi. Dolayısıyla, bu hücre popülasyonu protokolde tarif edildiği gibi birkaç pasajla seçildi. Sonuç olarak, analiz başarılı bir şekilde gerçekleştirildi ve NGF HDL'yi taklit eden NP'lerin serbest NGF ile karşılaştırılabilir biyoaktivitesini ortaya koydu ( Şekil 6 ).
Burada bildirilen yöntem, basit bir işlemdir.HDL'yi taklit eden NP'lerin hazırlanması. NP'ler üzerinde Apo AI'nın% 26'sından fazlasını sıkıştırdık ki bu, literatürde bildirilenden 3 kat fazla çıktı 16 . NGF'nin% 65'inden fazlası NP'lerde tutuldu ve bu NP'lerin literatürden 2 kat yüksekti. Hem Apo AI hem de NGF'nin tuzaklanma verimliliğindeki bu artışlarla, NP'leri saflaştırmaya gerek olmayabilir. Sonuç olarak, NP preparatı basitleştirildi. NP preparatındaki boşaltılmış Apo AI ve NGF, NGF in vitro salınımını ( Şekil 6 ) ve in vivo biyolojik dağılımı etkilemedi ( Şekil 7 ), ancak stabilite ve in vitro hücre çalışmalarını etkileyebilir. Buradaki çalışmalar, NP bileşimi ve hazırlama prosedürlerini modifıye ederek Apo AI ve NGF'nin yakalama verimliliğini daha da iyileştirmenin mümkün olduğunu göstermektedir. Dahası, yeni HDL'yi taklit eden NP'ler ve bu çalışmalardaki stratejiler diğer gr'leriBununla birlikte, iyon çifti ajanının (protamin) spesifik büyüme faktörüne uyacak şekilde değiştirilebileceği düşünülmektedir. Protein formülasyonlarının uzun süreli depolanması zor. Protein yüklü NP'lerin korunması için tercih edilen yol onları kuru tozlara liyofilize etmektir. Bununla birlikte, liyofilizasyon liyofilize NP'lerin yeniden oluşturulmasından sonra partikül boyutunu artırabilir ve proteinin tuzaklanma verimliliğini düşürebilir. HDL'yi taklit eden NP'lerin liyofilizasyonunu tartışan yayınlar azdır. Yeni HDL'yi taklit eden NP'lerin liyofilizasyonunu inceliyoruz. Sonuç olarak, HDL'yi taklit eden NP'ler, uzun bir süre (en az 6 ay) uygun bir şekilde saklandığında klinik olarak uygulanabilir hale gelebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH R03 NS087322-01 tarafından Dong, X'e desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-α-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
References
- Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
- Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).
- Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle. Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).
- Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K.
- Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. Medical application of liposomes. , Elsevier. (1998).
- Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).
- Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate. J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).
- Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles. Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).
- Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. High-density lipoproteins: nature's multifunctional nanoparticles. ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).
- Gursky, O. Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).
- McMahon, K. M., Thaxton, C. S. High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).
- McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy. Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).
- Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications. Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).
- Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting. Small. 6 (3), 430-437 (2010).
- Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics. ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).
- Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution. Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).
