Summary
Eenvoudige homogenisatie werd gebruikt om nieuwe, hoge dichtheid, lipoproteïne-nabootsende nanodeeltjes te bereiden om de zenuwgroeifactor te inkapselen. Uitdagingen, gedetailleerde protocollen voor nanodeeltjespreparatie, in vitro karakterisering en in vivo studies worden beschreven in dit artikel.
Abstract
Het doel van dit artikel is de voorbereiding en karakterisering van nervegroeifactoren (NGF) geladen, hoge dichtheid, lipoproteïne (HDL) -mimicerende nanodeeltjes (NP's) te introduceren. HDL's zijn endogene NP's en zijn onderzocht als voertuigen voor de levering van therapeutische middelen. Verschillende methoden zijn ontwikkeld om HDL-nabootsende NP's te bereiden. Ze zijn echter over het algemeen gecompliceerd, tijdrovend en moeilijk voor industriële opschaling. In deze studie werd één stap homogenisatie gebruikt om de hulpstoffen te mengen en de prototype NP's te vormen. NGF is een in water oplosbaar eiwit van 26 kDa. Om de inkapseling van NGF in de lipidomgeving van HDL-nabootsende NP's te vergemakkelijken, werd protamine USP gebruikt om een ionpaarcomplex te vormen met NGF om de ladingen op het NGF-oppervlak te neutraliseren. Het NGF / protamine complex werd vervolgens ingevoerd in het prototype NPs. Apolipoproteïne Al werd uiteindelijk op het oppervlak van de NP's gecoat. NGF HDL-nabootsende NP's vertoonden de voorkeurse eigenschappen in termenS met deeltjesgrootte, grootteverdeling, entrapmentefficiëntie, in vitro release, bioactiviteit en biodistributie. Met het zorgvuldige ontwerp en verkenning van homogenisatie in HDL-nabootsende NP's, werd de procedure sterk vereenvoudigd en werden de NP's schaalbaar gemaakt. Bovendien werden verschillende uitdagingen, zoals het scheiden van gelost NGF uit de NP's, het uitvoeren van betrouwbare in vitro vrijlatingstudies en het meten van de bioactiviteit van de NP's overwonnen.
Introduction
Macromoleculen, zoals eiwitten, peptiden en nucleïnezuren, zijn ontstaan als veelbelovende medicijnen en hebben in de afgelopen decennia 1 , 2 veel aandacht gekregen . Door hun hoge werkzaamheids- en specifieke actiemodi hebben ze een groot therapeutisch potentieel voor de behandelingen van kanker, immuunziekte, HIV en aanverwante aandoeningen 3 , 4 . Echter, fysiochemische eigenschappen, zoals hun grote moleculaire grootte, driedimensionale structuur, oppervlakkosten en hydrofiele natuur maken de in vivo afgifte van deze macromoleculen zeer uitdagend. Dit belemmert hun klinische gebruik 4 aanzienlijk. Recente ontwikkelingen in drug delivery systemen, zoals microdeeltjes, polymeer nanodeeltjes (NP's), liposomen en lipide NP's, overwinnen deze uitdagingen en verbeterde de in vivo levering van macromoleculen aanzienlijk. HoWever, sommige nadeel ten aanzien van deze leveringslading is aangetoond, met inbegrip van lage laadcapaciteit, lage opname efficiëntie, korte halveringstijd, verlies van bioactiviteit en ongewenste bijwerkingen 5 , 6 , 7 , 8 . Effectieve draagstersystemen blijven een gebied van onderzoeksbelang. Bovendien is de ontwikkeling van analytische methoden om medicijnbelaste NP's te karakteriseren, meer uitdagend voor macromoleculen dan voor kleine moleculen.
High-density lipoprotein (HDL) is een natuurlijke NP samengesteld uit een lipidekern die wordt bekleed door apolipoproteïnen en een fosfolipide monolaag. Endogene HDL speelt een kritische rol in het transport van lipiden, eiwitten en nucleïnezuren door de interactie met doelreceptoren, zoals SR-BI, ABCAI en ABCG1. Het is onderzocht als een middel voor de levering van verschillende therapeutische middelen 9, 10 , 11 , 12 . Verschillende methoden zijn ontwikkeld om HDL-nabootsende NP's te bereiden. Dialyse is een populaire aanpak. Bij deze werkwijze worden NP's gevormd door hydrateren van een lipidfilm onder toepassing van natriumcholaatoplossing. Het zout wordt vervolgens verwijderd door middel van een tweedaagse dialyse met drie buffers 13 . Sonicatiemethoden vervaardigen NP's door een lipidmengsel gedurende 60 minuten te soniciseren onder een verwarmingsconditie; De NP's worden verder gezuiverd door gelchromatografie 14 . Microfluidica genereert NP's via een microfluïdisch apparaat, dat fosfolipiden en apolipoproteïne AI (Apo AI) oplossingen mengt door microvortices in een focuspatroon 15 te maken . Het is duidelijk dat deze methoden tijdrovend, hard en moeilijk zijn voor industriële opschaling.
In dit artikel introduceren we de voorbereiding en karakterisering van nieuwe HDL-nabootsende NP's voor zenuwenGroei factor (NGF) inkapseling. NGF is een disulfide-gekoppelde polypeptide homodimeer die twee 13,6-kDa polypeptide monomeren bevat. Een nieuwe procedure voor het bereiden van de NP's door homogenisatie, gevolgd door de inkapseling van NGF in de NP's, werd ontwikkeld. De NGF HDL-nabootsende NP's werden gekenmerkt voor deeltjesgrootte, grootteverdeling, zeta-potentieel en in vitro vrijlating. Hun bioactiviteit werd geëvalueerd voor neurietgroei in PC12-cellen. De biodistributie van NGF HDL-nabootsende NP's werd vergeleken met die van vrij NGF na intraveneuze injectie in muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De dierstudies die bij alle procedures zijn opgenomen, zijn goedgekeurd door het Institusioneel Diervoeder- en Gebruikskomitee aan de Universiteit van Noord-Texas Health Science Center.
1. Bereiding van NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes
- Los de hulpstoffen, fosfatidylcholine (PC), sfingomyelin (SM), fosfatidylserine (PS), cholesteryloleaat (CO) en D-a-tocopherylpolyethyleenglycolsuccinaat (TPGS) op in ethanol om voorraadoplossingen op 1 mg / ml te bereiden.
OPMERKING: De voorraadoplossingen werden geproduceerd en opgeslagen bij -20 ° C. Het cholesteryloleaat werd opgeslagen in donkere flessen. De PC-, SM-, PS- en CO-voorraadoplossingen waren stabiel gedurende respectievelijk 6, 3, 12 en 12 maanden bij -20 ° C. De TPGS-oplossing was gedurende ten minste 12 maanden stabiel bij -20 ° C. - Meng 10 μL NGF (1 mg / ml in water) met 10 μl protamine USP (1 mg / ml in water) in een 1,5 ml microcentrifugebuis en laat het gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur staan totVorm het complex.
OPMERKING: De NGF- en protamine-voorraadoplossingen werden gesalicoteerd en opgeslagen bij -20 ° C. Herhaalde bevriezing en ontdooien wordt niet aanbevolen voor de NGF-voorraad. - Voeg 59 μl PC, 11 μL SM, 4 μL PS, 15 μL CO en 45 μl TPGS toe aan een glazen flesje. Meng en verdamp de ethanol gedurende ongeveer 5 minuten onder een zachte stikstofstroom; Alle hulpstoffen dienen een vette dunne film aan de onderkant van de glazen flesje te vormen.
- Voeg 1 ml ultraperfect (type 1) water toe aan de flesje en homogeniseer gedurende 5 minuten bij 9.500 rpm (8.600 xg) bij kamertemperatuur om de prototype NP's te vormen.
- Voeg het in stap 1.2 bereide complex toe aan prototype NP's en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C onder roeren door gebruik te maken van een kleine roerbalk in de glazen flesje.
- Koel de NP's door nog een 30 minuten bij kamertemperatuur te roeren. Vervolgens voegt u 106 μl Apo AI (1,49 mg / ml) toe en roer bij kamertemperatuur 's nachts om de laatste te vormenNGF HDL-nabootsende NP's.
2. Karakterisering van NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes
- Meet de deeltjesgrootte en zeta-potentieel met behulp van een deeltjesanalysator (zie de materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
- Gebruik een crosslinked agarosegelfiltreringskromatografiekolom om de geloste NGF van de NGF HDL-nabootsende NP's te scheiden en de entrapmentefficiëntie van de NGF te bepalen.
- Voor de kolombereiding, overdragen 15 ml Sepharose 4B-CL suspensie naar een beker van 50 ml. Roer de kraalvering met een glazen staaf en giet wat in een kolom (30 cm lengte × 1 cm diameter, met een glazen frituur onderaan). Tik voorzichtig op de kolom om bellen te ontdoen. Laat het oplosmiddel leeglopen en de kralen om een paar minuten te vestigen.
- Ga door met de resterende ophanging. Spoel de binnenmuur van de kolom om de kralen schoon te maken. Dreineer het oplosmiddel tot het oplosmiddelniveau een beetje a isBove de top van de stationaire fase. Was de kolom met 20 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, die 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2 HPO4 en 2 mM KH2P04) bevatte
- Om de fracties met gelost NGF te bepalen, bel 200 μL NGF-oplossing (10 μg / ml) op de gelfiltreringskolom (25 cm lengte x 1 cm diameter) en eluteer met 1x PBS.
- Verzamel totaal 12 fracties (1 ml per fractie) en meet de concentratie van NGF in elke fractie met een Sandwich ELISA kit voor NGF.
- Ontdek NGF uit fracties 6 tot 10 onder gebruikmaking van de Sandwich ELISA kit. Verkrijg een chromatogram van gelost NGF op de kolom. Was de kolom met 20 ml PBS.
- Om de fracties die NGF HDL-nabootsende NP's bevatten te bepalen, laden 200 μL van de NP's op de kolom en elueren met 1x PBS. Verzamel in totaal 12 fracties (1 ml voor elke fractie) en meet de intensiteit van deeltjes in elke fractie uZing de deeltjesgrootte analysator. Ontdek de NGF NP's uit fracties 2 tot 4.
OPMERKING: De intensiteit is een parameter gemeten door de deeltjesanalysator, die vertelt hoeveel nanodeeltjes in de testoplossing kunnen bestaan. Hoe meer NP's in oplossing bestaan, hoe hoger de intensiteit is. Met deze aanpak kunnen we bevestigen dat de kolom NGF NP's kan scheiden van gelost NGF. - Om de entrapment efficiëntie van NGF te meten, laad 200 μL NGF HDL-nabootsende NP's op de kolom en eluteer met 1x PBS. Verzamel in totaal 12 fracties (1 ml per fractie).
- Meet de geloste NGF-concentratie uit fracties 6 tot 10 met behulp van de Sandwich ELISA-kit.
- Voeg de NGF-hoeveelheden toe die gemeten zijn van fracties 6 tot 10 samen als de geloste NGF en bereken de entrapmentefficiëntie van NGF met behulp van de volgende vergelijking.
% EE = (1 - gelost NGF / totaal NGF toegevoegd in NP) x 100% Equation (1)
3. In vitro vrijgave van NGF HDL-imiteren nanodeeltjes
- Bestudeer vrij NGF (10 μg / ml in water; n = 4) en NGF HDL-nabootsende NP's (10 μg / mL; n = 4).
- Pre-treat 8 dialysebuizen (molecuulgewicht cutoff: 300 kDa) door de instructies van de fabrikant te volgen.
- Bereid 5% boviene serumalbumine (BSA) in PBS als het afgiftemedium. Voeg 30 ml afgiftemedium toe aan een 50 ml centrifugebuis en verwarm het tot 37 ° C in een shaker met een snelheid van 135 rpm. Plaats nog eens 50 ml vrijgegeven medium in de shaker voor vervanging.
- Voeg 400 μl vrijgegeven medium in de dialysebuis toe en voeg 200 μL van het geteste monster snel toe om voldoende volume voor dialyse te maken.
- Sluit de buis en zet de dialysebuis snel in het vrijgegeven medium (de centrifugebuis). Zet 100 μL van het vrijgegeven medium snel uit de buitendialysebuis als het monster voor de tijd 0. Zet het monster onmiddellijk in -20 ° C voor latere analyse. Voeg 100 μL verse reLease medium in de centrifugebuis om het ingetrokken monster te vervangen. Start de timer.
- Bij 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 en 72 uur trekken 100 μL van het afgiftemedium terug en vervangen met 100 μl vers medium. Zet de ingetrokken monsters onmiddellijk in -20 ° C voor latere analyse.
- Verwijder na 72 uur alle monsters van -20 ° C en ontdooi ze bij kamertemperatuur. Meet de NGF concentraties van de afgifte monsters met behulp van de Sandwich ELISA kit.
4. Bioactiviteit van NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes (Neurite Outgrowth Study)
- Cultuur PC12-cellen in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd paarden serum, 5% foetaal runder serum, 100 ug / ml streptomycine en 100 eenheden / ml penicilline. Bewaar de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2.
- Wanneer de cellen ~ 70-80% confluentie bereiken, verwijder het kweekmedium en was de cellen met 1x PBS (ongeveer 2 ml per 10 cm <Sup> 2 cultuuroppervlak). Verwijder de wasoplossing. Trypsineer de cellen door 0,25% trypsine-EDTA-oplossing (0,25% trypsine en 1 mM EDTA, 0,5 ml per 10 cm2 kweekoppervlak) toe te voegen aan de kolf en incuberen bij 37 ° C totdat de meeste cellen losgemaakt zijn.
- Voeg twee volumes cultuurmedium toe en draai gedurende 5 minuten op 180 xg. Verwijder de supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 ml kweekmedium. Filter de cellen door een 22 G, ½ inch naald om celclusters te breken.
- Verdeel de cellen in een verhouding van 1: 3 in een nieuwe celkweekfles. Na het incuberen gedurende de nacht, verwijder niet-aangesloten PC12-cellen. Laat de bijgevoegde cellen toe om te blijven groeien.
- Herhaal deze procedure voor 3 passages om de subcultuur van PC12 te selecteren die een sterke hechtingseigenschap heeft. Pre-coat een 6-putje plaat met 800 μL / putje van ratstaart collageen type I (100 μg / ml).
- Trypsineer de geselecteerde PC12-cellen zoals beschreven in stap 4.2 en filter ze door een22 G, ½ inch naald om de celclusters te breken. Tel de cellen met een hemocytometer. Zaad de cellen 's nachts bij een dichtheid van 10.000 cellen / putje in de voorbedekte 6-putjesplaat in stap 4.5 om de cellen aan de plaat te bevestigen.
- Verdun vrij NGF (10 μg / ml) en NGF HDL-nabootsende NP's (10 μg / ml) met het kweekmedium (beschreven in stap 4.1) om 0,5, 1, 5, 10, 50 en 100 ng / ml concentraties te bereiden. Verwijder 2 ml medium uit elke put en vervang met 2 ml van de verdunde vrije NGF of NGF HDL-nabootsende NP's. Cultuur voor 4 dagen.
- Op dag 4, verander het medium naar vers medium (beschreven in stap 4.1) die de bijbehorende behandeling bevat en de behandeling gedurende nog eens 3 dagen doorgaan.
- Op dag 7 visualiseert u de cellen met een omgekeerde lichtmicroscoop en beeld elke bron op willekeurige plekken onder 10X vergroting.
5. Biodistribusie van NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes
- Gebruik volwassen BALB / c-muizen (mannetje, 25-30 g) tot tIs de weefselverdeling van NGF NP's. Deel de muizen willekeurig in drie groepen van 3 muizen per groep. Gebruik een kegelvormige plastic behuizing ( bijv. Decapicon) om een muis vast te houden en de staart met ethanol te wrijven om de vasodilatie en de zichtbaarheid van de ader te bevorderen.
- Injecteer 100 μl van zoutoplossing, vrije NGF of NGF HDL-nabootsende NP's aan elke groep muizen (3 groepen) via de staartvenen bij een dosis van 40 μg / kg NGF. Gebruik een 30½ G-naald die aan een 1 ml spuit is bevestigd.
- Na 30 minuten na de injectie verdoving de muizen met 3% inhalatie van isofluraan (in zuurstof bij een stromingssnelheid van 2 L / min). Voer een staart- en teenknijp om de diepte van de verdoving vast te stellen. Bloed verzamelen door middel van cardiale punctie.
- Onttrek ongeveer 1 ml bloed uit het hart. Euthanize elke muis door cervicale dislocatie.
- Plaats de muiskarkas in dorsale recumbency. Open de buik met chirurgische scharen en verplaats vet en darmGebruik maken van een katoenen zwabber om de lever, milt en nier bloot te stellen. Oog deze weefsels op en spoel ze in 1x PBS om het bloed schoon te maken.
- Centrifugeer de bloedmonsters onmiddellijk bij 3,400 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten om het plasma te verkrijgen. Bewaar het plasma en weefsels bij -80 ° C tot de analyses.
- Om de weefselmonsters te analyseren, verplaats de monsters van -80 ° C tot 4 ° C en schud 100 mg weefselmonster in een 10x volume extractiebuffer (0,05 M natriumacetaat, 1,0 M natriumchloride, 1% Triton X-100, 1% BSA, 0,2 mM fenylmethaansulfonylfluoride en 0,2 mM benzethoniumchloride). Homogeniseren bij 10.000 rpm en 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Offer twee onbehandelde muizen om leeg plasma en weefsels te verzamelen, zoals beschreven in stappen 5.3 en 5.4. Bereid NGF standaardoplossingen aan met blanco plasma of blanco weefselhomogenaten.
- Bepaal de concentraties van NGF in de plasma- en weefselhomogenaten met behulp van de Sandwich ELISA-kit, zoals hierboven beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De techniekschema van HDL-nabootsende, a-tocoferol gecoate NGF NP's bereid door een ionpaarstrategie is getoond in Figuur 1 . Om de oppervlakte-ladingen van NGF te neutraliseren werd protamine USP gebruikt als een ionpaarmiddel om een complex te vormen met NGF. Om de bioactiviteit te beschermen werden prototype HDL-nabootsende NP's ontworpen, eerst met behulp van homogenisatie; Dan werd het NGF / protamine complex ingekapseld in de prototype NP's. Homogenisatie zorgde voor voldoende energie en bevorderde succesvol het mengen van de hulpstoffen. Na een homogenisatie van 3 minuten werden consistente deeltjesgroottes (ongeveer 170 nm) verkregen voor de prototype NP's ( Figuur 2 ). Apo AI werd geïncubeerd met de prototype NP's onder verschillende omstandigheden, waaronder 2 uur roeren bij kamertemperatuur; 4 uur roeren bij kamertemperatuur; 4 uur roeren bij kamertemperatuur, gevolgd door incubatie gedurende de nacht bij 4 ° C; En roeren bij kamertemperatuurrnight. Meer dan 26% van Apo AI werd opgenomen in de NP's bij nacht bij kamertemperatuur. Om het NGF-protamine complex toe te voegen werd het complex gedurende 30 minuten bij 37 ° C geïncubeerd met de prototype NP's en vervolgens werd Apo Al aan het mengsel toegevoegd om de uiteindelijke coating van Apo AI op het oppervlak van de NP's af te maken. Met behulp van de hier beschreven procedure hadden de uiteindelijke NGF HDL-nabootsende NP's deeltjesgroottes van 171,4 ± 6,6 nm (n = 3), met 65,9% NGF-invoegingsefficiëntie ( Tabel 1 ). NGF HDL-nabootsende NP's hadden een lichte negatieve lading ( Tabel 1 ). De NP's hadden een smalle grootteverdeling, en het opnemen van NGF in de NP's had geen invloed op de deeltjesgrootte ( Figuur 3 ).
Om de entrapmentefficiëntie van NGF te meten werden verschillende methoden geëvalueerd om gelost NGF uit NGF HLD-nabootsende NP's te scheiden. Onverwacht kan NGF niet een scheidingsfilter passeren (molecuulgewicht cutoff: 100 kDa). Gel fiLtrationskolommen, waaronder Sephadex G-50, Sephadex G-100 en Sephacryl S-100, kunnen niet geloste NGF- en NGF HDL-nabootsende NP's scheiden, aangezien beide van hen na dezelfde elutie in dezelfde fracties komen. Een Sepharose CL-4B kolom verricht de scheiding met de geoptimaliseerde monsterbelasting, elueringsbuffer en elutie snelheid. Zoals getoond in figuur 4 werden geloste NGF- en NGF HDL-nabootsende NP's volledig gescheiden op een Sepharose CL-4B kolom.
Een dialysemethode werd gebruikt om de in vitro- vrijgave van NGF HDL-nabootsende NP's in PBS te bestuderen met 5% BSA, die werd opgenomen om de fysiologische condities in het bloed te nabootsen. Door het vergroten van de grootte van het dialyseapparaat (molecuulgewichtsafscheiding: 300 kDa) en door PBS en BSA aan het afgiftemedium toe te voegen, bindde NGF niet met het dialysemembraan en werd vrij doorgegeven. Als gevolg hiervan was het herstel van vrij NGF in deze dialysemethode ruim 85% ( Figuur 5 ). NGFHDL-nabootsende NP's vertoonden een langzaam vrijgaveprofiel en ongeveer 10% van de NGF werd over 72 uur uit de NP's vrijgegeven ( Figuur 5 ).
Om de bioactiviteit van NGF HDL-nabootsende NP's te testen, werd de subcultuur van PC12-cellen die een sterke hechtingseigenschap hadden, geselecteerd om een neurietgroei uit te voeren. Figuur 6 vertegenwoordigt de beeldvorming van neurietgroei wanneer de cellen werden behandeld met 50 ng / ml vrije NGF ( Figuur 6A ) en NGF HDL-nabootsende NP's ( Figuur 6B ). Wanneer de behandelingskoncentratie hoger was dan 10 ng / ml, werd de neurietgroei duidelijk waargenomen door de microscoop. Bij deze hoge concentraties vertoonden geen vrije NGF- en NGF HDL-nabootsende NP's een significant verschil op het effect van neurietgroei. Wanneer de concentratie van NGF lager was dan 10 ng / ml, kon neuritale groei niet duidelijk waargenomen worden, zowel voor vrij NGF als voor NGF HDL-nabootsende NP's. Biodistribution stUties werden uitgevoerd om het in vivo gedrag van vrije NGF en NGF HDL-nabootsende NP's te vergelijken. Zoals getoond in figuur 7 verhoogde NGF HDL-nabootsende NP's de plasmaconcentratie significant en verminderde de opname in de lever, de nier en de milt.
Figuur 1: De ingenieursschema van NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes bereid door een ionpaarstrategie. NGF is een negatief geladen hydrofiele molecuul. Een kationisch peptide, protamine, werd gebruikt om de ladingen te neutraliseren en vormde een ion-pair complex met NGF. Cholesteryloleaat, fosfolipiden en TPGS vormden zelf-assemblage prototype NP's door homogenisatie. Het NGF / protamine complex werd opgenomen in de prototype NP's. Ten slotte werd Apo AI op het NP-oppervlak gecoat na een nacht incubatie. Dit cijfer is gewijzigd van Prathipati et al. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De invloed van homogenisatie op de deeltjesgrootte van de prototype nanodeeltjes. De hulpstoffen, PC, SM, PS, CO en TPGS, die in ethanol werden opgelost, werden aan glazen flesjes toegevoegd en het oplosmiddel werd onder N2-stroom verdampt. 1 ml water werd toegevoegd en gehomogeniseerd bij 9.500 rpm voor verschillende tijden. De deeltjesgroottes van daaropvolgende nanodeeltjes werden gemeten. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± standaardafwijking (n = 4). Dit cijfer is gewijzigd van Prathipati et al. 16 . Gelieve cliCk hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Partikelgrootte en grootteverdeling van blanco HDL-nabootsende nanodeeltjes en NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes. De deeltjesgroottes en verdelingen werden gemeten met behulp van een deeltjesanalysator. Dit cijfer is gewijzigd van Prathipati et al. 16 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Chromatogrammen van vrije NGF en NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes op een Sepharose CL-4B kolom geëlueerd door PBS. 200 μl vrije NGF-oplossing (10 ug / ml) en NGF NP-oplossing werden geladen op tHij gelfiltreringskolom en geëlueerd met 1x PBS. In totaal werden twaalf fracties (1 ml voor elke fractie) verzameld voor beide monsters. De NP-intensiteit in elke fractie werd gemeten door een deeltjesanalysator en de concentratie van NGF in elke fractie werd gemeten met behulp van een Sandwich ELISA-kit. Dit cijfer is gewijzigd van Prathipati et al. 16 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: In vitro release van NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes gemeten door een dialysemethode. PBS met 5% BSA werd gebruikt als een vrijgegeven medium. 200 μl vrije NGF-oplossing (10 ug / ml) of NGF NP's werden toegevoegd aan een dialysebuis aangevuld met 400 μlL van het afgiftemedium. De dialysebuis werd in 30 ml voorverwarmd afgiftemedium gebracht. De studie werd uitgevoerd bij 37 ° C met 135 rpm schudden. Bij 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 en 72 uur werd 100 μl van het afgiftemedium ingetrokken en vervangen door 100 μl vers medium. De NGF-concentratie in elk monster werd gemeten met behulp van een Sandwich ELISA kit. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± standaardafwijking (n = 4). Dit cijfer is gewijzigd van Prathipati et al. 16 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: De invloed van NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes op neurietgroei in PC12-cellen. Cellen werden behandeld met 50 ng / ml vrij NGF ( A ) an D NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes ( B ) gedurende 7 dagen. De neuriet werd afgebeeld met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop onder 10X vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: De vergelijking van biodistributie tussen vrije NGF en NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes in muizen (n = 3). De muizen werden toegediend met 40 mg / kg NGF door middel van staartvene injectie en werden op 30 minuten na toediening geofferd. Het bloed, lever, milt en nier werden verzameld en de concentratie van NGF in elk monster werd gemeten met behulp van een Sandwich ELISA kit. Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± standaardafwijking. Dit cijfer is gewijzigd van Prathipati et al. 16 ."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55584/55584fig7large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
| Monster | Deeltjesgrootte (nm) | PI | EE% van NGF | Zeta potentieel (mV) |
| NGF HDL-nabootsende NP's | 171,4 ± 6,6 | 0,239 ± 0,01 | 65,9 ± 1,4 | -12,5 ± 1,9 |
Tabel 1: Karakterisering van NGF HDL-nabootsende nanodeeltjes (n = 3). Gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± standaardafwijking. Deze tabel is gewijzigd van Prathipati et al. 16 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie tonen we een eenvoudige methode om HDL-nabootsende NP's voor NGF-inkapseling te bereiden. Verschillende NP leveringssystemen zijn onderzocht om eiwitten te leveren. Momenteel betrekken veel NP-preparaten dialyse, oplosmiddelafbreking en filmhydratatie. Deze processen zijn over het algemeen gecompliceerd en uitdagend bij opschalen. Tijdens deze NP-ontwikkeling werd vastgesteld dat de lipiden sterke hechting hadden aan de glazen wand van de houder, wat leidde tot de moeilijkheden bij het hydrateren van de dunne film en het effectief mengen van de hulpstoffen. Gezien de veelvoudige componenten in natuurlijke HDL NP's, werd mengen zeer uitdagend en cruciaal voor de bereiding van HDL-nabootsende NP's. Volgens de resultaten hielp het verhogen van de temperatuur en mengtijd niet bij het vormen van NP. De homogenisator is een algemeen instrument in industriële productie en biedt hoge energie en schuifkracht voor het mengen. Door dit instrument toe te passen op NP-voorbereiding, monodispers NP's met de aRelevante maten werden binnen 3 minuten geproduceerd ( Figuur 2 en Figuur 3 ), waardoor de productietijd sterk werd verminderd en de voorbereidingsprocedure werd vereenvoudigd.
De grote uitdaging om macromoleculen toe te passen op therapeutische toediening is niet alleen de levering, maar ook de formulering. Proteïnen zijn normaal in water oplosbaar en hebben grote afmetingen en ladingen op hun oppervlakken, waardoor de inkapseling van eiwitten in lipide-gebaseerde NP's voorkomt. Protamine USP, een polycatie, werd gebruikt om een ionenpaarcomplex te vormen met NGF. Na het mengen van NGF en protamine was duidelijk het witte neerslag dat de vorming van het onoplosbare complex gaf. Met behulp van het complex werd ongeveer 70% van de NGF ingesloten in de NP's, met een smalle grootteverdeling ( Tabel 1 en Figuur 3 ). Bovendien moest de stabiliteit van eiwitten in aanmerking worden genomen tijdens de formuleringsontwikkeling. Om de invloed van homogenisatie te vermijdenOp NGF-stabiliteit werd de procedure aangepast om een NGF-complex na homogenisatie toe te voegen. Onder een zeer milde incubatie toestand (30 min bij 37 ° C) werd het NGF-complex in de NP's opgenomen. Verschillende procedures werden getest om Apo AI toe te voegen; Overdag was incubatie bij kamertemperatuur nog steeds nodig om genoeg Apo AI op het oppervlak van de NP's te laden. Op basis van de resultaten van de neurietgroeianalyse werd de bioactiviteit van NGF na het NP-preparaat succesvol onderhouden met de hier geprezen procedure ( Figuur 6 ). Bovendien verdubbelde NGF in de HDL-nabootsende NP's de bloedcirculatie van NGF, zoals aangegeven door de biodistributiestudies ( Figuur 7 ). Deze resultaten tonen aan dat NGF succesvol is geformuleerd met een NP-afleveringssysteem. De HDL-nabootsende NP's kunnen NGF helpen, waardoor een lange halveringstijd en in vivo stabiliteit mogelijk zijn.
Het ontwikkelen van geschikte analytische methoden is ook chaVerlangen op eiwit gebaseerde nanomedicines. Om de entrapment efficiëntie en in vitro vrijlating te meten, is het verplicht om het geloste geneesmiddel te scheiden van nanopartikels met medicijnen. Membranen met bepaalde moleculairgewicht-afsnijdingen worden gewoonlijk gebruikt voor dit doel en werken goed voor kleine moleculen. Het is echter niet gemakkelijk om los geloste eiwitten en eiwit geladen nanodeeltjes te scheiden, vooral door de gelijke grootte en bindingseigenschappen van eiwitten. Vrije NGF en NGF HDL geladen NP's kunnen niet gescheiden worden met behulp van het membraan gebaseerde filtratie-apparaat, hoewel het molecuulgewicht afsnijding van het membraan 100 kDa is (de grootste poriegrootte voor commerciële filtratie-inrichtingen). Nadat er meerdere gelfiltreringskolommen werden getest, werden vrije NGF- en NGF HDL-nabootsende NP's uiteindelijk gescheiden met behulp van een Sepharose CL-4B kolom. Het monster op de kolom moest echter bij 200 μl gehouden worden om reproduceerbare chromatogrammen te verkrijgen. Elutie-agenten waren ook van belang. Bij gebruik van waterOm NGF te elueren werd een zeer breed chromatogram verkregen; NGF werd gedetecteerd uit fracties 5 tot 20. Het brede chromatogram zou kunnen zijn veroorzaakt door de sterke interactie tussen NGF en de kralen. Nadat verscheidene elutiemiddelen, zoals 5 mM NaCl en 50 mM NaCl, werden getest, werd PBS als voldoende elueringsmiddel bevestigd. Bovendien bleef de scheidingsuitdaging voor de in vitro studies. Kolom scheiding is niet geschikt voor in vitro vrijlating studies door het aantal gemeten monsters die gemeten moeten worden en het potentieel voor de verdere afgifte van NGF uit de NP's als ze door de kolom gaan. Nadat diverse condities werden getest, werd de dialysemethode beschreven in het protocol bepaald. Volgens de resultaten ( Figuur 5 ) kan vrij NGF het doormembraan vrijmaken (afname in molecuulgewicht: 300 kDa) in PBS die 5% BSA bevat. Met deze positieve controle werd het vrijgegeven resultaat van NGF HDL-nabootsende NP's betrouwbaar. De verhoogde poriegrootte en afnameAangezien membraanbinding veroorzaakt door PBS en BSA bijgedragen tot de vrije penetratie van NGF door het dialysemembraan.
Naast de hiervoor genoemde problemen is er een andere uitdaging ontstaan met de neurietgroeianalyse. Er is een commerciële neurietgroeianalyse kit die is gebaseerd op een subklonie van PC12 cellen. Het subklon van PC12-cellen is echter niet meer in de handel verkrijgbaar. Normale PC12-cellen zijn drijvende cellen die neurieten niet goed groeien en die tijdens de experimentele procedures makkelijk te verliezen zijn. Na verscheidene storingen werd een kleine populatie van PC12-cellen die een sterke hechtingseigenschap hadden, ontdekt. Zo werd deze populatie van cellen geselecteerd via verscheidene passages, zoals beschreven in het protocol. Bijgevolg is de test succesvol uitgevoerd en blijkt de vergelijkbare bioactiviteit van NGF HDL-nabootsende NP's met vrij NGF ( Figuur 6 ).
De hier beschreven methode is een eenvoudige procedure voor thE voorbereiding van HDL-nabootsende NP's. We hebben 26% van de Apo AI op de NP's ingehaald, die meer dan 3 keer hoger was dan in de literatuur 16 werd gerapporteerd. Meer dan 65% van de NGF werd ingesloten in de NP's, die tweemaal hoger was dan in de literatuur 16 . Met deze verhogingen in de opname-efficiëntie voor zowel Apo AI als NGF, is het wellicht niet nodig om de NP's te zuiveren. Bijgevolg werd de NP-voorbereiding vereenvoudigd. De geloste Apo AI en NGF in de NP-bereiding hadden geen invloed op de NGF in vitro release ( Figuur 6 ) en de in vivo biodistributie ( Figuur 7 ), maar het zou de stabiliteit en in vitro -celstudies kunnen beïnvloeden. De studies hier aantonen dat het mogelijk is om de inname-efficiëntie van Apo AI en NGF verder te verbeteren door de NP-samenstelling en de voorbereidingsprocedures te wijzigen. Bovendien kunnen de nieuwe HDL-nabootsende NP's en de strategieën in deze studies gebruikt worden om andere grOwth factoren, hoewel het ion-pair agent (protamine) kan worden veranderd om de specifieke groeifactor te passen. De langetermijnopslag van eiwitformuleringen is uitdagend. De geprefereerde manier om eiwit geladen NP's te houden, is om ze te bevriezen om poeder te drogen. Echter, lyofilisatie kan de deeltjesgrootte verhogen en de entrapmentefficiëntie van het eiwit verminderen na de reconstitutie van gevriesdroogde NP's. Weinige publicaties hebben de lyofilisatie van HDL-nabootsende NP's besproken. We bestuderen de lyofilisatie van nieuwe HDL-nabootsende NP's. Uiteindelijk kunnen HDL-nabootsende NP's klinisch toepasbaar zijn als ze langdurig (tenminste 6 maanden) geschikt kunnen worden opgeslagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH R03 NS087322-01 naar Dong, X.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Human Beta-NGF | Creative Biomart | NGF-05H | |
| L-α-Phosphatidylcholine (PC) | Avanti | 131601P | 95%, Egg, Chicken |
| Sphingomyelin (SM) | Avanti | 860062P | Brain, Porcine |
| Phosphatidylserine (PS) | Avanti | 840032P | Brain, Porcine |
| Cholesteryl oleate (CO) | Sigma | C9253 | |
| D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) | BASF | 9002-96-4 | Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | meets USP testing specifications |
| Apolipoprotein A1, Human plasma | Athens Research & Technology | 16-16-120101 | 1 mg in 671 µL 10 mM NH4HCO3, pH 7.4 |
| Sepharose 4B-CL | Sigma | CL4B200 | Cross-linked agarose, gel filtration chromatography column filling material |
| Sandwich ELISA Kit for NGF | R&D system | DY008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| RPMI-1640 medium | GE Healthcare Life Science | SH30096.02 | |
| Horse serum | GE Healthcare Life Science | SH30074.03 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10082147 | |
| PC12 cells | ATCC | CRL-1721 | |
| Rat tail collagen type I | Sigma | C3867 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31414 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Benzethonium chloride | Sigma | B8879 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Homogenizer | Tekmar | T 25-S1 | |
| Delsa Nano HC particle analyzer | Beckman-Coulter | Delsa Nano HC | |
| Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device | Spectrum Laboratories | G235036 | Molecule Cutoff 300 kDa |
| Centrifuge | Eppendoff | 5424R | |
| Polytron homogenizer | Kinematica | PT 1200C | |
| DecapiCone | Braintree Scientific Inc. | DC-M200 |
References
- Bruno, B. J., Miller, G. D., Lim, C. S. Basics and recent advances in peptide and protein drug delivery. Ther Deliv. 4 (11), 1443-1467 (2013).
- Mo, Z. C., Ren, K., Liu, X., Tang, Z. L., Yi, G. H. A high-density lipoprotein-mediated drug delivery system. Adv Drug Deliv Rev. 106 (Pt A), 132-147 (2016).
- Lacko, A. G., Sabnis, N. A., Nagarajan, B., McConathy, W. J. HDL as a drug and nucleic acid delivery vehicle. Front Pharmacol. 6, 247-252 (2015).
- Vaishya, R., Khurana, V., Patel, S., Mitra, A. K.
- Lasic, D. D., Papahadjopoulos, D. Medical application of liposomes. , Elsevier. (1998).
- Samad, A., Sultana, Y., Aqil, M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv. 4 (4), 297-305 (2007).
- Bezemer, J. M., Radersma, R., Grijpma, D. W., Dijkstra, P. J., van Blitterswijk, C. A., Feijen, J. Microspheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers: 2. Modulation of release rate. J Control Release. 67 (2-3), 249-260 (2000).
- Patel, A., Patel, M., Yang, X., Mitra, A. K. Recent advances in protein and peptide drug delivery: a special emphasis on polymeric nanoparticles. Protein Pept lett. 21 (11), 1102-1120 (2014).
- Kuai, R., Li, D., Chen, Y. E., Moon, J. J., Schwendeman, A. High-density lipoproteins: nature's multifunctional nanoparticles. ACS Nano. 10 (3), 3015-3041 (2016).
- Gursky, O. Structural stability and functional remodeling of high-density lipoproteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2627-2639 (2015).
- McMahon, K. M., Thaxton, C. S. High-density lipoproteins for the systemic delivery of short interfering RNA. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 231-247 (2014).
- McMahon, K. M., Foit, L., Angeloni, N. L., Giles, F. J., Gordon, L. I., Thaxton, C. S. Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles as cancer therapy. Cancer Treat Res. 166, 129-150 (2015).
- Lerch, P. G., Förtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications. Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).
- Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting. Small. 6 (3), 430-437 (2010).
- Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. J., Ma, M., Moore, K., Farokhzad, O. C., Fisher, E. A., Mulder, W. J., Langer, R., Fayad, Z. A. Single step reconstitution of multifunctional high-density lipoprotein-derived nanomaterials using microfluidics. ACS Nano. 7 (11), 9975-9983 (2013).
- Prathipati, P., Zhu, J., Dong, X. D. Development of novel HDL-mimicking α-tocopherol-coated nanoparticles to encapsulate nerve growth factor and evaluation of biodistribution. Eur J Pharm and Biopharm. 108, 126-135 (2016).
