Bioengineering

Herzmuskelzellbasierter Aktuator und selbststabilisierender Biorobot - TEIL 1

Published: July 11, 2017 doi: 10.3791/55642

Merrel T. Holley*¹, Neerajha Nagarajan*², Christian Danielson¹, Pinar Zorlutuna*², Kidong Park*¹

¹Division of Electrical and Computer Engineering, Louisiana State University, ²Department of Aerospace and Mechanical Engineering, Bioengineering Graduate Program, University of Notre Dame

* These authors contributed equally

Summary

In dieser zweiteiligen Studie wurde ein biologischer Aktuator mit hochflexiblen Polydimethylsiloxan (PDMS) Cantilever und lebenden Muskelzellen (Kardiomyozyten) entwickelt und charakterisiert. Der biologische Aktuator wurde mit einer Basis aus modifizierten PDMS-Materialien eingebaut, um einen selbststabilisierenden, schwimmenden Biorobot aufzubauen.

Abstract

Biologische Maschinen, die oft als Biorobots bezeichnet werden, sind lebende Zellen- oder Gewebe-basierte Geräte, die ausschließlich durch die kontraktile Aktivität lebender Komponenten angetrieben werden. Aufgrund ihrer inhärenten Vorteile erfreuen sich Biorobots als Alternativen zu traditionellen, vollständig künstlichen Robotern. Verschiedene Studien haben sich darauf konzentriert, die Kraft biologischer Aktoren zu nutzen, aber erst vor kurzem haben die Studien die Leistung von Bioroboten quantitativ charakterisiert und ihre Geometrie untersucht, um Funktionalität und Effizienz zu verbessern. Hier zeigen wir die Entwicklung eines selbststabilisierenden Schwimmbiorobot, der seine Tonhöhe, Tiefe und Roll ohne externe Eingriffe beibehalten kann. Die Konstruktion und Fertigung des PDMS-Gerüstes für den biologischen Aktor und Biorobot, gefolgt von der Funktionalisierung mit Fibronectin, ist in diesem ersten Teil beschrieben. Im zweiten Teil dieses zweiteiligen Artikels beschreiben wir den Einbau von Kardiomyozyten und charakterisieren den biologischen AktAtor und biorobot Funktion. Beide integrieren eine Basis und Schwanz (Cantilever), die Fin-basierten Antrieb zu produzieren. Der Schwanz ist mit weichen Lithographietechniken unter Verwendung von PDMS und Lasergravur aufgebaut. Nach dem Einbau des Schwanzes mit der Gerätebasis wird er mit einem Zellklebstoffprotein funktionalisiert und mit Kardiomyozyten konfektioniert. Die Basis des biologischen Aktuators besteht aus einem festen PDMS-Block mit einer zentralen Glasperle (wirkt als Gewicht). Die Basis des Biorobots besteht aus zwei zusammengesetzten PDMS-Materialien, Ni-PDMS und Mikroballon-PDMS (MB-PDMS). Das Nickelpulver (in Ni-PDMS) ermöglicht die magnetische Kontrolle des Biorobots während der Zutaten und der Stabilität während der Fortbewegung. Mikroballons (in MB-PDMS) verringern die Dichte von MB-PDMS und ermöglichen dem Biorobot zu schwimmen und schwimmen stetig. Die Verwendung dieser beiden Materialien mit unterschiedlichen Massendichten ermöglichte eine präzise Kontrolle der Gewichtsverteilung, um eine positive Wiederherstellungskraft in jedem Winkel des Biorobots zu gewährleisten. Diese TechnikProduziert einen magnetisch gesteuerten selbststabilisierenden Schwimmen Biorobot.

Introduction

Biologische Aktoren und Biorobots werden aktiv untersucht, um eine Alternative zur konventionellen Robotik für zahlreiche Anwendungen zu bieten. Biorobots, die ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ laufen, schwimmen ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ , Pumpe ⁹ ^, ¹⁰ oder Griff ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ Wurden bereits entwickelt. Ähnlich können Muskelzellen in eine 3D-gerollte PDMS-Struktur ¹⁴ eingebaut werden. Oft werden die Biorobot-Backbones unter Verwendung von weichen Lithographietechniken mit Materialien wie Hydrogelen und PDMS (Polydimethylsiloxan) hergestellt. Das sind attraktive Entscheidungen wegen ihrer Flexibilität, BiokompatibilitätUnd leicht abstimmbare Steifigkeit. Lebendige Muskelzellen werden gewöhnlich mit diesen Materialien inkorporiert, um eine Kraftgenerierung durch Kontraktion zu ermöglichen. Säugetier-Herzmuskelzellen (Kardiomyozyten) und Skelettmuskelzellen wurden dominant zur Betätigung verwendet. Neben diesen beiden wurden Insektenmuskelgewebe verwendet, um Biorobots bei Raumtemperatur ³ zu betreiben. In dieser zweiteiligen Studie wurden Kardiomyozyten wegen ihrer spontanen Kontraktion ausgewählt ⁶ .

Ein Großteil der früheren Forschung auf Biorobots konzentrierte sich auf die Entwicklung der biologischen Aktoren, während die Optimierung der Biorobotarchitektur und die Entwicklung wesentlicher Funktionalitäten für die Biorobots weitgehend vernachlässigt wurden. In letzter Zeit zeigten einige Berichte die Umsetzung unterschiedlicher Schwimmmodi, die von den in der Natur gefundenen Antriebsmodi inspiriert wurden. Diese Methoden beinhalten PDMS-Filme und Muskelzellen, um verschiedene natürliche Antriebsmethoden nachzuahmen. Zum Beispiel wurden Flagella-basierter Antrieb ¹ , biomimetischer Quallenantrieb ² , Bio-Hybrid-Strahl ⁴ und Dünnfilm-PDMS-Schwimmvorrichtungen ^{13 beschrieben} .

In dieser Arbeit präsentieren wir den Herstellungsprozess von selbststabilisierenden Schwimmen Bioroboten, die Tauch-Tiefe sowie Pitch und Roll beibehalten können. Der Biorobot hat eine feste Basis oder einen Körper, der von einem einzigen Cantilever mit an seiner Oberfläche angebrachten Kardiomyozyten angetrieben wird. Die Kardiomyozyten bewirken, dass sich der Ausleger in einer Längsrichtung biegt, wenn er sich zusammenzieht. Diese Form des Schwimmens wird als ostraciiform Schwimmen klassifiziert. Die Fähigkeit, zusätzliche Funktionalitäten auf der Basis hinzuzufügen, ist ein einzigartiger Vorteil des ostraciiform Schwimmens. Zum Beispiel kann die Basis verwendet werden, um einen übertriebenen Auftrieb zu liefern, um zusätzliche Ladungen oder Steuerschaltungen für die Kardiomyozytenkontraktion zu tragen.

StabilitätDes Biorobots wurde in früheren Studien von Bioroboten oft übersehen. In dieser Studie haben wir eine Selbststabilisierung durchgeführt, indem wir die Basis mit verschiedenen zusammengesetzten PDMS-Materialien mit unterschiedlichen Massendichten konstruieren. Der Biorobot zeigt somit Widerstand gegen äußere Störungen und behält seine Tauchentiefe, Pitch und Roll, ohne Hilfe. Die erste Schicht ist Mikroballon PDMS (MB-PDMS), dh PDMS gemischt mit Mikroballons, was die Dichte des Biorobots senkt, so dass es in Medien schweben kann. Die zweite Schicht ist der PDMS-Cantilever, und seine Dicke ist so zugeschnitten, dass die von den Kardiomyozyten erzeugte Kraft den Cantilever drastisch von 45 ° auf 90 ° biegen kann. Die untere Schicht ist Nickel-PDMS (Ni-PDMS), dh PDMS mit Nickelpulver gemischt. Diese Schicht führt mehrere Funktionen aus. Es ist magnetisch und erlaubt es daher, den Biorobot am Boden des Mediums, während der Zellseeding, mit einem Magneten zu verankern. Das Nickelgemisch hat eine höhere Dichte als das MB-PDMS undMittel, und sorgen für eine aufrechte Position des Biorobots beim Schwimmen. Das Gewicht dieser Schicht erzeugt ein Wiederherstellungsmoment auf dem Biorobot bei jedem Pitch und Roll. Auch das Volumenverhältnis zwischen dem Ni-PDMS und dem MB-PDMS hält die Eintauchtiefe aufrecht. Die vorgestellten Protokolle wären für Forscher, die an der Charakterisierung der Schlagkraft von Muskelzellen und Geweben interessiert sind, sowie diejenigen, die schwimmende Biorobots bauen möchten, sehr nützlich.

Die Aussaat der funktionalisierten biologischen Aktor- und Biorobot-Geräte, die mechanische und biochemische Charakterisierung der Zellen sowie die quantitative Analyse der Gerätefunktion sind in Teil 2 dieses zweiteiligen Artikels sowie in der jüngsten Arbeit ausführlich beschrieben.

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Protocol

1. Berechnen Sie die Masse von PDMS und Additiven

Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Masse der PDMS zu finden, die für bestimmte Höhen in den folgenden Prozeduren benötigt wird,
M = ρ * V = ρ * Höhe * Fläche (1),
Wo 'Höhe' die Höhe der Schicht ist, 'Bereich' ist die Fläche eines Containers, in dem das PDMS gehärtet wird, 'ρ' ist die Dichte der Mischung und 'V' ist das Volumen.
HINWEIS: Dichte für Höhenberechnungen sind PDMS = 0,965 g / mL, Ni-PDMS = 1,639 g / mL, MB-PDMS = 0,648 g / mL.
Verwenden Sie die Gleichung (1), um die Masse des benötigten PDMS für einen bestimmten Behälter zu schätzen, um eine bestimmte Höhe (5 mm) für die Basis des biologischen Aktuators zu erhalten. Die resultierende Dichte von PDMS beträgt 0,965 g / ml.
HINWEIS: Das Verhältnis beträgt 10: 1 Base zu Härtungsmittel nach Gewicht.
M _base = ρ * V = ρ * V * ( )(2)
M _{Härtungsmittel} = ρ * V = ρ * V * ( )
Verwenden Sie die Gleichung (1), um die Masse des Ni-PDMS zu finden, die für einen gegebenen Behälter benötigt wird, um eine spezifische Höhe (1,5 mm) der unteren Basis des Biorobots zu erhalten.
HINWEIS: Die Verhältnisse betragen 1: 1,88 (Nickelpulver nach PDMS) und 1: 1,71: 0,111 (Nickel-Pulver zu PDMS-Base zu PDMS-Härtungsmittel nach Gewicht). Die resultierende Dichte von Ni-PDMS beträgt 1,639 g / ml.
M _Nickel = ρ * V = ρ * V * ( ) (3)
M _base = ρ * V = ρ * V * ( )
M _{Härtungsmittel} = ρ * V = ρ * V * ( )
Ebenso verwenden Sie die Gleichung (1) bis f Ind die Masse von MB-PDMS benötigt, um für einen bestimmten Behälter, um eine bestimmte Höhe (3,5 mm) der Oberseite des Biorobots zu erhalten.
HINWEIS: Die Verhältnisse betragen 1: 5 (Mikroballons zu PDMS nach Gewicht) und 1: 4,54: 0,454 (Mikroballons zu PDMS-Base zu PDMS-Härtungsmittel nach Gewicht). Die resultierende Dichte von MB-PDMS beträgt 0,648 g / ml.
M _Mikroballon = ρ * V = ρ * V * ( ) (4)
M _base = ρ * V = ρ * V * ( )
M _{Härtungsmittel} = ρ * V = ρ * V * ( )
Überprüfen Sie die dynamische Stabilität des Biorobots mit der gewünschten Dimension und Geometrie mit den Analyseschkripten; Siehe die ergänzenden Informationen, 'Biorobot_dynamic_stability.m' und 'CG_CB_calculation.m'.

_title "> 2. Herstellung von biologischen Aktuatoren auf einer stationären Basis

HINWEIS: Siehe Abbildung 1a.

Schleudern Sie einen dünnen Film von PDMS (siehe Abbildung 1a-1 und a2). Die Dicke des resultierenden PDMS-Films beträgt 25 μm.
1. Legen Sie einen Silizium-Wafer auf einen Photoresist-Spinner und drehen Sie den Pumpschalter auf, um Saug zu erzeugen.
  HINWEIS : Der Siliziumwafer hat einen Durchmesser von 4 Zoll und eine Dicke von 500 μm.
2. Gießen Sie positiven Photoresist ( zB S1808) auf den Siliziumwafer, bis der Wafer vollständig bedeckt ist. Programmieren Sie den Spinner, um bei 2.000 U / min für 20 s zu drehen. Dann den Spinner durch Drücken auf das Fußpedal betätigen. Nach dem Spinnen das Saug abschalten.
3. Eine Heizplatte bis 120 ° C erhitzen. Verwenden Sie die Wafer-Pinzette, um den Silizium-Wafer vom Spinner abzuholen und legen Sie den Silizium-Wafer direkt auf die Kochplatte. Den Wafer mit einer flachen Petrischale abdecken und 10 Minuten backen.
  HINWEIS : Ein Ofen kann verwendet werden, um baKe der Wafer mit der gleichen Temperatur und Dauer. Abbildung 1a-1 zeigt diesen Prozess.
4. Legen Sie einen Plastikbehälter auf eine Waage und ziehen Sie ihn heraus. Gießen Sie 6 g PDMS-Base in den Behälter und fügen Sie 0,6 g PDMS-Härtungsmittel hinzu. Mischen Sie das PDMS sorgfältig für 5 min.
  HINWEIS: Nach dem Mischen sollte die Mischung mit Blasen zusammenlaufen.
5. Legen Sie den Behälter gemischten PDMS in eine Vakuumkammer. Den Druck der Vakuumkammer auf 100 mbar reduzieren und den Behälter für 30 min in die Kammer geben. Unterbrechen Sie das Vakuum und entfernen Sie den Behälter. Bewahren Sie den Behälter bis zum Gebrauch auf.
6. Legen Sie den Siliziumwafer mit der gebackenen Photoresistschicht auf den Spinner. Langsam gießen Sie die gesamte entgaste PDMS-Mischung auf den Wafer.
  HINWEIS: Gießen Sie langsam, so dass keine neuen Blasen in die Mischung eingeführt werden.
7. Setzen Sie den Spinner auf 1.200 U / min für 5 min. Den Spinnersauger einschalten und den Spinner einrasten lassen. Nach dem Spinnen das Saug abschalten.
  HINWEIS: TDiese Einstellungen führen zu einer 25 μm dicken Schicht PDMS.
8. Einen Backofen auf 40 ° C erhitzen. Verwenden Sie die Waferpinzette, um den Siliciumwafer vom Spinner abzuholen und legen Sie ihn dann in den Ofen. Den Wafer über Nacht backen und den Wafer bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
  HINWEIS: Abbildung 1a-2 zeigt diesen Prozess.
Lasergravur der Dünnfilm-PDMS-Schicht.
1. Schalten Sie den Netzschalter des Lasergraviers und dessen Auspuff ein. Schalten Sie den mit dem Lasergravierer verbundenen Computer ein. Öffnen Sie die Lasergraviersoftware.
2. Aktivieren Sie unter der Option "Datei" die in Abbildung 2e gezeigte biologische Aktor-Designdatei.
  1. Drücken Sie die Taste "Einstellungen". Klicken Sie auf "Blau" und ändern Sie die Leistungseinstellung auf 3% und Geschwindigkeit auf 4%. Klicken Sie auf "Set". Klicken Sie auf "Schwarz" und ändern Sie den "Modus" zu überspringen. Dann klicken Sie auf "Set". Muss dasselbe für "Rot". Drücken Sie die Taste "Übernehmen", um den Vorgang abzuschließenEinstellungen."
  2. Drücken Sie die Taste "Aktivieren Sie den Graveur" oben rechts.
3. Drücken Sie die Taste "Relocate", um das Design in die Mitte des Bildschirmes der Software zu verschieben.
4. Drücken Sie die Taste "Focus View" im Programm und klicken Sie auf den Rand des Biorobots auf dem Bildschirm. Dadurch wird der Führungslaserpunkt des Lasergraviers an den entsprechenden Punkt verschoben.
5. Bewegen Sie den Wafer manuell mit Pinzette, so dass der Punkt auf dem Wafer, der dem Punkt entspricht, der in 2.2.4 geklickt wird, direkt unter dem führenden Laserpunkt liegt.
6. Drücken Sie die Taste "Start gravieren des vorherigen Jobs", um den Gravurvorgang zu starten. Entfernen Sie den Wafer nach Abschluss der Gravur. Schalten Sie alle Geräte aus.
  HINWEIS: Die Schaltfläche "Start gravieren der vorherigen Job" ist das große grüne Dreieck. Schauen Sie nicht direkt auf den Gravurprozess, da der Laser die Augen beschädigen kann. Abbildung 1a-3 zeigt diesen Prozess.
7. Vorbereitung und Herstellung der biologischen Aktorbasis.
  1. Gießen Sie Glasperlen (3 mm Durchmesser) in ein 15 mL Röhrchen. Tauchen Sie die Kügelchen mit 70% Ethanol in DI-Wasser für 24 h ein. Entfernen Sie den Ethanol und füllen Sie das Röhrchen mit DI-Wasser für 24 Stunden. Gießen Sie das DI-Wasser aus und legen Sie das Röhrchen auf eine Kochplatte bei 50 ° C, um das Trocknen der Glasperlen zu erleichtern.
  2. Füge 3 g zu der Menge an PDMS hinzu, die in Gleichung (1) gefunden wurde, um das PDMS zu berücksichtigen, das während des Gießens an den Behälterseiten haftet. Verwenden Sie Gleichung (2), um PDMS-Base und Härtungsmittelmengen zu finden.
  3. Legen Sie einen Plastikbehälter auf eine Waage und ziehen Sie ihn heraus. Gießen Sie die Menge der PDMS-Basis in Schritt 2.3.2 in den Behälter und null es aus. Dann gießen Sie die in Schritt 2.3.2 gefundene Menge an PDMS-Härtungsmittel in den Behälter.
  4. Mischen Sie das PDMS sorgfältig für 5 min.
    HINWEIS: PDMS wird in einem Verhältnis von 10: 1 Base zu Härter verwendet. Die Mischung sollte viele Blasen haben.
  5. OrtEin Behälter, der zum Backen auf einer Skala verwendet werden soll. Füllen Sie sorgfältig die korrekte Menge an PDMS aus, die in Schritt 2.3.2 (und gemischt in Schritt 2.3.4) in den Behälter gefunden wurde. In regelmäßigen Abständen putzen Sie die Glasperlen in der gesamten PDMS-Mischung. Lassen Sie ein Minimum von 5 mm Platz um jeden Wulst für die biologische Aktor Basis.
  6. Stellen Sie den Behälter in eine Vakuumkammer. Den Vakuumdruck auf 100 mbar reduzieren und die Vakuumpumpe abschalten. Nach 30 min das Vakuum abbrechen und den Behälter entfernen. Bis zum Gebrauch aufbewahren.
    HINWEIS: Der Druck in der Kammer kann im Laufe der Zeit langsam ansteigen, wenn die Mischung entgast und die Vakuumkammer ausläuft. Wenn der Druck wesentlich über 100 mbar ansteigt, schalten Sie die Vakuumpumpe ein, um den Druck auf 100 mbar wiederherzustellen.
  7. Eine Heizplatte auf 40 ° C erhitzen. Setzen Sie den Behälter PDMS und die Glasperlen sorgfältig auf die heiße Platte. Den Container abdecken und über Nacht backen.
8. Biologische Stellantrieb. HINWEIS: Das folgende Verfahren kann mit bloßem Auge durchgeführt werden.
  1. Schneiden Sie Würfel (5 mm x 5 mm x 5 mm) aus der Schüttgut PDMS aus Teil 2.3 mit einer Rasierklinge.
    HINWEIS: Eine Perle sollte in der Mitte jedes Würfels sein.
  2. Reinigen Sie alle Seiten jeder biologischen Aktorbasis, um jegliche Verunreinigungen auf den Grundflächen zu entfernen, indem Sie die Unterseite in das Band drücken und entfernen. Wiederholen Sie für jede Seite.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.2 bis 2.3.6, um eine kleine Menge an flüssigem PDMS zu machen. Tauchen Sie die Spitze einer Nadel in die flüssige PDMS. Legen Sie einen Tropfen des flüssigen PDMS auf die gravierte Grundfläche des in Schritt 2.2 gemusterten Wafers. Das Tröpfchen von PDMS verschmieren, damit es die 5 mm x 5 mm Grundfläche vollständig bedeckt.
    HINWEIS: Die Grundfläche ist der mittlere quadratische Abschnitt in Abbildung 2a .
  4. Verwenden Sie die Pinzette, um den gereinigten Würfel aus Schritt 2.4.2 auf die Grundfläche zu legen, die mit flüssigem PDMS bedeckt ist.
  5. Wiederholen Sie Schritt 2.4.3 von "Legen Sie einen Tropfen flüssigen PDMS" in die eNd und Schritt 2.4.4 für jedes Gerät, das gemacht wird.
  6. Eine Heizplatte auf 40 ° C erhitzen. Setzen Sie den Siliziumwafer vorsichtig mit den Baugruppen auf die Heizplatte. Den Wafer abdecken und über Nacht backen.
    HINWEIS : Halten Sie die Baugruppen bis zum Gebrauch an. Abbildung 1a-4 zeigt die endgültige Vorrichtung.
3. Herstellung von Bioroboten (Abbildung 1b)
1. Schleuderbeschichten und Lasergravieren einer dünnen PDMS-Folie
  1. Wiederholen Sie alle Schritte in 2.1 und 2.2 mit einem neuen Silizium-Wafer. Dies führt zu einem Silizium-Wafer mit einem dünnen Film aus PDMS und einem dünnen Film des Photoresists, der mit einem Biorobot-Design eingraviert ist.
    HINWEIS : Bei der Wiederholung von Schritt 2.2 verwenden Sie das Biorobot-Design für die Lasergravur anstelle des zuvor verwendeten biologischen Aktuator-Designs. Die Fig. 1b-1 und b-3 zeigen diese Verfahren.
2. Vorbereitung und Herstellung von PDMS CompoStandorte.
  HINWEIS : Das folgende Verfahren kann mit bloßem Auge durchgeführt werden.
  1. Gießen Sie Phenolmikroballons in ein 50 mL Röhrchen bis voll. Füllen Sie das Röhrchen mit 70% Ethanol in DI-Wasser und lassen Sie es für 24 h sitzen. Gießen Sie das Ethanol aus, fügen Sie DI Wasser hinzu und lassen Sie es für 24 Stunden sitzen. Gießen Sie das DI-Wasser aus und legen Sie das Röhrchen dann auf eine Kochplatte bei 50 ° C, um das Trocknen der Mikroballons vor Gebrauch zu erleichtern.
  2. Verwenden Sie die Gleichung (1) mit der MB-PDMS-Dichte und 3,5 mm Höhe, um das Volumen des benötigten PDMS zu finden. Fügen Sie 3 g zum Gesamtbetrag hinzu, um das Material zu berücksichtigen, das nach dem Gießen im Behälter bleibt. Verwenden Sie Gleichung (3), um die PDMS-Basis und die Härtungsmittelmengen zu finden. Messen Sie die entsprechende Menge an PDMS-Base, Härtungsmittel und Mikroballons unter Verwendung der Skala.
  3. Verwenden Sie Gleichung (1) mit Ni-PDMS-Dichte und 1,5 mm Höhe, um das Volumen der benötigten PDMS zu finden. Füge 3 g zum Gesamtbetrag wie in Schritt 3.2.2 hinzu. Verwenden Sie Gleichung (2), um die PDMS-Basis zu finden und a zu härtenGentbeträge Messen Sie die geeignete Menge an PDMS-Base, Härtungsmittel und Nickelpulver unter Verwendung der Skala.
  4. Jede Mischung aus MB-PDMS und Ni-PDMS für 5 min mischen. Setzen Sie die korrekte Menge an MB-PDMS und Ni-PDMS, die in 3.2.2 und 3.2.3 berechnet wurden, sorgfältig in separate Behälter unter Verwendung einer Skala ein.
    HINWEIS : Die Mischungen sollten gründlich durch einen Metall- oder Glasstab gemischt werden, ohne die Unterseite des Mischbehälters zu zerkratzen. Die Mischung wird mit Blasen zusammenlaufen.
  5. Legen Sie beide Behälter in eine Vakuumkammer. Den Druck auf 30 mbar für 30 min reduzieren. Das Vakuum zerbrechen und die Behälter entfernen. Bis zum Gebrauch aufbewahren.
  6. Eine Heizplatte auf 40 ° C erhitzen. Legen Sie Behälter mit MB-PDMS und Ni-PDMS auf die Heizplatte. Bedecken Sie jeden Container und backen Sie über Nacht.
    HINWEIS : Mit Deckel bis zum Gebrauch aufbewahren.
3. Biorobot-Montage.
  1. Schneide Biorobot-Basen von Dimensionen, die jeweils jeder Biorobot-Größe von Ni-P entsprechenDMS und MB-PDMS mit einer Rasierklinge. Siehe Abb. 2b-2d für Grundkonstruktionen.
    HINWEIS: Die Dicken von Ni-PDMS betragen 1,5 mm und die von MB-PDMS 3,5 mm.
  2. Reinigen Sie alle Seiten der Biorobot-Basen, um jegliche Verunreinigungen auf den Oberflächen zu entfernen, indem Sie die Unterseite in das Band drücken und entfernen. Wiederholen Sie für jede Seite.
  3. Schalte einen Koronaentlader ein. Bringen Sie die Spitze des Koronaentladers 1 cm über die Ni-PDMS-Basis, die auf einer Metallplatte mit einem Reinraumgewebe dazwischen platziert wird. Bewegen Sie die Spitze um die Unterseite und fahren Sie für 15 s fort, um die Oberfläche zu behandeln.
    HINWEIS: Zwischen dem Koronaentlader und dem Wafer sollte eine Entladung auftreten. Wenn dies nicht der Fall ist, bringen Sie die Spitze näher, bis eine Entladung auftritt.
  4. Wiederholen Sie Schritt 3.3.3, um die Oberfläche der Basis eines Biorobots zu behandeln, der in Schritt 3.1 für die gleiche Dauer eingraviert wurde. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Ni-PDMS-behandelte Seite auf die behandelte Seite des Films zu legen. Lassen Sie das Gerät für 5 min sitzen.
    HINWEIS : Das wird stronGly Bindung der beiden Teile. Siehe Abbildung 1b4 .
  5. Verwenden Sie scharfe Pinzette, um den Biorobot-Cantilever vom Wafer zu schälen und legen Sie ihn auf die Unterseite der Ni-PDMS-Basis. Verwenden Sie eine Pinzette, um die gesamte Baugruppe vom Wafer zu entfernen.
    HINWEIS : Der Cantilever wird an der Ni-PDMS-Basis befestigt. Abbildung 1b-5 und b-6 zeigt dies.
  6. Legen Sie einen kleinen Tropfen ungehärteten PDMS (10: 1 Base auf Härtungsmittel) auf der Oberseite der MB-PDMS Basis. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Seite des Ni-PDMS mit dem Dünnfilm PDMS auf dem MB-PDMS mit dem ungehärteten PDMS zu platzieren. Legen Sie die Baugruppe in eine Plastik-Petrischale und legen Sie sie dann auf eine Kochplatte bei 40 ° C, um über Nacht zu härten.
    HINWEIS: Abbildung 1b-7 zeigt das Endgerät.
4. Funktionalisierung der Geräte
HINWEIS : Im Folgenden beschreiben wir den Vorgang der Vorbereitung der Geräte für die Zellseeding.
1. PrepSind die erforderlichen Materialien: Fibronectin-Lösung (50 μg / ml), Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Antibiotikum (DMEM komplett).
2. Legen Sie 100 μl Fibronectinlösung in die Mitte eines T-25 Kulturkolbens (Bodenoberfläche, wenn der Kolben aufrecht sitzt). Pflegen Sie für jedes Gerät separate Flaschen.
3. Legen Sie den Biorobot oder den biologischen Aktor nach unten über das Tröpfchen der Fibronectinlösung. Achten Sie darauf, dass der Cantilever entfaltet und in das Tröpfchen eingetaucht ist. Inkubieren bei 37 ℃ für 30 min.
4. Nach der Inkubation die Fibronectinlösung entfernen und zweimal mit PBS waschen.
5. Entfernen Sie den PBS und füllen Sie den Kolben mit 10 ml DMEM. Inkubieren bei 37 ℃ für 1 h, um die Entgasung des PDMS zu erleichtern. Um die Biorobots in 10 ml Medium zu tauchen, verwenden Sie einen Magneten, um das Gerät am Boden des Kolbens zu halten. Legen Sie die Flasche mit dem samPles in einem Ultraschallbad für 5 min, um die Blasen zu entfernen.
  HINWEIS : Während der Inkubationszeit bilden sich auf der PDMS-Oberfläche Luftblasen, die hier als Entgasung bezeichnet wird. Das in der Biorobot-Baugruppe verwendete Ni-PDMS ist magnetisch. Der biologische Aktuator benötigt keinen Magneten, da er aufgrund des Gewichts des Glaswulstes am Boden des Kolbens bleibt. Der Biorobot oder die biologische Aktuatoranordnung ist nun zum Aussaat bereit, was in Teil 2 ausführlich erläutert wird.

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Representative Results

Der biologische Aktuator und der Biorobot haben sehr ähnliche Herstellungsprozesse, da der Biorobot eine natürliche Erweiterung des biologischen Aktors ist ( Abbildung 1 ). Der biologische Aktuator wurde zuerst entwickelt, um die für den Biorobot benötigten Techniken zu etablieren, die von den Zellen erzeugte Kraft zu analysieren und die Zellreifung mechanisch und biochemisch zu charakterisieren, die beide im Detail in Teil 2 dieses zweiteiligen Artikels beschrieben sind Genauso wie in unserer kürzlich veröffentlichten Arbeit ¹⁵ .

Die Federkonstante des Stellglieds wurde für eine große Änderung des Krümmungsradius des Auslegers während der vollständigen Kontraktion des Kardiomyozytenbogens bewertet und abgestimmt. Dann haben wir den Biorobot entworfen, während wir seiner Stabilität, Kontrolle während der Zellaufsäge und der Leichtigkeit der Fortbewegung besondere Aufmerksamkeit widmen. Zunächst wurden einige Entwürfe gewählt, wie gezeigtIn Abbildung 2b-2d , mit unterschiedlichen Eigenschaften, um zu beurteilen, welche Attribute am meisten zu den Designanforderungen beitragen. Biorobots wurden mit kurzen, langen und breiten Auslegern entworfen und getestet, sowie mit mehreren Cantilevers, um die Wirkung von Änderungen im Aktuator auf die Biorobot-Funktion zu testen. Wir haben auch unterschiedliche Größen der schwimmenden Basis betrachtet. Die Geometrie der Basis wurde als Dreieck gehalten, da sie die Asymmetrie erzeugt, die zu einer Richtungsbewegung führen würde.

Die Stabilität des Biorobots war eine kritische Komponente im Designprozess. Die obere MB-PDMS-Schicht wurde verwendet, um dem Gerät Auftrieb zu verleihen, während die untere Ni-PDMS-Schicht für Stabilität und magnetische Kontrolle verwendet wurde. Durch eine höhere Dichte liefert die aus Nickel hergestellte Grundschicht dem Biorobot die Fähigkeit, sich aufrecht zu halten und nach Exposition gegenüber äußeren Störungen wieder in seine ursprüngliche Position zurückzukehren; Gezeigt in Abbildung 3

Die folgende Gleichung kann die Höhe der Biorobots über der Oberfläche des Mediums beschreiben:

Wobei H _Ni , H _Mb , ρ _Medium , ρ _Mb und ρ ist Abbildung 3b ). Die Höhe der Biorobots ist ein kritischer Faktor, der die maximale Belastung, die sie tragen kann, und ihre Stabilität beeinflusst. Zusätzliches Gewicht, das auf die Basis geladen wird, senken die Biorobots in das Medium und ein größeres Volumen der Basis wird untergetaucht. Das zusätzliche Volumen, das untergetaucht werden soll, hat eine Dichte, die niedriger ist als die des Mediums und erzeugt zusätzlichen Auftrieb, um das zusätzliche Gewicht zu heben. Um also die maximale Traglast zu erhöhen, müssen wir so viel wie möglich erhöhen. Trotzdem wird die Stabilität des Biorobots verringert, wenn h zunimmt. Für maximale Stabilität sollte das Schwerpunkt der Basis so niedrig wie möglich sein. Allerdings würde die Erhöhung von h das Zentrum des Gewichts des Biorobots nahe an oder über dem Medium platzieren und den Biorobot destabilisieren. Daher ist eine detaillierte Analyse erforderlichUm die Stabilität und die maximale Traglast gleichzeitig zu optimieren, bevor die Grundstruktur des Biorobots modifiziert wird.

Um die richtige Dicke jeder Verbundschicht zu bestimmen, wurden verschiedene Mischungsverhältnisse mit Ni-PDMS und MB-PDMS getestet. Die maximalen und minimalen Dichten, die leicht gemischt werden konnten, waren 0,648 g / cm ³ für MB-PDMS und 1,64 g / cm ³ für Ni-PDMS, wie in 3a gezeigt . Alle Biorobothöhen wurden so entworfen, dass das Wiederherstellungsmoment eines Biorobots bei jedem Kippwinkel stark genug wäre, um es wieder in die horizontale Position zu bringen. Eine dreieckige Form wurde verwendet, um den hydrodynamischen Widerstand zu reduzieren. Die endgültigen Dimensionen sind in Abbildung 3d dargestellt . Unter Verwendung eines Computerskripts wurde die Stabilität numerisch analysiert und erwies sich als ein starkes Wiederherstellungsmoment unter Verwendung der zweischichtigen Methode, wie in Fig. 3e gezeigt . Siehe Materialtabelle und ergänzende UnterlagenN für das verwendete Computerprogramm

Abbildung 1: Prozessablauf zur Herstellung des biologischen Aktors und Biorobot. Jede Zeichnung stellt die Schritte in den Materialien und Methoden in den Protokollabschnitten 2 und 3 für die biologische Aktuator- und Biorobotherstellung dar. PDMS-Cantilevers werden durch Schleuderbeschichtung und Lasergravur hergestellt. Dann werden die Ausleger an einer stationären Basis mit einer Glasperle für den biologischen Aktuator ( a ) oder einer selbststabilisierenden schwimmenden Basis für den Bioroboter ( b ) befestigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Abmessungen vonDer biologische Aktuator und die Biorobots, die in dieser Studie und den CAD-Dateien zum Gravieren sowohl des biologischen Aktuators als auch verschiedener Arten von Bioroboten hergestellt werden. ( A ) Biologischer Stellantrieb ( B ) Doppelarm-Cantilever-Biorobot ( C ) Weitarm-Cantilever-Biorobot. ( D ) Einarmiger Biorobot ( E ) CAD-Zeichnung des biologischen Aktors für die Lasergravur ( F ) CAD-Zeichnung von Bioroboten für Lasergravur Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Mischen von Dichte für Ni-PDMS und MB-PDMS und Stabilität der Biorobots. ( A ) Mischungsverhältnisse und resultierende Dichten. ( B ) Die Dichten und heigHts der Basen in Bezug auf die Medien. ( C ) Die Rotation und Wiederherstellung des Biorobots beim Kippen. Die Fehlausrichtung zwischen dem Schwerpunkt (CG) und dem Auftriebszentrum (CB) erzeugt ein rotierendes Moment. Dieser Moment wird entweder den Biorobot wiederherstellen oder dazu führen, dass er weiter kippt. ( D ) Die Abmessungen des Einarm-Biorobots in Millimeter-Skala. ( E ) Die Wiederherstellungskraft wurde für den in Teil (c) gezeigten Einzelarm-Biorobot unter Kippbedingungen in (b) unter Verwendung von zwei Schichten (Ni-PDMS und MB-PDMS) gegenüber Einzelschicht (MB-PDMS) simuliert. Die Grafik zeigt, dass ein einschichtiger Biorobot sich nicht wiederherstellen wird, wenn er über 45 ° gekippt wird, während der zweischichtige Biorobot immer eine positive Wiederherstellungskraft hat und den Biorobot aufrecht hält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Verschiedene Fortbewegungsmechanismen finden sich unter Wasserschwimmern ¹⁶ . Der Fortbewegungsmechanismus des Biorobots in dieser Studie verwendet fin-basierte Fortbewegung, speziell ostraciiform Fortbewegung. Ostraciiform Schwimmer treiben sich selbst, indem sie einen Schwanz (Cantilever) wackeln und einen starren Körper haben (geschichtete Basis) ¹⁶ . Fische wie die Boxfische und Cowfish verwenden diese Art von Fortbewegung. Ostraciiform Schwimmer sind in der Regel langsam und haben ineffiziente Körper Dimensionen. Obwohl ostraciiform Schwimmen fehlt Geschwindigkeit, diese Form des Schwimmens ermöglicht Ingenieure, verschiedene Funktionalitäten (wie dynamische Stabilität) auf der Basis oder Körper zu implementieren. Das in dieser Studie entwickelte Biorobot-Design basiert auf einer soliden Basis für Floatation und Stabilität, mit einem selbstbetätigenden Cantilever als Triebmechanismus. Einer der wichtigsten Schritte in der Herstellung des Biorobots in dieser Studie ist der Dünnfilm PDMS und Laser-Gravur-Prozess, um die Canti zu bildenHebel. Ohne einen sauberen Cantilever, die richtige Mischung aus PDMS (für Elastizität), korrekte Dicke (für Federkonstante) und Abmessungen (mit ausreichendem Bereich für die konfluierende Adhäsion von Kardiomyozyten zur Erzeugung von Bewegung), wird der Biorobot nicht funktionieren. Darüber hinaus ist es auch notwendig, alle Blasen aus der Cantilever-Oberfläche durch Ultraschall zu entfernen, um eine lebensfähige Oberfläche für die Kardiomyozyten-Befestigung zu schaffen.

Die entwickelten PDMS-Verbundwerkstoffe MB-PDMS und Ni-PDMS können zur präzisen Steuerung der Eintauchtiefe und zur erfolgreichen Herstellung der dynamischen Stabilität der Biorobots eingesetzt werden. Die Massendichte dieser Materialien kann, wie in Fig. 3a gezeigt, fein abgestimmt werden. Darüber hinaus zeigen diese Materialien keine negativen Auswirkungen auf die Reifung und Kontraktion der Kardiomyozyten, wie wir in unserer letzten Arbeit gezeigt haben. Daher können die entwickelten Materialien weithin verwendet werden, um eine selbststabilisierende und schwimmende Struktur zu implementierenE für Bioroboter und andere Anwendungen.

Obwohl das aktuelle Protokoll in der Lage war, einen selbststabilisierenden Schwimmen Biorobot zu bauen, hat es ein paar Einschränkungen. Erstens, da der Cantilever manuell vom Wafer abgezogen wird, kann der Cantilever während des Prozesses verformt werden und die Wiederholbarkeit der Biorobot-Leistung wird beeinträchtigt. Dies kann durch Verwendung einer wasserauflösenden Opferschicht anstelle der Photoresistschicht adressiert werden, so daß der Cantilever leicht aus dem Wafer entfernt werden kann; Größere Cantilever können auch für höhere Leistung eingesetzt werden. Zweitens beruht das Verfahren hauptsächlich auf manuellen Operationen. Das Herstellungsverfahren kann für eine höhere Effizienz gestrafft werden. Beispielsweise kann der Zusammenbau einschließlich der Kardiomyozyten-Saatgut modifiziert werden, um ihn auf einer Wafer-Ebene statt der individuellen Geräteebene zu leiten. Schließlich kann die Form der dreieckigen Basis des Biorobots optimiert werden, um die Richtcharakteristik und die Stabilität des Schwimmens zu erhöhen.

<P class = "jove_content"> Biorobots, die die von lebenden Muskelzellen erzeugte Kraft nutzen, sind als Alternative zu traditionellen, vollständig künstlichen Robotern von großem Interesse. Dieses Protokoll verwendet weiche Lithographie und Bio-MEMS-Techniken, um einen selbststabilisierenden, schwimmenden Biorobot herzustellen. Das besondere Design kann weiter verfeinert werden. Die Effizienz des Stellglieds könnte durch Musterung von Ausrichtungs-Cues für die Kardiomyozyten auf der freitragenden Oberfläche erhöht werden. Dies wird die Zellorientierung fördern und die Krafterzeugung der Cariomyoctyes erhöhen ¹⁷ . Die Abmessungen könnten auch variiert werden oder es können mehrere freitragende Arme angebracht werden, um die Nettokraft von synchronisierten Kontraktionen weiter zu erhöhen. Wie bereits erwähnt, ermöglicht die mehrschichtige Basis die Anpassung der Höhe des Biorobots über der Medienoberfläche. Dies bestimmt die maximale Tragkraft und Stabilität. Weiterhin können wir dem Cantilever leitfähige Materialien ersetzen oder hinzufügen, um fHemmen elektrische stimulation. Elektrische Stimulation kann verwendet werden, um die Kontraktionsrate der Zellen und die Geschwindigkeit der Biorobots zu kontrollieren. Wir glauben, dass die vorgestellten Methoden verwendet werden können, um hocheffiziente Biorobots für Anwendungen wie kleine Paketlieferung zu entwickeln.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren

Acknowledgments

MT Holley wird unterstützt durch die Graduate Fellows Programm der Louisiana Board of Regents und C. Danielson wird von Howard Hughes Medical Institute Professors Programm unterstützt. Diese Studie wird von NSF Grant No: 1530884 unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei der Unterstützung des Reinraums im Center for Advanced Microstructures and Devices (CAMD).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	184 sil elast kit 0.5kg	Sylgard 184
Nickel Powder	Sigma-Aldrich	266981-100G
Phenolic microballoons	US Composites	BJO-0930
Silicon wafers			4 inch diameter
PWM101 light-duty spinner			Spin- coater
Positive photoresist (S1808)	Dow Corning	DEM-10018197
Hotplate
Vacuum chamber
M206 mechanical convection oven			Convection oven
Laser engraver	Universal Laser System	VLS2.30	Utilizes a 10 W, 10.6 µm wavelength, CO₂ Laser
Universal Laser Systems Application	Universal Laser System		Application for running the VLS 2.30
Matlab	MathWorks		Numerical analysis program
Scotch Tape	Scotch Brand
Solid-glass beads	Sigma-Aldrich	Z265926-1EA	Soda-lime glass, diameter 3 mm
Scale	Mettler Toledo	EL303
BD-20AC Laboratory Corona Treater	Electrotechnic Products	12051A	Corona Discharger
Ultrasonic Bath 1.9 L	Fisher Scientific	15-337-402	40 kHz industrial transducer
Fibronectin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141
Dulbecco’s Phosphate Buffer (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Hyclone Laboratories	16750-074	With 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate.
Fetalclone III serum	Hyclone Industries, GE	16777-240	Fetal bovine serum
Penicillin-G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032

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References

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Bioengineering

Herzmuskelzellbasierter Aktuator und selbststabilisierender Biorobot - TEIL 1

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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