Summary
이 연구는 혈소판의 부착, 퍼짐 및 유속 하의 분비를 연구하기위한 형광 현미경 기반의 방법을 설명합니다. 이 다목적 플랫폼은 혈전증과 지혈에 대한 기계 연구를 위해 혈소판 기능을 조사 할 수있게합니다.
Abstract
혈소판은 혈관 침범을 봉쇄하기위한 혈전 형성의 지혈에 필수적인 요소입니다. 또한 혈전증, 혈관을 막아 장기를 손상시키는 혈전 형성에 생명을 위협하는 결과를 초래합니다. 이것은 혈소판 기능에 대한 과학적 연구와 흐름 조건에서 일어날 때 세포 생물학적 과정을 추적하는 방법 개발의 동기를 부여합니다.
혈소판 접착 및 응집의 연구를 위해 다양한 유동 모델을 사용할 수 있는데, 혈소판 생물학의 두 가지 주요 현상입니다. 이 연구는 활성화 동안 혈류에서 실시간으로 혈소판 탈과립을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 와이드 필드 역전 된 LED 기반 형광 현미경 아래에 놓인 주사기 펌프 셋업에 연결된 유동 챔버를 사용합니다. 여기에 설명 된 설정은 형광으로 표지 된 항체 또는 형광으로 전달되는 다중 형광 물질의 동시 여기를 허용합니다염료. 라이브 셀 이미징 실험 후 커버 유리는 정적 현미경 ( 즉, 공 초점 현미경 또는 주사 전자 현미경)을 사용하여 추가 처리 및 분석 될 수 있습니다.
Introduction
혈소판은 혈류를 순환하는 무핵 세포입니다. 그들의 주요 기능은 손상 부위에서 혈관 침범을 봉쇄하고 출혈을 막는 것입니다. 이러한 부상 부위에서, 내피 내 콜라겐 섬유가 노출되고이어서 다량 단백질, 폰 빌레 브란트 인자 (VWF)로 덮힌 다. VWF는 세포 표면의 당 단백질 Ibα-IX-V 복합체에 의존하는 메커니즘으로 혈소판과 순환 적으로 상호 작용하여 혈소판의 속도를 늦춘다. 이것은 고 전단 속도에서 특히 중요합니다. 이어서 혈소판은 콜라겐으로부터 활성화 자극을받는 동안 형태 학적 변화를 겪습니다. 이것은 돌이킬 수없는 퍼짐 및 결국 혈소판 응집을 유도한다. 두 공정 모두 혈소판 - 혈소판 혼입을 촉진하기 위해 과립 내용물의 분비에 달려있다. 그 중에서도 혈소판 알파 과립에는 혈소판의 부착과 다리를 돕기 위해 섬유소원과 VWF가 포함되어 있습니다혈소판을 인테그린에 의존적으로 결합시킨다. 혈소판 고밀도 과립에는 혈소판 활성화를 강화시키는 데 도움이되는 칼슘 및 아데노신 디 포스페이트 (ADP)를 비롯한 무기 화합물 2가 포함되어 있습니다. 또한 혈소판에는 (알레르기) 염증 3 매개체, 보체 - 조절 단백질 4 및 혈관 신생 인자 5,6 이 포함되어있어 이러한 내용물이 다양한 조건에서 어떻게 다르게 방출되는지 여부와 문제에 대한 의문을 제기합니다.
1980 년대 이래로, 혈류 모델에서 혈소판 기능에 대한 연구는 혈전 메커니즘의 연구에 유용했다. 그 이후로 많은 기술적 진보가 이루어졌으며, 피브린 형성을 포함하는 유동 모델은 현재 생체 내 에서 치료 용 혈소판 농축 물의 지혈 가능성을 평가하기 위해 개발되었다.혈전 형태학에 전단 율의 교란이 미치는 영향을 조사 9 . 병리학 적 혈전 형성 (혈전증)에 비해 안정적인 접착 및 생리적 인 혈전 형성 (지혈)을 유도하는 분자 및 세포 - 생물학적 기전의 차이는 매우 미묘 할 수 있으며, 이러한 세포 내 (subcellular)의 실시간 시각화를 허용하는 흐름 모델의 개발을 동기 부여 할 수있다 프로세스.
그러한 셋업이 가치있는 과정의 예는 세포 내 폴리 인산염의 (재) 분포와 응고 인자의 동원에 의해 섬유소 미세 구조에 미치는 영향을 밝혀줍니다. 연구는 종종 종단점 분석으로 제한됩니다. 기술 된 방법의 주 목적은 혈류가 활성화 된 상태에서 혈소판 활성화 과정에서 발생하는 동적 세포 과정을 실시간으로 시각적으로 조사 할 수있게하는 것입니다.
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Protocol
University Medical Center Utrecht의 지역 의료 윤리위원회 (Medical Medical Committee)는이 연구를 포함한 생체 외 연구 목적으로 혈액을 채취하는 것을 승인했습니다.
1. 솔루션 준비
- 10mM HEPES, 0.5mM Na 2 HPO 4 , 145mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgSO 4 및 5.55mM D- 글루타민을 용해시켜 4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) Tyrode 's 완충액을 준비한다. 증류수 내 포도당.
- 완충액의 두 가지 변종을 만드십시오 : pH를 각각 6.5와 7.4로 설정하십시오. 실험 매일에 신선한 완충액을 만드십시오. 표시된 경우 10 ng / mL 프로 스타 사이클린으로 보충하십시오.
- 증류수에 50 MM 트리스와 150 MM NaCl을 용해하여 pH를 9.0으로 조정하여 TRIS - 버퍼 식염수 (TBS)를 준비합니다.
- 85 mM Tri-sodium citrate, 71 mM citric acid 및 111 mM D-glucose를 용해시켜 산성 구연산 포도당 (acid citrate dextrose, ACD)을 준비한다.경수.
- HEPES Tyrode의 완충액 pH 7.4에 2 % (v / v) 파라 포름 알데히드 (PFA)를 첨가하여 고정액을 준비하십시오. 용해시키기 위해 가열 (50 - 70 ° C)하고 pH를 7.4로 설정하십시오. 분주하고 -20 ° C에서 보관하십시오. 사용 전에 37 ° C에서 해동하십시오.
- HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4에 1 % (m / v) 인간 혈청 알부민 (HSA)을 용해하여 차단 완충액을 준비합니다
- 글리세롤 12g에 폴리 비닐 알콜 4.8g을 가하여 폴리 비닐 알콜 용액을 만들고 잘 섞는다. 12 mL의 증류수를 넣고 상온에서 로테이터에 밤새 방치한다.
- 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5) 24 mL를 넣는다. 30 분 동안 혼합하면서 50 ℃로 가열한다. 1,25- 디아 자비 시클로 [2.2.2] 옥탄 (DABCO) 1.25g을 가하고 잘 섞는다. 5 분 1,500 XG에서 원심 분리기. 나누어 진 상등액 (1 mL는 15-20 슬라이드에 충분 함) -20 ° C에 보관하십시오. 분량을 한 번 사용하십시오.
2. 커버 유리 준비
- Degrease 표지희석 된 염색 황산에서 밤새 배양하여 유리 (25 x 50 mm 2 )에 옮겼다. 커버 유리를 증류수로 헹구고 오븐에서 60 ° C로 밤새 건조시킵니다.
- 실험실 벤치 위에 파라핀 필름 스트립 (10 x 15cm 2 )을 물방울과 함께 붙이고 파라핀 필름을 부드럽게하여 공기를 제거합니다. paraffin 필름에 10 μg / mL VWF 또는 100 μg / mL fibrinogen의 피펫을 80 μL 떨어 뜨립니다. 방울 위에 안경을 놓으십시오. 단백질 용액은 두 표면 사이에 퍼져 유리의 전체 뒷면을 덮을 것입니다. 실온 (RT)에서 1.5 시간 동안 품어 낸다.
- 파라핀 필름을 제거하고 차단 된 버퍼가있는 4-well 플레이트에 코팅면이 위로 오도록하여 커버 유리를 올려 놓습니다. 37 ° C에서 1 시간 또는 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다. 대조군으로 VWF 또는 피브리노겐으로 코팅되지 않은 커버 글래스를 차단하십시오.
3. 혈소판 풍부 혈장 (PRP)
참고 : 원심 분리 후, 위에서 아래로 3 개의 층이 관찰 될 수 있습니다 : PRP, 백혈구 및 적혈구. 흰색과 빨간색 셀을 포함하지 않도록주의하십시오. 일반적으로 9 mL 혈액 튜브를 원심 분리 한 후 PRP 3 mL를 수집 할 수 있습니다.
참고 : 일반적으로이 두 번째 원심 분리 단계 후에 2 mL를 수집 할 수 있습니다.
참고 : 희석 된 PRP의 총량은 기증자의 혈소판 수에 따라 다릅니다. 혈소판 수는 기증자에 따라 크게 다르며 PRP 희석은 개별적으로 평가해야합니다. 혈소판 수치는 150,000 ~ 450,000 혈소판 / μL 범위 내에서 정상으로 간주됩니다.
4. 세척 된 혈소판의 제조
- 세포 분석기를 사용하여 PRP에서 평균 혈소판 부피 (MPV)를 결정합니다.
참고 : 이것은 혈소판 사전 활성화 11 의 표시입니다. 혈소판을 쉬기위한 정상 MPV는 7.5-11.5 fL입니다 11 . MPV는 혈소판 세척 과정에서 1.5 fL 이상 증가하면 안됩니다. - 혈소판 사전 활성화를 방지하기 위해 PRD에 1/10 부피의 ACD를 넣고 브레이크없이 400 xg 및 RT에서 15 분간 원심 분리하십시오. su를 제거하십시오.HEPES Tyrode의 완충액 (pH 6.5)에서 조심스럽게 pellet을 PRP의 원래 부피로 다시 부순다.
- TBS를 10 μg / mL의 농도로 첨가하여 프로스타 시클린의 분량을 녹입니다. 얼음에 보관하십시오.
- 혈소판 활성화를 막기 위해 프로 그레시클린을 재조합 혈소판에 10 ng / mL의 최종 농도로 첨가하고 브레이크없이 400 xg 및 RT에서 15 분간 즉시 원심 분리하십시오. 뜨는를 제거하고 HEPES Tyrode의 버퍼, 산도 7.4에서 신중하게 펠렛을 다시 중단.
- 혈소판 수를 세고 (단계 3.5) MPV (단계 4.1)의 변화를 결정하십시오 (MPV가 1.5 fL 이상 변하지 않아야 함).
- HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)으로 혈소판 수를 150,000 혈소판 / μL의 농도로 조정하십시오. 실험 전에 RT에서 30 분 동안 회복하기 위해 혈소판을 남겨주세요. 격리 후 4 시간 이내에 실험을 위해 세척 된 혈소판을 사용하십시오.
5. 플로우 챔버 어셈블리
12를 사용 합니다. 추가 분석을 위해 우선적으로 제거 할 수있는 커버 유리를 수용 할 수있는 한 상업적으로 생산 된 다양한 유동 챔버를 사용할 수 있습니다. 설명 된 실험에 사용 된 유동 챔버는 현미경 삽입 스테이지에 정확하게 맞도록 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)로 만들어졌습니다. 여기에는 흡입구와 배출구 ( 그림 1A - C , 1, 2)와 진공 연결부 ( 그림 1A 및 C , 3)가 있습니다. 맞춤형 실리콘 시트 ( 그림 1A 및 D ; 4)가 위에 배치됩니다. 두 개의 컷 아웃은 커버 유리 ( 그림 1A , 6)를 챔버에 단단히 부착하기 위해 진공 채널을 형성합니다 ( 그림 1A 및 D ; 5). 중앙 절개 부는 유동 채널을 형성한다 ( 도 1A D ; 7; 폭 2.0 mm, 높이 0.125 mm). 입구와 출구는 유로에 연결되고 진공은 진공 채널에 연결됩니다.
- 플로우 챔버의 상단을 증류수로 덮고 부드러운면이 아래로 향한 맞춤 실리콘 시트를 물 위에 놓습니다. 시트를 제 위치에 유지하면서 여분의 물을 제거하여 시트를 제자리에 놓습니다.
참고 :이 실리콘 시트는 재사용이 가능합니다 (실리콘은 비활성 속성으로 알려져 있음). 일반적으로 혈소판은 부착되지 않았다. 시트는 세제로 닦고 재료가 손상 될 때까지 재사용 할 수 있습니다 ( 즉, 채널 사이의 영역에서 특히 찢어짐). 일반적으로 시트는 하루에 여러 번 실험하여 20 일 동안 사용할 수 있습니다. - 60 ° C에서 1 시간 동안 유동 챔버를 배양하여 잔류 물을 증발시켜 실리콘 시트를 유동 챔버에 단단히 부착시킵니다.
- 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 한 방울을HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)을 유로에 넣습니다. 코팅 된면이 아래로 향하게하여 커버 유리 (섹션 2 참조)를 유로에 놓습니다. 진공 펌프를 진공 연결부에 연결하십시오 ( 그림 1A 및 C , 3). 10 kPa의 압력을가하십시오.
6. 혈소판의 사전 염색 및 항체 준비
- 혈소판 염색
- 37 ℃에서 30 분 동안 10 μg / mL DAPI로 세척 된 혈소판을 인큐 베이트한다. 암소에서. 결합되지 않은 DAPI를 씻어 내고 혈소판 활성화를 막기 위해 프로스타글린을 10 ng / mL의 최종 농도로 첨가하고 브레이크없이 400 xg 및 RT에서 15 분간 즉시 원심 분리하십시오.
- HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)에서 혈소판 펠렛을 재생하여 150,000 혈소판 / μL의 혈소판 농도를 얻습니다.
- 항체의 제조
- Biotin으로 표지 된 항체와 Alexa로 표지 된 strep을 혼합합니다.1 : 1의 몰비의 타비 딘. 사용하기 전에 실온에서 최소 10 분 동안 품어 둔다 (단계 7.6).
참고 : 바이오틴 표지 효율은 배치마다 다를 수 있습니다. 표적 분자의 시각화에 문제가있는 경우, 성공적인 바이오틴 일화를 확인하기위한 대조 실험과 특정 비오틴 화 항체의 표적 결합 성질을 수행해야합니다.
- Biotin으로 표지 된 항체와 Alexa로 표지 된 strep을 혼합합니다.1 : 1의 몰비의 타비 딘. 사용하기 전에 실온에서 최소 10 분 동안 품어 둔다 (단계 7.6).
7. 관류
- 형광 현미경뿐만 아니라 현미경 소프트웨어를 시작합니다. 표 1에 나열된 현미경 설정을 사용하십시오.
참고 : 현미경 소프트웨어에 적절한 실험을로드하여 혈소판 및 선택된 형광 표지 항체 및 / 또는 염료의 생세 (live-cell) 시각화 및 기록을위한 현미경 및 기록 설정을 시작하십시오. RT에서 플로우 실험을 수행하십시오. - 튜브에 10mL 주사기를 연결하고 1 % HSA 블로 우를 흡입하여 흡입 튜브를 차단하십시오cking buffer를 주입 튜브에 넣으십시오. RT에서 15 분 동안 품어 둡니다. HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)을 흡 입 튜빙으로 흡입하여 흡입 튜빙을 헹굽니다.
- 차단 된 입구 튜브와 처리되지 않은 출구 튜브를 직경 1.02mm 및 길이 약 20-30cm로 챔버의 입구와 출구에 연결하십시오. 콘센트 튜빙에 10 mL 주사기 (또는보다 낮은 볼륨)를 연결하십시오. 주사기 펌프의 전원을 켭니다.
참고 : 펌프에 설정된 유속과 함께 주사기의 직경이 체적 유량을 결정합니다. 유동 채널의 표면적과 함께, 전단 속도는 식 13 에 따라 계산 될 수있다 이하. 따라서 주사기 펌프의 유량을 변경하거나 유로의 치수를 변경하여 전단 속도를 조작 할 수 있습니다. 800-1600s -1 의 전단 율은 전형적으로 동맥 혈류를 모델로하며, 25-100 s-1 모델은 정맥혈흐름. 이 설정에서 7.5 μL / min의 유속은 25 s -1 의 전단 속도를 발생시킵니다.
전단 속도 = 6Q / h 2 w in s -1
Q = 체적 유량 (mL / s), h = 높이 채널 (cm) (0.0125cm, 실리콘 시트의 두께), w = 너비 채널 (cm) (이 챔버에서 0.2cm). - 100X 대물 렌즈 (1,000X의 총 증폭)에 침지 오일 한 방울을 놓고 유리 표면을 아래로하여 현미경에 챔버를 놓습니다.
- 유입 튜브를 HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)이 들어있는 튜브에 넣으십시오. 출구 튜빙에 연결된 주사기의 플런저를 수동으로 당기고 챔버를 통해 용액을 당겨 시스템에서 공기를 제거합니다. 주사기 펌프 ( 그림 1B 및 C , 8)에 주사기를 놓고 펌프를 잠깐 실행하여 플런저를 조이고 안정된 흐름을 확보합니다.
- 혈소판 현탁액 또는 PRP에 항체 및 / 또는 염료를 조심스럽게 추가하십시오.플라스틱 피펫으로 섞어서 1.5 mL 튜브에 옮긴다.
참고 : 전단 속도 25 s-1 (7.5 μL / min)에서 일반적인 30 분 재관류 의 경우 최소 225 μL의 혈소판 현탁액이 필요합니다. 대표 결과에 사용 된 항체를 표 2 에 나타내었다 . - HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4에서 주입 튜브를 PRP 또는 세척 된 혈소판과 항체 및 / 또는 염료가 들어있는 1.5 mL 튜브 ( 그림 1B 및 C ; 9)로 옮깁니다 .
참고 : 튜빙을 옮길 때 공기가 튜브 안으로 들어가는 것을 방지하기 위해 튜빙이 압착되어 있어야합니다 (공기를 밀어내는 것). 비슷한 방식으로 유입 튜브를 다른 튜브로 이동시켜 후속 단계에서 다양한 시약으로 부착 성 혈소판을 치료할 수 있습니다. 잠재적으로 유용한 시약의 목록이 표 3 에 나와 있습니다. - '실시간 시각화'를 선택하십시오.n "옵션을 사용하여 코팅 된 커버 글래스의 표면에 현미경을 맞추고 혈소판이 유량 용기에 도달 할 때까지 1,600 s-1 (484 μL / min)의 전단 속도로 펌프를 시동하십시오. 시린지 펌프의 세팅을 7.5 μL / min의 유속으로 변경하여 전단 속도를 25 s-1 로 낮추십시오.
- 커버 유리의 코팅면의 표면을 관찰하고 첫 번째 혈소판이 부착하기 시작할 때까지 기다렸다가이 혈소판에 현미경을 맞추고 소프트웨어에서 실험을 시작하여 녹음을 시작하십시오. 여기에 사용 된 녹음 설정은 표 1 을 참조하십시오.
- 라이브 녹음을 시각적으로 따라하십시오. 30 분 후 주사기 펌프를 멈추십시오.
참고 : 실험 도중 혈소판에 초점이 맞춰 졌는지 확인하십시오. 전형적으로, 20-30 개의 혈소판이 1,000X의 배율로 시야에 붙습니다. 이것은 전체 흐름 채널에서 약 2,000-3,000 개의 혈소판입니다. - 사용하여 고정플로우 챔버 (옵션).
- 주사기 펌프를 멈춘 후 흐름이 멈 추면 주입 튜브 (공기가없는)를 고정 용액으로 옮기십시오. 펌프를 다시 시작하고 단계 7.8에서 언급 한 것과 같은 유속으로 채널을 통해 고정 버퍼를 최소 10 분 동안 흐르게하십시오.
- 현미경에서 챔버를 제거하고, 유리에서 침지 오일을 청소하고, 진공을 차단하고, 18G 바늘로 조심스럽게 커버 유리를 챔버에서 제거하십시오.
참고 : 커버 유리가 파손되어 실리콘 시트가 손상되지 않도록하십시오. - 증류수로 미리 적셔 놓은 조직의 상단에있는 4- 웰 플레이트에 커버 슬라이드 (셀이 위를 향하도록)를 놓습니다.
참고 : 이렇게하면 커버 유리가 표면에 달라 붙지 않고 건조되지 않습니다. - 커버 유리 위에 고정액 750 μL를 피펫과 실온에서 1 시간 품어. 샘플을 직접 분석 할 수없는 경우,안정적인 고정을 보장하기 위해 4 ℃에서 0.5 % PFA (HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4로 희석)에 보관하십시오. 이미징을 위해 커버 유리를 처리하려면 8 절을 계속 진행하십시오.
- 사용 후에는 챔버, 튜빙 및 시트를 증류수로 헹구고 세제 용액에서 밤새 배양하십시오. 챔버 및 다른 구성 요소를 재사용하기 전에 증류수로 헹구십시오.
- 모든 메타 데이터가 포함 된 현미경 원시 데이터 파일을 저장합니다. 필요할 때 동영상을 .MOV, h.264 압축 또는 .AVI 비 압축으로 내 보냅니다. 별도의 프레임을 JPEG 또는 TIF 파일로 저장하십시오.
8. 공 촛점 형광 현미경 검사를위한 샘플 준비
- 덮개 유리를 새로운 4-well plates에 옮기고 3 mL의 HEPES Tyrode 's buffer, pH 7.4로 5 회 헹굽니다. 차단 버퍼 3 ML / 잘 추가하고 RT에서 1 시간 품어.
- 블로킹 버퍼를 제거하십시오. HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4에 0.15 % 글리신 (M / V) 3 mL / well을 첨가한다. R에서 15 분간 품어 둔다.티.
- 글리신 용액을 제거하고 3 mL / well의 블로킹 완충액으로 5 번 씻는다. 필요에 따라 추가 염색을 위해 블로킹 완충액으로 희석 한 형광 단 결합 항체를 첨가하십시오. 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 품어 낸다.
- 차단 완충액으로 5 회, 증류수로 2 회 세척한다. 세포를 만지지 말고 조직 안의 가장자리에서 과량의 액체를 제거하여 유리를 말립니다.
- 현미경 슬라이드에 폴리 비닐 알코올 용액 60 μL를 피펫에 넣습니다. 세포와 함께 커버 유리를 방울 위에 놓고 폴리 비닐 알코올이 두 표면 사이에 퍼지게하십시오. 어두운 밤 RT에서 밤새 품어 낸다.
- 공 촛점 현미경으로 세포를 분석 14 .
- 모든 메타 데이터가 포함 된 기록 된 스택 데이터의 원시 데이터 파일을 저장합니다. 필요한 경우 원시 데이터 파일을 MOV, h.264 압축 또는 .AVI 비 압축 파일로 처리합니다. 별도의 스택을 JPEG 또는 TIF 파일로 저장하십시오.
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Representative Results
도 1 은 유동 챔버 및 실험 장치의 이미지를 도시한다. 실리콘 시트의 위치와 치수; 및 배관 연결. 그림 2 는 플로우 챔버의 치수에 대한 세부 사항을 제공합니다. 그림 3 과 영화 1 은 고정 된 VWF에 혈소판 접착 및 퍼짐의 이미지의 시계열을 보여줍니다. CD63은 쉬고있는 혈소판의 세포 내 고밀도 과립 막에 삽입 된 막 관통 단백질이다. 혈소판 표면에 시간 의존적으로 동원되어 녹색으로 표시됩니다. 유사하게, P- 셀렉틴 (Psel)은 쉬고있는 혈소판의 세포 내 알파 - 과립 막에 삽입 된 막 횡단 단백질이다. 혈소판 표면에 시간 의존적으로 동원되어 오렌지색으로 표시됩니다. 도 3b 는 45 ° 각도에서의 대표 이미지, 유동 실험 후 공 촛점 형광 현미경에 의해 획득. 영화 2 는 같은 실험의 기울기 시리즈를 보여줍니다. CD63은 주로 중앙 육아낭에 위치하고 P- 셀렉틴은 세포체 전체에 분포하고 모서리에 집중되어있는 것처럼 보입니다. 그림 4A 와 그림 3 은 CD63의 혈소판 표면 (녹색)에 시간에 따른 동원을 보여줍니다. 이 실험에서는 혈소판 (핵 DNA가없는)을 DAPI (파란색)와 사전 배양하여 밀도가 높은 과립 16에 폴리 인산염을 얼룩지게했습니다. 놀랍게도 조밀 한 과립 방출 (단일 세포 분석이 그림 4B 및 영화 4에 표시됨)의 명확한 징후에도 불구하고 폴리 인산염은이 혈소판의 내부 또는 외부에 유지됩니다. 그림 5 와 영화 5 는 VWF의 시간 의존 동원 (또는 모집)을 보여주는데, thrombogenic multα-granules에 저장된 imeric 단백질 17을 혈소판 표면 (녹색)으로 이동시킨다. 폴리 포스페이트와 유사하게, VWF는 활성화 된 혈소판의 표면과 관련되어있다.
그림 1 : Flow Chamber 및 실험 설정. ( A ) 입구와 출구 (1과 2), 실리콘 시트 (4)가 놓이는 진공 연결부 (3)가있는 흐름 챔버 설계 이미지. 실리콘 시트의 두 개의 외부 컷 아웃 (5)은 커버 유리 (6)를 부착하기위한 진공 채널을 형성합니다. 중앙 컷 아웃 (7)은 유동 채널을 형성한다. ( B ) 실험 장치의 이미지. 입구 및 출구 (1 및 2), 주사기 펌프 (8) 및 시료 홀더 (9). 실험 설정의 ( C ) 도식 개요; 숫자는 A와 B의 그것들과 동일하다. ( D ) 치수를 가진 도식 개요 맞춤형 절단 실리콘 시트의 ( E ) 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트) 유동 챔버의 개략도 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : Flow Chamber의 상세 청사진 흐름 챔버는 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트) 블록 (1) , 진공 흡입구 (2)를 위한 하나의 직선 폴리 옥시 메틸렌 인서트 및 샘플 입구 및 출구 (3)를 위한 두 개의 각진 폴리 옥시 메틸렌 인서트로 구성됩니다. 각진 폴리 옥시 메틸렌 삽입물은 1.07 mm의 직경을 갖는 금속 모세관을 포함합니다. 직선형 인서트에는 직경이 1.3 mm 인 모세관이 있습니다. 658 / 55658fig2large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 고정 된 폰 빌레 브란트 인자에 대한 혈소판 퍼짐 및 탈수소. ( A ) 혈소판의 확산 및 탈과립 표면에 CD63 및 P- 셀렉틴의 시간 의존 동원. 흰색 눈금 막대 (왼쪽 위)는 10 μm를 나타냅니다. ( B ) 45 ° 각도에서 대표 공 촛점 형광 현미경 이미지. 흰색 스케일 막대 (왼쪽 하단)는 2 μm를 나타냅니다. 그린, CD63; 오렌지, P- 셀렉틴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
55658 / 55658fig4.jpg "/>
그림 4 : 고정화 된 섬유소원에서 조밀 한 과립의 혈소판 퍼짐, 탈 과립 화 및 이동성. ( A ) 혈소판 표면에 CD63 및 폴리 인산염의 시간 의존 동원. 흰색 눈금 막대 (왼쪽 위)는 10 μm를 나타냅니다. ( B ) 단일 혈소판의 시계열 (t = 0은 표면에 대한 첫 번째 접착력을 나타냄). 흰색 스케일 막대 (오른쪽 하단)는 2 μm를 나타냅니다. 그린, CD63; 블루, DAPI. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 고정화 된 피브리노겐의 혈소판 표면에 폰 빌레 브란트 인자의 표면 협회. 혈소판 표면에 VWF의 시간 의존 동원 (또는 모집). 티화이트 스케일 바 (왼쪽 위)는 5 μm를 나타냅니다. 그린, VWF. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 환경 | 값 |
| 노출 시간 FITC (Alexa488) | 200 ms / 300 ms |
| LED 488 강도 FITC (Alexa488) | 50 % |
| 노출 시간 DIC | 30 ms |
| 전압 할로겐 램프 | 4.5 볼트 |
| 노출 시간 TRITC (Alexa 546) | 400 ms |
| LED 555 강도 FITC (Alexa546) | 50 % |
| 노출 시간 DAPI | 500ms |
| LED 365 강도 | 50 % |
| Filterset FITC | Filterset 10 |
| Filterset TRITC | Filterset 20 |
| Filterset DAPI | Filterset 01 |
| 목표 | 알파 플랜 - Fluar 100x / 1.45 오일 |
| 프레임 속도, 녹화 시간 | 1 프레임 / 10 초, 30 분 |
| 파일 압축 동영상 | MOV (h.264), AVI (압축되지 않음) |
| 파일 압축 사진 | JPEG, TIF |
표 1 : 현미경 설정. 대표 실험에 사용되는 설정.
| 목표 | 항체 / 염료 | 집중 |
| CD63 | <td> 항 -CD63- 바이오틴 *)325 ng / mL | |
| P- 셀렉틴 | 항 -CD62P- 바이오틴 **) | 90 ng / mL |
| DNA | DAPI | 10 ㎍ / mL |
| VWF | 항 인간 VWF-FITC | 5 μg / mL |
| *) 항 -CD63- 비오틴 항체를 streptavidin-Alexa488과 1 : 1의 몰비로 혼합하여 사용한다. | ||
| **) 항 -CD62P- 바이오틴 항체는 사용 전에 1 : 1의 몰비로 스트렙 타비 딘 -Alexa546과 혼합한다 | ||
도표 2 : 항체와 염료. 제시된 대표 실험에 대해 권장되는 항체 및 염료 농도.
| 시약 카테고리 | 예제 콤보unds |
| 혈소판 작용제 | 트롬빈, ADP, PAR-1 또는 -4 활성화 펩타이드, U46619, 트롬 복산 A2, ADP |
| 효소 억제제 | Hirudin, PPACK, heparinoids (간접), 옥수수 트립신 억제제, 콩 콩 트립신 억제제 |
| 수용체 길항제 | 항 -Glyprotein 1bα, 항 -Glycoprotein VI; 클로피도그렐, (고리 형) RGD- 함유 펩타이드 |
| 활성화 억제제 | 아스피린 전처리, 고정 |
표 3 : 잠재적으로 유용한 시약.
보충 영화 : 영화 1 : 혈소판 이미지의 시계열 ( 그림 1 참조), 영화 2 : 그림 3B 의 틸트 시리즈, 영화 3 : 혈소판에 CD63의 시간 의존 동원( 그림 4 참조), 영화 4 : 단일 셀 분석의 시계열 ( 그림 4B 참조), 영화 5 : VWF의 시간 의존적 동원 ( 그림 5 참조).
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Discussion
전 세계적으로 혈전증은 사망 및 이환율의 주요 원인이며 혈소판은 그 발달에 중심적인 역할을합니다. 이 작품은 흐름 아래 혈소판 degranulation의 라이브 셀 이미징을위한 방법을 설명합니다. 일반적으로 혈소판이 활성화되면 모든 세분화 된 내용물이 직접 용액으로 방출된다고 가정합니다. 수반되는 결과는 이것이 꼭 그런 것은 아니라는 것을 암시한다. 접착 및 탈과립시 혈소판은 상당량의 폴리 인산염을 보유합니다 ( 그림 4 ). 또한, multimeric 단백질 VWF는 degranulation 후 혈소판 표면과 관련이있다 ( 그림 5 ). 이것은 혈소판 과립 탈과립을 조절하는 분자 기작이 일반적으로 추정되는 것보다 미묘 함을 나타냅니다.
유동 하에서 혈소판 탈과립의 생세포 이미징을 가능하게하기 위해, 실험 조건은 혈소판 응집을 최소로 유지하도록 선택되었다. 혈소판 검사150,000 혈소판 / μL의 ts가 사용되었다. 이것은 정상 범위 (150,000 ~ 450,000 혈소판 / μL)의 하단부에 있습니다. 또한, 고정화 된 VWF 또는 피브리노겐에 대한 혈소판의 부착 및 퍼짐을 연구하여 가벼운 혈소판 활성화 (예 : 콜라겐과 대조적)를 유도했습니다. 세척 된 혈소판을 사용한 연구에서 증가 된 전단 속도는이 세포를 흐름의 중심으로 이동시킵니다. 이것은 접착 및 후속적인 퍼짐을 방해하고 탈과립 화의 연구를 복잡하게한다.
생리적 지혈에서 혈소판 마진이 중요합니다. 이 과정은 적혈구에 의해 유도되어 왜 저 빈혈이 때때로 출혈 체질을 동반하는지 설명합니다. 제시된 기술의 한계는 적혈구에 의해 혈소판 탈과립 (제시된 물질 및 시약 포함)의 시각화가 방해 받는다는 것입니다. 혈소판 기능은 유체의 점도 (μ)의 함수 인 전단 응력의 영향을 받는다.전단 속도의 그러므로 유사한 점도 ( 즉, 세척 된 혈소판, 재구성 된 혈액, PRP 또는 전혈)를 갖는 용액에서의 흐름 모델에서 혈소판 기능을 연구하는 것이 좋습니다.
이러한 실험을 수행 할 때 고려해야 할 몇 가지 실용적인 요소가 있습니다. 첫째, 형광 신호는 초점 영역에 의해 강하게 영향을받습니다. 현미경에 초점이 맞지 않으면 신호가 쉽게 흐려 지거나 손실 될 수 있습니다. 혈소판이 흐름 채널에 도착하기 전에 채널 자체에 초점을 맞추는 것이 가장 좋습니다 (실리콘 시트 / 흐름 채널 벽의 가장자리에서 시작). 혈소판이 부착되기 시작하면이 접착 이벤트에 집중하십시오. 두 번째 관심사는 특정 형광체 ( 예 : FITC)의 표백입니다. 반복적 인 여기는 신호 손실로 이어져 조사를 방해합니다. 이러한 장애물은 더 안정한 형광체를 사용하여 흥미 진진한 LED 조명의 강도를 줄이고 exp를 단축함으로써 극복 할 수 있습니다오스 트레 (osure) 시간 및 / 또는 프레임 속도를 낮 춥니 다.
여기에 설명 된 모델은 매우 다양한 고정 된 단백질 및 다양한 유속에서의 혈소판 반응에 대한 상세한 연구를 수행하는 데 매우 유용합니다. 잠재적으로,이 방법은 또한 활성화 된 내피 세포 18 과의 상호 작용을 연구하는데 사용될 수 있습니다. 특수 흐름 챔버의 유연한 설계를 가능하게하는 기술적 진보는 현재 생체 적합성 연구를위한 길을 열어주고 있습니다 19 . 혈류에서의 혈소판 반응성의 생세포 이미징은 혈소판 접착 반응의 복잡성에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 궁극적으로 이러한 경험은 혈소판 기능과 응고 시스템에 대한 영향을 종합적으로 조사 할 수있는 개발 실험 흐름 모델로 이어져야합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
CM은 C1- 저해제 결핍증 (HAEi), Vladen van Het UMC Utrecht 및 수혈 연구를위한 Landsteiner 재단 (LSBR)에 대한 국제 환자기구의 재정 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
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