Summary
ويصف هذا العمل على أساس مضان المجهري طريقة لدراسة التصاق الصفائح الدموية، ونشر، وإفراز تحت التدفق. هذه منصة تنوعا تمكن من التحقيق في وظيفة الصفائح الدموية للبحث الميكانيكي على تخثر الدم والارقاء.
Abstract
الصفائح الدموية هي اللاعبين الأساسيين في الارقاء، وتشكيل الجلطات لختم انتهاكات الأوعية الدموية. كما أنها تشارك في تخثر الدم، وتشكيل الجلطات التي تغلق الأوعية الدموية وجرح الأجهزة، مع عواقب تهدد الحياة. هذا يحفز البحث العلمي على وظيفة الصفائح الدموية وتطوير أساليب لتتبع العمليات البيولوجية الخلية كما تحدث في ظل ظروف التدفق.
وهناك مجموعة متنوعة من نماذج التدفق المتاحة لدراسة التصاق الصفائح الدموية والتجميع، وهما الظواهر الرئيسية في البيولوجيا الصفائح الدموية. يصف هذا العمل طريقة لدراسة التحبيب الصفائح الدموية في الوقت الحقيقي تحت تدفق أثناء التنشيط. الأسلوب يجعل من استخدام غرفة تدفق إلى جانب إعداد مضخة حقنة التي يتم وضعها تحت حقل واسع، مقلوب، ليد المستندة إلى مضان المجهر. الإعداد الموصوفة هنا يسمح للإثارة في وقت واحد من فلوروفوريس متعددة التي يتم تسليمها من قبل الأجسام المضادة فلورزنتلي المسمى أو فلوريسكصبغات. بعد التجارب التصوير الخلية الحية، ونظارات غطاء يمكن معالجتها بشكل إضافي وتحليلها باستخدام المجهر ثابت ( أي المجهري متحد البؤر أو المجهر الإلكتروني المسح).
Introduction
الصفائح الدموية هي الخلايا الأنوية التي تنتشر في مجرى الدم. وتتمثل مهمتها الرئيسية في سد الخروقات الوعائية في مواقع الإصابة ولمنع فقدان الدم. في هذه المواقع من الإصابة، تصبح ألياف الكولاجين تحت البطانية يتعرض ويغطيها لاحقا بروتين مولتيمريك، عامل فون ويلبراند (فوف). فوف يتفاعل مع الصفائح الدموية في التداول في الآلية التي تعتمد على بروتين سكري IPa- إيكس-V معقدة على سطح الخلية 1 ، مما يبطئ سرعة الصفائح الدموية. وهذا مهم بشكل خاص في معدلات القص العالية. الصفيحات في وقت لاحق تخضع للتغيرات المورفولوجية في حين تلقي تنشيط نبضات من الكولاجين. وهذا يؤدي إلى انتشار لا رجعة فيه وفي نهاية المطاف إلى تراكم الصفائح الدموية. كل من العمليات تعتمد على إفراز محتويات الحبيبية لتسهيل الصفائح الدموية الصفائح الدموية الحديث المتبادل. من بين أمور أخرى، حبيبات α الصفائح الدموية تحتوي على الفيبرينوجين وفوف لمساعدة التصاق الصفائح الدموية وجسرالصفائح الدموية معا بطريقة تعتمد على إنتغرين. تحتوي حبيبات كثيفة الصفيحات على مركبات غير عضوية 2 ، بما في ذلك الكالسيوم والأدينوسين ثنائي الفوسفات (أدب)، مما يساعد على تعزيز تفعيل الصفائح الدموية. وعلاوة على ذلك، الصفائح الدموية تحتوي على وسطاء من (حساسية) التهاب 3 ، تكملة السيطرة على البروتينات 4 ، وعوامل الأوعية الدموية 5 ، 6 ، مما يثير تساؤلات حول ما إذا كان وكيف يتم الإفراج عن هذه المحتويات تفاضليا في ظل ظروف مختلفة.
منذ 1980s، وكانت دراسة وظيفة الصفائح الدموية في نماذج التدفق قيمة للتحقيق في آليات الجلطات 7 . ومنذ ذلك الحين، أحرز الكثير من التقدم التقني، وتطورت حاليا نماذج التدفق التي تشمل تشكيل الليفين لفحص إمكانات مرقئ من مركزات الصفائح الدموية العلاجية السابقين الجسم الحي 8 أوالتحقيق في تأثير الاضطرابات في معدلات القص على التشكل الخثرة 9 . قد تكون الاختلافات في الآليات الجزيئية والخلية والبيولوجية التي تدفع التصاق مستقر وتشكيل خثرة الفسيولوجية (الارقاء) مقابل تشكيل خثرة المرضية (تخثر) دقيقة جدا وتحفيز تطوير نماذج التدفق التي تسمح لتصور في الوقت الحقيقي من هذه الخلايا الخلوية العمليات.
مثال على العملية التي من شأنها أن يكون هذا الإعداد قيمة هو (إعادة) توزيع متعدد الفوسفات داخل الخلايا وتجنيد عوامل التخثر للكشف عن تأثير تعتمد على الوقت أن هذا على البنية التحتية الفبرين 10 . وغالبا ما تقتصر الدراسات على تحليلات نقطة النهاية. والهدف الرئيسي من الطريقة الموصوفة هو تمكين التحقيق البصري في الوقت الحقيقي من العمليات تحت الخلايا الحيوية التي تحدث خلال تفعيل الصفائح الدموية تحت التدفق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت اللجنة الأخلاقية الطبية المحلية للمركز الطبي الجامعي أوترخت رسم الدم لأغراض البحث خارج الجسم الحي ، بما في ذلك تلك الدراسة.
1. إعداد الحل
- إعداد 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينيثان سلفونيك حمض (هيبيس) العازلة تيرود عن طريق إذابة 10 ملي هيبيس، 0.5 ملي نا 2 هبو 4 ، 145 ملي كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم مغسو 4 ، و 5.55 ملم D- الجلوكوز في الماء المقطر.
- جعل اثنين من المتغيرات من المخزن المؤقت: تعيين مستويات الرقم الهيدروجيني في 6.5 و 7.4 على التوالي. جعل العازلة جديدة لكل يوم من التجارب. الملحق مع 10 نانوغرام / مل بروستاسيكلين حيث المشار إليها.
- إعداد تريس مخزنة المالحة (تبس) عن طريق إذابة 50 ملي تريس و 150 ملي كلوريد الصوديوم في الماء المقطر وضبط درجة الحموضة إلى 9.0.
- إعداد حمض سيترات سكر العنب (أسد) عن طريق إذابة 85 ملي ثلاثي سيترات الصوديوم، 71 ملي حمض الستريك، و 111 ملي D- الجلوكوز في ديسالمياه الحارة.
- إعداد حل تثبيتي عن طريق إضافة 2٪ (الخامس / الخامس) بارافورمالدهيد (بفا) إلى العازلة هيبيس تيرود، ودرجة الحموضة 7.4. الحرارة إلى حل (50 - 70 درجة مئوية) وتعيين درجة الحموضة إلى 7.4. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- إعداد عازلة عازلة عن طريق إذابة 1٪ (م / ت) ألبومين المصل البشري (هسا) في هيبيس العازلة تيرود، ودرجة الحموضة 7.4
- جعل محلول كحول البولي فينيل بإضافة 4.8 غرام من الكحول البولي فينيل إلى 12 غرام من الجلسرين وتخلط جيدا. إضافة 12 مل من الماء المقطر وتركها على المدورة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- إضافة 24 مل من 0.2 M تريس-هكل، ودرجة الحموضة 8.5. الحرارة إلى 50 درجة مئوية في حين خلط لمدة 30 دقيقة. إضافة 1.25 غرام من 1.4-ديازابيسكلو [2.2.2] أوكتان (دابكو) وتخلط جيدا. أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5 دقائق. قسامة طاف (1 مل يكفي لمدة 15-20 الشرائح) وتخزينها في -20 درجة مئوية. استخدام أليكوتس مرة واحدة.
2. غطاء إعداد الزجاج
- إزالة الشحومنظارات (25 × 50 مم 2 ) عن طريق احتضان بين عشية وضحاها في حامض الكروموسولفوريك مخفف. شطف النظارات غطاء بالماء المقطر وتجفيفها بين عشية وضحاها في 60 درجة مئوية في الفرن.
- التمسك شريط من فيلم البارافين (10 × 15 سم 2 ) على رأس مقاعد البدلاء المختبر مع قطرة من الماء وإزالة الهواء عن طريق تمهيد فيلم البارافين. ماصة قطرات 80 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل فوف أو 100 ميكروغرام / مل الفيبرينوجين على فيلم البارافين. وضع النظارات على قطرات. سوف ينتشر حل البروتين بين السطوح لتغطية الجانب الخلفي كله من الزجاج. احتضان لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة (رت).
- إزالة فيلم البارافين ومنع نظارات الغطاء عن طريق وضعها، مع الجانب المغلفة حتى في لوحة 4-جيدا مع عرقلة العازلة. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. كعنصر تحكم، منع زجاج الغطاء الذي لم مغلفة مع فوف أو الفيبرينوجين.
3. إعداد البلازما الغنية بالصفائح الدموية (برب)
ملاحظة: بعد الطرد المركزي، ويمكن ملاحظة ثلاث طبقات (من أعلى إلى أسفل): برب، وخلايا الدم البيضاء، وخلايا الدم الحمراء. تأكد من عدم تضمين الخلايا البيضاء والحمراء. عادة، يمكن جمع 3 مل من برب بعد الطرد المركزي من أنبوب الدم 9 مل.
ملاحظة: عادة، 2 مل يمكن جمعها بعد هذه الخطوة الطرد المركزي الثانية.
ملاحظة: الحجم الكلي لل برب المخفف يعتمد على عدد الصفائح الدموية للمتبرع. وتختلف التعدادات الصفائحية اختلافا كبيرا بين المانحين، ويتطلب التخفيف من حدة الصفيحات تقييمها على أساس فردي. وتعتبر التعدادات الصفائح الدموية طبيعية في حدود 150،000 و 450،000 صفائح / ميكرولتر.
4. إعداد الصفائح الدموية غسلها
- تحديد متوسط حجم الصفائح الدموية (مبف) في برب باستخدام محلل الخلية.
ملاحظة: هذا هو مؤشر على الصفائح الدموية قبل تفعيل 11 . و مبف العادي لاستعادة الصفائح الدموية هو 7.5-11.5 فل 11 . يجب أن لا يزيد مبف بأكثر من 1.5 فل خلال إجراء الغسيل الصفائح الدموية. - إضافة 1/10 حجم أسد إلى برب لمنع الصفائح الدموية قبل تفعيل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 400 x ج و رت دون الفرامل. إزالة سو طاف وإعادة تعليق بيليه بعناية في هيبيس العازلة تيرود، ودرجة الحموضة 6.5، إلى حجم الأصلي من برب.
- ذوبان الجليد قسامة من بروستاسيكلين بإضافة تبس إلى تركيز 10 ميكروغرام / مل. يبقيه على الجليد.
- لمنع تفعيل الصفائح الدموية، إضافة بروستاسيكلين في تركيز النهائي من 10 نانوغرام / مل إلى الصفائح إعادة تعليق وعلى الفور الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 400 x ج و رت دون فرامل. إزالة طاف وإعادة تعليق بيليه بعناية في هيبيس العازلة تيرود، ودرجة الحموضة 7.4.
- عد عدد الصفائح الدموية (الخطوة 3.5) وتحديد التغيير في مبف (الخطوة 4.1) (مبف لا ينبغي أن تتغير أكثر من 1.5 فل).
- ضبط عدد الصفائح الدموية مع العازلة هيبيس تيرود، ودرجة الحموضة 7.4، إلى تركيز 150،000 الصفائح الدموية / ميكرولتر. ترك الصفائح الدموية لاسترداد لمدة 30 دقيقة في رت قبل التجارب. استخدام الصفائح الدموية غسلها للتجارب في غضون 4 ساعات بعد العزلة.
5. تدفق غرفة الجمعية
سس = "jove_content"> ملاحظة: هذه التجارب الاستفادة من غرفة تدفق المتقدمة في المنزل 12 . ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من غرف التدفق المنتجة تجاريا، طالما أنها يمكن أن تعقد غطاء الزجاج، والتي تفضيلي قابل للإزالة لمزيد من التحليلات. غرفة التدفق المستخدمة للتجارب وصفها مصنوع من بولي (ميثيل ميثاكريلات) لتتناسب بدقة المجهر إدراج المرحلة. أنه يحتوي على مدخل ومخرج ( الشكل 1A - C ، 1، 2)، وكذلك اتصال فراغ ( الشكل 1A و C ؛ 3). يتم وضع ورقة سيليكون مخصصة ( الشكل 1A و D ؛ 4) على القمة. اثنين من المقطعين شكل قنوات فراغ ( الشكل 1A و D ؛ 5) لإرفاق غطاء الزجاج ( الشكل 1A ؛ 6) بإحكام إلى الغرفة. وهناك أشكال قطع المركزي قناة تدفق ( الشكل 1A D ؛ 7؛ 2.0 مم العرض و 0.125 مم الارتفاع). يتم توصيل مدخل ومخرج لقناة التدفق، ويتم توصيل فراغ لقناة فراغ.
- تغطية الجزء العلوي من غرفة تدفق مع الماء المقطر ووضع ورقة سيليكون مخصصة مع الجانب السلس لأسفل على الماء. تعويم ورقة في الموقف عن طريق إزالة المياه الزائدة مع الحفاظ على ورقة في الموقف.
ملاحظة: هذا سيليكون ورقة هو re-- صالحة للاستعمال (سيليكون هو معروف لخصائص خاملة)؛ وعموما، لم يلاحظ الصفائح الدموية أن نعلق عليه. يمكن تنظيف الأوراق مع المنظفات وإعادة استخدامها حتى تصبح المواد تالفة ( أي تمزيق، وخاصة في المنطقة بين القنوات). عموما، يمكن استخدام ورقة لمدة 20 يوما مع تجارب متعددة في اليوم الواحد. - احتضان غرفة تدفق لمدة 1 ساعة عند 60 درجة مئوية لتتبخر المياه المتبقية لالتزام بقوة ورقة سيليكون إلى غرفة التدفق.
- مع ماصة باستور البلاستيك، إضافة قطرة منهيبيس العازلة تيرود، ودرجة الحموضة 7.4، على قناة التدفق. وضع غطاء الزجاج (انظر القسم 2) مع الجانب المغلفة أسفل، على قناة التدفق. إرفاق مضخة فراغ إلى اتصال فراغ ( أرقام 1A و C ؛ 3). تطبيق ~ 10 كيلو باسكال الضغط.
6. قبل تلطيخ الصفائح الدموية وإعداد الأجسام المضادة
- تلطيخ الصفائح الدموية
- احتضان الصفائح الدموية غسلها مع 10 ميكروغرام / مل دابي لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام. لغسل دابي غير منضم ومنع تفعيل الصفائح الدموية، إضافة بروستاسيكلين في تركيز النهائي من 10 نانوغرام / مل وعلى الفور الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 400 x ج و رت دون فرامل.
- إعادة بيليه الصفائح الدموية في هيبيس العازلة تيرود، ودرجة الحموضة 7.4، إلى تركيز الصفائح الدموية من 150،000 الصفائح الدموية / ميكرولتر.
- إعداد الأجسام المضادة
- مزيج البيوتين المسمى الأجسام المضادة مع اليكسا المسمى بكتيرياتافيدين في نسبة المولي من 1: 1. احتضان لمدة لا تقل عن 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام (الخطوة 7.6).
ملاحظة: بيوتين كفاءة وسم يمكن أن تختلف بين دفعات مختلفة. وينبغي أن يكون هناك مشاكل مع التصور من الجزيئات المستهدفة، وينبغي إجراء تجارب السيطرة لتأكيد بيوتينيلاتيون ناجحة، وكذلك خصائص ملزم الهدف من الأجسام المضادة البيروكسيديز محددة.
- مزيج البيوتين المسمى الأجسام المضادة مع اليكسا المسمى بكتيرياتافيدين في نسبة المولي من 1: 1. احتضان لمدة لا تقل عن 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام (الخطوة 7.6).
7. الإرواء
- بدء المجهر مضان، فضلا عن البرمجيات المجهر. استخدام إعدادات المجهر المدرجة في الجدول 1 .
ملاحظة: بدء المجهر وتسجيل إعدادات لتصور الخلية الحية وتسجيل الصفائح الدموية والأجسام المضادة المختارة فلورزنتلي المسمى و / أو الأصباغ عن طريق تحميل تجربة مناسبة في برنامج المجهر. إجراء تجارب تدفق في رت. - منع أنابيب مدخل عن طريق ربط حقنة 10 مل إلى الأنابيب و الشفط 1٪ هسا بلوكينغ العازلة في أنابيب مدخل. احتضان لمدة 15 دقيقة في رت. شطف أنابيب مدخل عن طريق الشفط هيبيس العازلة تيرود، ودرجة الحموضة 7.4، في أنابيب مدخل.
- ربط أنابيب مدخل المحظورة وأنابيب مخرج غير المعالجة، على حد سواء مع قطرها 1.02 مم وطول ~ 20-30 سم إلى مدخل ومخرج من الغرفة. ربط حقنة 10 مل (أو أقل حجم لمزيد من الدقة) إلى أنابيب منفذ. السلطة على مضخة حقنة.
ملاحظة: قطر الحقنة، في تركيبة مع معدل تدفق تعيين على المضخة، وتحديد معدل التدفق الحجمي. جنبا إلى جنب مع مساحة سطح قناة التدفق، ويمكن حساب معدل القص وفقا للصيغة 13 أدناه. وبالتالي، فمن الممكن لمعالجة معدل القص عن طريق تغيير معدل تدفق مضخة الحقنة أو تغيير أبعاد قناة التدفق. معدل القص من 800-1،600 ثانية -1 نماذج عادة لتدفق الدم الشرياني، في حين أن 25 - 100 S-1 نماذج للدم الوريديتدفق. لهذا الإعداد، معدل تدفق 7.5 ميكرولتر / دقيقة النتائج في معدل القص من 25 ثانية -1 .
معدل القص = 6Q / h 2 w في s -1
حيث: Q = معدل التدفق الحجمي (مل / s)، h = ارتفاع القناة (سم) (0.0125 سم، وهذا هو سمك ورقة سيليكون)، w = قناة العرض (سم) (0.2 سم في هذه الغرفة). - وضع قطرة من زيت الغمر على هدف 100X (مجموع التضخيم من 1000X) وتركيب الغرفة على المجهر مع سطح الزجاج إلى أسفل.
- وضع أنابيب مدخل إلى أنبوب يحتوي على العازلة هيبيس تيرود، ودرجة الحموضة 7.4. سحب يدويا المكبس من حقنة متصلة أنابيب مخرج وسحب الحل من خلال غرفة لإزالة الهواء من النظام. وضع حقنة في مضخة حقنة ( الشكل 1B و C ؛ 8) وتشغيل المضخة لفترة وجيزة لتشديد المكبس وضمان تدفق مستقر.
- إضافة الأجسام المضادة و / أو الأصباغ إلى تعليق الصفائح الدموية أو برب، بعنايةمزيج مع ماصة بلاستيكية، ونقل الخليط إلى أنبوب 1.5 مل.
ملاحظة: لنضح نموذجي 30 دقيقة في معدل القص 25 S-1 (7.5 ميكرولتر / دقيقة)، هناك حاجة إلى 225 ميكرولتر على الأقل من تعليق الصفائح الدموية. وترد في الجدول 2 الأجسام المضادة المستخدمة في النتائج التمثيلية. - نقل أنابيب مدخل، في حين الضغط، من العازلة هيبيس تيرود، ودرجة الحموضة 7.4، إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي إما برب أو الصفائح الدموية غسلها والأجسام المضادة و / أو الأصباغ ( الشكل 1B و C ؛ 9).
ملاحظة: من المهم أن، عند نقل الأنبوب، وتقلص الأنابيب (الضغط خارج الهواء) لمنع الهواء من دخول الأنابيب. فمن الممكن لعلاج الصفائح الدموية الملتصقة مع مجموعة متنوعة من الكواشف في خطوة لاحقة عن طريق تحريك أنابيب مدخل إلى أنبوب آخر بطريقة مماثلة. وترد في الجدول 3 قائمة بالكواشف المفيدة المحتملة. - حدد "فيسواليزاتيو الحيةn "في البرنامج، ركز المجهر على سطح غطاء الزجاج المطلي، وبدء المضخة بمعدل قص 1،600 ثانية -1 (484 ميكرولتر / دقيقة) حتى تصل الصفائح الدموية إلى غرفة التدفق، وفي هذه اللحظة، تقليل معدل القص مرة أخرى إلى 25 s-1 عن طريق تغيير إعدادات مضخة حقنة إلى معدل تدفق 7.5 ميكرولتر / دقيقة.
- مراقبة سطح الجانب المغلفة من غطاء الزجاج، والانتظار حتى يبدأ الصفائح الدموية الأولى على الانضمام، والتركيز المجهر على هذه الصفائح الدموية، وبدء التسجيل عن طريق الشروع في التجربة في البرنامج. انظر الجدول 1 للتعرف على إعدادات التسجيل المستخدمة هنا.
- اتبع التسجيل المباشر بصريا. بعد 30 دقيقة، ووقف مضخة حقنة.
ملاحظة: تأكد من أن الصفائح الدموية البقاء في التركيز خلال مسار التجربة. عادة، 20-30 الصفائح الدموية تعلق في مجال الرؤية في التكبير من 1000X. وهذا هو حوالي 2،000-3،000 الصفائح الدموية في قناة التدفق كله. - التثبيت باستخدامغرفة التدفق (اختياري).
- عندما توقف تدفق بعد توقف مضخة حقنة، نقل أنابيب مدخل (الهواء-- مجانا) إلى الحل تثبيتي. إعادة تشغيل المضخة وتدفق العازلة التثبيت من خلال القناة لمدة لا تقل عن 10 دقيقة في نفس معدل التدفق كما ذكر في الخطوة 7.8.
- إزالة غرفة من المجهر، وتنظيف النفط الغمر من الزجاج، وقطع الفراغ، وإزالة بعناية الزجاج غطاء من الغرفة مع إبرة 18 G.
ملاحظة: منع الزجاج غطاء من كسر وإلحاق ورقة السيليكون. - وضع الشريحة غطاء (مع الخلايا الموجهة صعودا) في لوحة 4-جيدا على رأس الأنسجة، قبل رطب بالماء المقطر.
ملاحظة: هذا يمنع الزجاج الغطاء من التمسك سطح البئر ويمنع التجفيف. - ماصة 750 ميكرولتر من الحل تثبيتي على رأس الزجاج الغطاء واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. في حالة لا يمكن تحليل العينات مباشرة،تخزينها في 0.5٪ بفا (المخفف من قبل هيبيس تيرود العازلة، ودرجة الحموضة 7.4) في 4 درجات مئوية لضمان تثبيت مستقرة. انتقل إلى القسم 8 لمعالجة الزجاج غطاء للتصوير.
- بعد الاستخدام، شطف الغرفة، أنابيب، ورقة مع الماء المقطر واحتضان بين عشية وضحاها في محلول المنظفات. قبل إعادة استخدام الغرفة وغيرها من المكونات، وشطف بالماء المقطر.
- حفظ المجهر ملفات البيانات الخام التي تحتوي على كافة البيانات الوصفية. عند الحاجة، تصدير الأفلام إلى. موف، h.264 مضغوط، أو. أفي غير مضغوط. حفظ إطارات منفصلة كملفات جبيغ أو تيف.
8. إعداد عينة لالمضاد المجهري متحد البؤر
- نقل النظارات غطاء إلى لوحات جديدة 4 جيدا وشطف 5 مرات مع 3 مل من العازلة هيبيس تيرود، ودرجة الحموضة 7.4. إضافة 3 مل / بئر من عرقلة الحاضنة واحتضان لمدة 1 ساعة في رت.
- إزالة المخزن المؤقت حظر؛ إضافة 3 مل / جيدا من 0.15٪ الجلايسين (M / V) في هيبيس العازلة تيرود، ودرجة الحموضة 7.4. واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT.
- إزالة محلول الجلايسين وغسل 5 مرات في 3 مل / جيدا من عرقلة العازلة. اختياريا، إضافة فلورفور مترافق الأجسام المضادة المخفف في عرقلة العازلة لالتلطيخ إضافية. احتضان لمدة 1 ساعة في رت في الظلام.
- يغسل 5 مرات مع عرقلة عازلة و 2 مرات مع الماء المقطر. تجفيف الزجاج عن طريق إزالة السائل الزائد مع الأنسجة (من حواف الداخل)، دون لمس الخلايا.
- ماصة 60 ميكرولتر من محلول الكحول البولي فينيل على شريحة المجهر. وضع الزجاج غطاء، مع الخلايا أسفل، على رأس من قطرة والسماح للكحول البولي فينيل تنتشر بين السطوح اثنين. احتضان بين عشية وضحاها في رت في الظلام.
- تحليل الخلايا التي المجهر متحد البؤر 14 .
- حفظ ملفات البيانات الخام من البيانات المكدس المسجلة التي تحتوي على كافة البيانات الوصفية. عند الحاجة، معالجة ملفات البيانات الخام في موف، h.264 مضغوط، أو .AVI الملفات غير المضغوطة. حفظ مكدسات منفصلة كملفات جبيغ أو تيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 صور غرفة تدفق والإعداد التجريبي. موقف وأبعاد ورقة السيليكون. و وصلات الأنابيب. الشكل 2 يوفر تفاصيل عن أبعاد غرفة التدفق. الشكل 3 والفيلم 1 تظهر سلسلة زمنية من الصور من التصاق الصفائح الدموية ونشر على فوف يجمد. CD63 هو بروتين الغشاء الذي يتم إدراجه في غشاء حبيبات كثيفة داخل الخلايا من الصفائح الدموية يستريح 15 . وتظهر التعبئة التي تعتمد على الوقت على سطح الصفائح الدموية باللون الأخضر. وبالمثل، P- سيليكتين (بسل) هو بروتين الغشاء إدراجها في غشاء من حبيبات α داخل الخلايا من الصفائح الدموية يستريح. وتظهر التعبئة التي تعتمد على الوقت على سطح الصفائح الدموية باللون البرتقالي. ويبين الشكل 3B صورة تمثيلية في زاوية 45 درجة، التي حصل عليها المجهر متحد البؤر مضان بعد تجربة التدفق. الفيلم 2 يظهر سلسلة الميل من نفس التجربة. لاحظ أن CD63 يقع أساسا في غرانولومير المركزية، في حين يتم توزيع P- سيليكتين على كامل الجسم الخلية ويظهر تتركز على الحواف. الشكل 4A والفيلم 3 تظهر تعبئة تعتمد على الوقت من CD63 على سطح الصفائح الدموية (الأخضر). في هذه التجارب، تم تحضين الصفائح الدموية (التي لا تحتوي على دنا نووي) مسبقا مع دابي (الأزرق)، الذي البقع متعدد الفوسفات في حبيبات كثيفة 16 . لافت للنظر، على الرغم من علامات واضحة على الإفراج الحبيبية كثيفة (يظهر تحليل خلية واحدة في الشكل 4B والفيلم 4 )، يتم الاحتفاظ بوليفوسفات داخل أو خارج هذه الصفائح الدموية. ويبين الشكل 5 والفيلم 5 تعبئة تعتمد على الوقت (أو التوظيف) من فوف، متعددة مولدة للجلطاتالبروتين إيمريك 17 المخزنة في α- حبيبات، إلى سطح الصفائح الدموية (الأخضر). على غرار الفوسفات، يبقى فوف يرتبط مع سطح الصفائح الدموية المنشط.
الشكل 1: غرفة التدفق والإعداد التجريبي. ( A ) صورة من تصميم غرفة التدفق مع مدخل ومخرج (1 و 2)، اتصال فراغ (3) التي يتم وضع ورقة السيليكون (4). اثنين القواطع الخارجية (5) في ورقة السيليكون شكل قنوات فراغ لإرفاق غطاء الزجاج (6). انقطاع المركزي (7) يشكل قناة تدفق ( B ) صورة من الإعداد التجريبي. مدخل ومخرج (1 و 2)، مضخة حقنة (8)، وحامل العينة (9). ( C ) نظرة عامة التخطيطي من الإعداد التجريبية. والأرقام متطابقة لتلك الموجودة في A و B. ( D ) نظرة عامة التخطيطي مع البعد من ورقة سيليكون قطع مخصصة. ( E ) نظرة عامة التخطيطي من بولي (الميثيل ميثاكريلات) غرفة التدفق . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط مفصل من غرفة التدفق. تتكون غرفة التدفق من كتلة بولي (ميثيل ميثاكريلات) (1) ، وإدراج بوليوكسيمثيلين واحد على التوالي لمدخل فراغ (2) ، واثنين من إدراج بوليكسيمثيلين الزاوية لعينة مدخل ومخرج (3) . إدراج بوليكسيمثيلين الزاوية تحتوي على أنابيب معدنية الشعرية، بأقطار 1.07 ملم. يحتوي الإدراج المستقيم على أنبوب شعري يبلغ قطره 1.3 مم. 658 / 55658fig2large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نشر الصفائح الدموية و ديغرانولاتيون على يجمد فون ويلبراند عامل. ( A ) تعبئة تعتمد على الوقت من CD63 و P- سيلكتين على سطح انتشار والصفائح الدموية تحبيب. شريط مقياس أبيض (أعلى اليسار) يشير إلى 10 ميكرون. ( B ) ممثل متحد البؤر مضان صورة المجهر في زاوية 45 درجة. شريط مقياس أبيض (أسفل اليسار) يشير إلى 2 ميكرون. الأخضر، CD63؛ أورانج، P-سيلكتين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
55658 / 55658fig4.jpg "/>
الشكل 4: انتشار الصفائح الدموية، التحبيب، والتنقل من حبيبات كثيفة على الفبرينوجين يجمد. ( A ) تعبئة تعتمد على الوقت من CD63 والبولي فوسفات على سطح الصفائح الدموية. شريط مقياس أبيض (أعلى اليسار) يشير إلى 10 ميكرون. ( B ) سلسلة زمنية من الصفائح الدموية واحدة (ر = 0 يمثل التصاق الأول إلى السطح). شريط مقياس أبيض (أسفل اليمين) يشير إلى 2 ميكرون. الأخضر، CD63؛ الأزرق، دابي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: رابطة سطح فون ويلبراند عامل على سطح الصفائح الدموية من الفبرينوجين يجمد. تعبئة (أو توظيف) تعتمد على الوقت من فوف إلى سطح الصفائح الدموية. تيوقال انه شريط مقياس أبيض (أعلى اليسار) يشير إلى 5 ميكرون. الأخضر، فوف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| ضبط | القيمة |
| وقت التعرض فيتس (Alexa488) | 200 مللي ثانية / 300 مللي ثانية |
| ليد 488 كثافة فيتس (Alexa488) | 50٪ |
| وقت التعرض مدينة دبي للإنترنت | 30 مللي ثانية |
| الجهد مصباح الهالوجين | 4.5 فولت |
| وقت التعرض تريتك (اليكسا 546) | 400 مللي ثانية |
| ليد 555 كثافة فيتس (Alexa546) | 50٪ |
| وقت التعرض دابي | 500 مللي ثانية |
| ليد 365 كثافة | 50٪ |
| فيلترسيت فيتس | فيلترسيت 10 |
| فيلترسيت تريتك | فيلترسيت 20 |
| فيلترسيت دابي | فيلترسيت 01 |
| موضوعي | ألفا بلان فلوار 100x / 1.45 النفط |
| معدل الإطار، وقت التسجيل | 1 إطار / 10 ثانية، 30 دقيقة |
| أفلام ضغط الملفات | موف (h.264)، أفي (غير مضغوط) |
| صور ضغط الملف | جبيغ، تيف |
الجدول 1: إعدادات المجهر. الإعدادات المستخدمة للتجارب التمثيلية.
| استهداف | الأجسام المضادة / صبغ | تركيز |
| CD63 | <تد> أنتي-CD63-بيوتين *)325 نغ / مل | |
| ف selectin | مكافحة CD62P البيوتين **) | 90 نغ / مل |
| الحمض النووي | دابي | 10 ميكروغرام / مل |
| VWF | مكافحة الإنسان VWF- فيتس | 5 ميكروغرام / مل |
| *) يتم خلط الأجسام المضادة لمكافحة CD63 البيوتين مع ستريبتافيدين-Alexa488 في نسبة المولي من 1: 1 قبل الاستخدام | ||
| **) يتم خلط المضادة CD62P البيوتين الأجسام المضادة مع ستريبتافيدين-Alexa546 في نسبة المولي من 1: 1 قبل الاستخدام | ||
الجدول 2: الأجسام المضادة والأصباغ. الأجسام المضادة الموصى بها وتركيزات صبغ للتجارب ممثل أظهرت.
| فئة الكاشف | مثال كومبوجهاز الأمم المتحدة الإنمائي |
| منبهات الصفائح الدموية | الثرومبين، أدب، بار-1 أو -4 تنشيط الببتيدات، U46619، ثرومبوكسان A2، أدب |
| مثبطات الإنزيم | هيرودين، باك، الهيبارينويد (غير مباشر)، مثبطات التربسين الذرة، فول الصويا المانع التربسين |
| مضادات المستقبلات | مكافحة غليبروتين 1bα، مكافحة بروتين سكري السادس؛ كلوبيدوغريل، (دوري) الببتيدات التي تحتوي على رغد |
| مثبطات التنشيط | الأسبرين المعالجة، التثبيت |
الجدول 3: الكواشف المفيدة المحتملة.
الأفلام التكميلية: الفيلم 1: سلسلة زمنية من الصور من الصفائح الدموية (انظر الشكل 1 )، فيلم 2: إمالة سلسلة من الشكل 3B ، فيلم 3: تعتمد على الوقت من CD63 على الصفائح الدموية(انظر الشكل 4 )، فيلم 4: سلسلة زمنية من تحليلات خلية واحدة (انظر الشكل 4B )، فيلم 5: تعبئة تعتمد على الوقت من فوف (انظر الشكل 5 ).
الرجاء انقر هنا لتحميل فيلم 1.
الرجاء انقر هنا لتحميل فيلم 2.
الرجاء انقر هنا لتحميل فيلم 3.
الرجاء انقر هنا لتحميل فيلم 4.
الرجاء انقر هنا لتحميل فيلم 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في جميع أنحاء العالم، والتجلط هو السبب الرئيسي للوفاة والمراضة، والصفائح الدموية تلعب دورا محوريا في تطورها. يصف هذا العمل طريقة للتصوير الخلية الحية من التحبيب الصفائح الدموية تحت التدفق. ويفترض عموما أنه عندما يتم تنشيط الصفائح الدموية، يتم تحرير جميع محتويات الحبيبية مباشرة في الحل. وتشير النتائج المصاحبة إلى أن هذا ليس هو الحال بالضرورة. خلال التصاق و التحبيب، الصفائح الدموية تحتفظ كمية كبيرة من متعدد الفوسفات ( الشكل 4 ). بالإضافة إلى ذلك، ويرتبط البروتين مولتيمريك فوف مع سطح الصفائح الدموية بعد التحبيب ( الشكل 5 ). وهذا يدل على أن الآليات الجزيئية التي تتحكم في التحبيب حبيبات الصفائح الدموية هي أقل سطوعا من المفترض عموما.
لتمكين التصوير الخلية الحية من التحبيب الصفائح الدموية تحت التدفق، تم اختيار الظروف التجريبية للحفاظ على تراكم الصفائح الدموية إلى أدنى حد ممكن. الصفائح الدمويةتم استخدام تيسي من 150،000 الصفائح الدموية / ميكرولتر. هذا هو في الطرف الأدنى من المعدل الطبيعي (150،000-450،000 الصفائح الدموية / ميكرولتر). وعلاوة على ذلك، تم دراسة التصاق الصفائح الدموية ونشرها على فوف أو الفيبرينوجين، الذي أدى إلى تفعيل صفائح خفيفة (على النقيض من، على سبيل المثال، الكولاجين). في الدراسات مع الصفائح الدموية غسلها، وزيادة معدلات القص نقل هذه الخلايا إلى مركز التدفق. وهذا يتعارض مع التصاق وانتشار لاحق ويضاعف التحقيق في التحبيب.
في الارقاء الفسيولوجية، الهامش الصفائح الدموية هو المهم. وتتحرك هذه العملية من قبل كرات الدم الحمراء، وشرح لماذا يرافق انخفاض فقر الدم في بعض الأحيان من قبل أهبة النزيف. الحد من التقنية المعروضة هو أن التصور من التحبيب الصفائح الدموية (مع المواد المقدمة والكواشف) هو بالانزعاج من خلايا الدم الحمراء. تتأثر وظيفة الصفائح الدموية عن طريق إجهاد القص، الذي هو وظيفة من اللزوجة من السائل (μ)، وكذلكمن معدل القص. وبالتالي، فمن المستحسن لدراسة وظيفة الصفائح الدموية في نماذج التدفق في حلول مع اللزوجة مماثلة ( أي الصفائح الدموية غسلها، الدم المعاد تشكيله، برب، أو الدم الكامل).
هناك عدة عوامل عملية تأخذ بعين الاعتبار عند إجراء هذه التجارب. أولا، تتأثر إشارات مضان بقوة من منطقة التركيز. إذا المجهر ليس في التركيز، إشارة غير واضحة بسهولة أو حتى فقدت. قبل وصول الصفائح الدموية في قناة التدفق، فمن الأفضل للتركيز على القناة نفسها (تبدأ على حافة ورقة السيليكون / قناة قناة التدفق). عندما تبدأ الصفائح الدموية في الانضمام، والتركيز على هذا الحدث التصاق. النقطة الثانية المثيرة للقلق هي تبييض فلوروفوريس معينة (على سبيل المثال، فيتس). سوف الإثارة المتكررة يؤدي إلى فقدان إشارة، مما يزعج التحقيق. هذه العقبات يمكن التغلب عليها باستخدام فلوروفوريس أكثر استقرارا، والحد من شدة الضوء ليد مثيرة، وتقصير إكسو / أو خفض معدل الإطار.
النموذج الموصوف هنا مفيد جدا لأداء دراسة مفصلة لاستجابات الصفائح الدموية لمجموعة واسعة من البروتينات يجمد وفي معدلات تدفق مختلفة. من المحتمل، ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لدراسة تفاعلهم مع الخلايا البطانية تنشيط 18 . وتتيح التطورات التقنية التي تتيح التصاميم المرنة لغرف التدفق الخاصة حاليا سبلا لدراسات التوافق البيولوجي 19 . والتصوير الخلية الحية من التفاعل الصفائح الدموية تحت تدفق تكشف عن رؤى قيمة حول تعقيد استجابة التصاق الصفائح الدموية. في نهاية المطاف، ينبغي أن تؤدي هذه التجارب إلى نماذج تدفق التجريبية التجريبية التي تسمح للتحقيق المشترك لوظيفة الصفائح الدموية والتأثير على نظام التخثر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
(سم) تعترف بالدعم المالي المقدم من المنظمة الدولية للمرضى لنواقص المانع C1 (هاي) و ستيكتينغ فريندن فان هيت ومك أوترشت ومؤسسة لاندستينر لأبحاث نقل الدم (لسبر).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
