Summary
Dette værk beskriver en fluorescensmikroskopi-baseret metode til undersøgelse af trombocytadhæsion, spredning og sekretion under strømning. Denne alsidige platform muliggør undersøgelse af trombocytfunktion til mekanisk undersøgelse af trombose og hæmostase.
Abstract
Blodplader er vigtige spillere i hæmostase, dannelsen af trombier for at forsegle vaskulære brud. De er også involveret i trombose, dannelsen af trombier, der fører til vaskulaturen og skadelige organer med livstruende konsekvenser. Dette motiverer videnskabelig forskning om trombocytfunktion og udvikling af metoder til at spore cellebiologiske processer, som de forekommer under strømningsbetingelser.
En række strømningsmodeller er tilgængelige til undersøgelse af trombocytadhæsion og aggregering, to nøglefænomener i blodpladebiologi. Dette værk beskriver en metode til at studere realtids blodplade-degranulation under flow under aktivering. Metoden gør brug af et flowkammer koblet til en sprøjtepumpeopsætning, der er placeret under et bredt felt, inverteret LED-baseret fluorescensmikroskop. Opstillingen beskrevet her muliggør samtidig excitation af flere fluoroforer, der leveres af fluorescensmærkede antistoffer eller fluorescensEnt farvestoffer. Efter levende celledannelsesforsøg kan dækglasene behandles yderligere og analyseres ved hjælp af statisk mikroskopi ( dvs. konfokal mikroskopi eller scanningselektronmikroskopi).
Introduction
Blodplader er anukleatceller, som cirkulerer i blodstrømmen. Deres vigtigste funktion er at forsegle vaskulære brud på steder for skade og for at forhindre blodtab. På disse steder af skade bliver subendotelcollagenfibre eksponeret og bliver derefter dækket af det multimere protein, von Willebrand-faktor (VWF). VWF interagerer med blodpladerne i omløb i en mekanisme, der afhænger af glycoprotein Ibα-IX-V-komplekset på celleoverfladen 1 , hvilket nedsætter blodpladernes hastighed. Dette er især vigtigt ved høje forskydninger. Blodpladerne undergår efterfølgende morfologiske ændringer under modtagelse af aktiverende impulser fra collagen. Dette fører til irreversibel spredning og til sidst til blodpladeaggregering. Begge processer afhænger af udskillelsen af granulindholdet for at lette trombocyt-blodplade-blodkroget. Bl.a. indeholder blodplade-a-granuler fibrinogen og VWF for at hjælpe blodpladeadhæsion og broBlodplader sammen på en integrinafhængig måde. De blodpladetætte granuler indeholder uorganiske forbindelser 2 , herunder calcium og adenosindiphosphat (ADP), som hjælper til at forstærke blodpladeaktivering. Desuden indeholder blodplader mediatorer af (allergisk) inflammation 3 , komplementstyrende proteiner 4 og angiogenesefaktorer 5 , 6 , der rejser spørgsmålene om, hvorvidt og hvordan disse indhold forskelligt frigives under forskellige betingelser.
Siden 1980'erne har undersøgelsen af blodpladefunktion i flowmodeller været værdifuld for undersøgelsen af trombotiske mekanismer 7 . Siden da er der sket meget teknisk fremgang, og flowmodeller, der indbefatter fibrindannelse, udvikles for øjeblikket til at analysere det hæmostatiske potentiale af terapeutiske blodpladekoncentrater ex vivo 8 eller tilUndersøg indflydelsen af forstyrrelser i forskydningshastigheder på trombusmorfologi 9 . Forskellene i de molekylære og cellebiologiske mekanismer, der kører stabil vedhæftning og fysiologisk tromb dannelse (hæmostase) i forhold til patologisk trombusdannelse (trombose) kan være meget subtile og motivere udviklingen af flowmodeller, der muliggør real-time visualisering af disse subcellulære processer.
Et eksempel på en proces, for hvilken en sådan opsætning ville være værdifuld, er (re) fordeling af intracellulært polyphosphat og rekruttering af koagulationsfaktorer for at afdække den tidsafhængige virkning, som dette har på fibrin-ultrastruktur 10 . Undersøgelser er ofte begrænset til slutpunktsanalyser. Hovedformålet med den beskrevne metode er at muliggøre den realtidsvisuelle undersøgelse af dynamiske subcellulære processer, der finder sted under blodpladeaktivering under strømning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det Lokale Medicinske Etiske Udvalg ved Universitetsmedicinsk Center Utrecht godkendte tegningen af blod til ex vivo forskningsformål, herunder undersøgelserne.
1. Løsning Præparat
- Forbered en 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) Tyrodes buffer ved at opløse 10 mM HEPES, 0,5 mM Na2 HPO4, 145 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgSO4 og 5,55 mM D- Glucose i destilleret vand.
- Lav to varianter af bufferen: Indstil pH-niveauerne ved 6,5 og henholdsvis 7,4. Lav frisk buffer for hver forsøgsdag. Supplement med 10 ng / ml prostacyclin, hvor det er angivet.
- Forbered TRIS-pufret saltvand (TBS) ved at opløse 50 mM Tris og 150 mM NaCI i destilleret vand og juster pH til 9,0.
- Forbered syrecitratdextrose (ACD) ved at opløse 85 mM tri-natriumcitrat, 71 mM citronsyre og 111 mM D-glucose i disKaklat vand.
- Forbered en fixativ opløsning ved at tilføje 2% (v / v) paraformaldehyd (PFA) til HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4. Varme til opløsning (50 - 70 ° C) og indstilling af pH til 7,4. Aliquot og opbevar ved -20 ° C. Optøbe ved 37 ° C før brug.
- Forbered blokerende buffer ved at opløse 1% (m / v) humant serumalbumin (HSA) i HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4
- Lav en polyvinylalkoholopløsning ved at tilsætte 4,8 g polyvinylalkohol til 12 g glycerol og bland godt. Tilsæt 12 ml destilleret vand og lad det stå på en rotator ved stuetemperatur natten over.
- Tilsæt 24 ml 0,2 M Tris-HCL, pH 8,5. Varm til 50 ° C under blanding i 30 minutter. Tilsæt 1,25 g 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octan (DABCO) og bland godt. Centrifuge ved 1500 xg i 5 minutter. Aliquot supernatanten (1 ml er tilstrækkelig til 15-20 dias) og opbevares ved -20 ° C. Brug alikvoterne en gang.
2. Cover Glass Preparation
- Affedt omslagBriller (25 x 50 mm 2 ) ved inkubering natten over i ufortyndet chromosvovlsyre. Skyl afdækningsbrillerne med destilleret vand og tør dem natten over ved 60 ° C i en ovn.
- Anbring en strimmel af en paraffinfilm (10 x 15 cm 2 ) oven på en laboratoriebænk med en dråbe vand og fjern luften ved at udjævne paraffinfilmen. Pipette 80 μl dråber 10 μg / ml VWF eller 100 μg / ml fibrinogen på paraffinfilmen. Placer brillerne på dråberne; Proteinopløsningen spredes mellem de to overflader for at dække hele bagsiden af glasset. Inkubér i 1,5 timer ved stuetemperatur (RT).
- Fjern paraffinfilmen og bloker afdækningsbrillerne ved at placere dem med den belagte side op i en 4-brønds plade med blokeringsbuffer. Inkubér i 1 time ved 37 ° C eller natten over ved 4 ° C. Som kontrol skal du blokere et dækglas, der ikke er belagt med VWF eller fibrinogen.
3. Fremstilling af blodplade-rige plasma (PRP)
BEMÆRK: Efter centrifugering kan der observeres tre lag (fra top til bund): PRP, hvide blodlegemer og røde blodlegemer. Sørg for ikke at medtage de hvide og røde celler. Typisk kan 3 ml PRP opsamles efter centrifugering af et 9 ml blodrør.
BEMÆRK: 2 ml kan typisk opsamles efter dette andet centrifugeringstrin.
BEMÆRK: Det samlede volumen fortyndet PRP afhænger af blodpladeantalet af donoren. Antallet af blodplade varierer meget mellem donorer, og PRP-fortynding kræver vurdering på individuel basis. Trombocytællinger betragtes som normale, når de er inden for 150.000 og 450.000 blodplader / μl.
4. Fremstilling af vaskede blodplader
- Bestem det gennemsnitlige blodpladevolumen (MPV) i PRP ved hjælp af en celleanalysator.
BEMÆRK: Dette er en indikator for blodpladeforaktivering 11 . En normal MPV til hvileplader er 7,5-11,5 fL 11 . MPV'en bør ikke stige med mere end 1,5 fL under blodpladevaskeproceduren. - Tilsæt et 1/10 volumen ACD til PRP for at forhindre blodpladeforaktivering og centrifuge i 15 minutter ved 400 xg og RT uden bremse. Fjern suPernatant og suspender pelleten omhyggeligt i HEPES Tyrode's buffer, pH 6,5, til det oprindelige volumen PRP.
- Optø en alikvot af prostacyclin ved at tilsætte TBS til en koncentration på 10 μg / ml; Hold det på is.
- For at forhindre trombocytaktivering tilsættes prostacyclin i en slutkoncentration på 10 ng / ml til de genopslæmmede blodplader og øjeblikkeligt centrifuger i 15 minutter ved 400 xg og RT uden bremse. Fjern supernatanten og genopsæt pelleten forsigtigt i HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4.
- Tæl antallet af blodplader (trin 3.5) og bestem ændringerne i MPV (trin 4.1) (MPV'en bør ikke ændre mere end 1,5 fL).
- Juster antallet af blodplader med HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, til en koncentration på 150.000 blodplader / μl. Lad blodpladerne genoprette i 30 minutter ved RT før eksperimenterne. Brug vaskede blodplader til forsøg inden for 4 timer efter isolering.
5. Sammensætning af flowkammer
12 . En række kommercielt producerede strømningskamre kan anvendes, så længe de kan holde et dækglas, som fortrinsvis er aftageligt til yderligere analyser. Flowkammeret, der anvendes til de beskrevne eksperimenter, er fremstillet af poly (methylmethacrylat) for præcist at passe et mikroskopindsatsstrin. Den indeholder et indløb og udløb ( Figur 1A - C ; 1, 2) samt en vakuumforbindelse ( Figur 1A og C ; 3). Et tilpasset silikoneark ( figur 1A og D ; 4) er anbragt på toppen. To udskæringer danner vakuumkanaler ( Figur 1A og D ; 5) for at fastgøre dæksglaset ( Figur 1A ; 6) tæt på kammeret. En central udskæring danner strømningskanalen ( figur 1A D ; 7; 2,0 mm bredde og 0,125 mm højde). Indløbet og udløbet er forbundet til strømningskanalen, og vakuumet er forbundet med vakuumkanalen.
- Dæk toppen af flowkammeret med destilleret vand og læg det tilpassede silikoneark med den glatte side ned på vandet. Flyd arket på plads ved at fjerne overskydende vand, mens arket holdes på plads.
BEMÆRK: Dette silikoneark er genbrugeligt (silikone er kendt for sine inerte egenskaber); Generelt er blodplader ikke blevet observeret at vedhæfte det. Arkene kan rengøres med rengøringsmiddel og genanvendes, indtil materialet bliver beskadiget ( dvs. rive, især i området mellem kanalerne). Generelt kan et ark anvendes i 20 dage med flere eksperimenter pr. Dag. - Inkuber strømningskammeret i 1 time ved 60 ° C for at fordampe det resterende vand for at klæbe siliconarket fast til strømningskammeret.
- Med en plastisk Pasteur pipette skal du tilføje en dråbeHEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, på strømningskanalen. Placer afdækglaset (se afsnit 2) med den belagte side nedad på strømningskanalen. Fastgør vakuumpumpen til vakuumforbindelsen ( figur 1A og C ; 3). Påfør ~ 10 kPa tryk.
6. Forfarvning af blodpladerne og fremstilling af antistofferne
- Blodpladefarvning
- Inkuber de vaskede blodplader med 10 μg / ml DAPI i 30 minutter ved 37 ° C i mørke. For at vaske væk ubundet DAPI og for at forhindre blodpladeaktivering, tilsættes prostacyclin i en slutkoncentration på 10 ng / ml og centrifuger øjeblikkeligt i 15 minutter ved 400 xg og RT uden bremse.
- Rekonstituer blodpladepellet i HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, til en blodpladekoncentration på 150.000 blodplader / μl.
- Fremstilling af antistoffer
- Bland biotin-mærket antistof med Alexa-mærket strepTavidin ved et molforhold på 1: 1. Inkuber i mindst 10 minutter ved stuetemperatur før brug (trin 7.6).
BEMÆRK: Biotinmærkningseffektivitet kan variere mellem forskellige batcher. Skulle der være problemer med visualisering af målmolekyler, bør kontrolforsøg udføres for at bekræfte vellykket biotinylering såvel som målbindende egenskaber for det specifikke biotinylerede antistof.
- Bland biotin-mærket antistof med Alexa-mærket strepTavidin ved et molforhold på 1: 1. Inkuber i mindst 10 minutter ved stuetemperatur før brug (trin 7.6).
7. Perfusion
- Start fluorescensmikroskopet, såvel som mikroskopprogrammet. Brug mikroskopindstillingerne, der er angivet i tabel 1 .
BEMÆRK: Start mikroskop- og optageindstillingerne til live-celle visualisering og optagelse af blodpladerne og de valgte fluorescensmærkede antistoffer og / eller farvestoffer ved at indlæse et passende eksperiment i mikroskopprogrammet. Udfør flowforsøg ved RT. - Bloker indløbsslangen ved at forbinde en 10 ml sprøjte til slangen og aspirere 1% HSA blomstCking buffer i indløbsslangen. Inkubér i 15 minutter ved stuetemperatur. Skyl indløbsslangen ved at aspirere HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, ind i indløbsslangen.
- Tilslut det blokerede indløbsrør og det ubehandlede udløbsslange, både med en diameter på 1,02 mm og en længde på ~ 20-30 cm til indløb og udløb af kammeret. Tilslut en 10 ml sprøjte (eller lavere volumen for mere nøjagtighed) til udløbsslangen. Tænd for sprøjtepumpen.
BEMÆRK: Sprøjtens diameter, i kombination med strømningshastigheden indstillet på pumpen, bestemmer den volumetriske strømningshastighed. Sammen med overfladen af strømningskanalen kan forskydningsraten beregnes ifølge formlen 13 under. Derfor er det muligt at manipulere forskydningshastigheden ved at ændre strømningshastigheden af sprøjtepumpen eller ændre dimensionen af strømningskanalen. En forskydningshastighed på 800-1,600 s -1 typisk modeller for arteriel blodgennemstrømning, mens 25-100 s-1 modeller for venøst blodflyde. Til denne opsætning resulterer en strømningshastighed på 7,5 μl / min i en forskydningshastighed på 25 s -1 .
Skærehastighed = 6Q / h 2 w i s -1
Hvor: Q = volumenstrømningshastighed (ml / s), h = højdekanal (cm) (0,0125 cm, dette er tykkelsen af silikonepladen), w = breddekanal (cm) (0,2 cm i dette kammer). - Anbring en dråbe neddypningsolie på et 100X objektiv (total forstærkning på 1.000X) og monter kammeret på mikroskopet med glasfladen nedad.
- Anbring indløbsslangen i et rør indeholdende HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4. Manuelt trækker stempelet på sprøjten, der er forbundet til udløbsslangen, og træk opløsningen gennem kammeret for at fjerne luften fra systemet. Placer sprøjten i sprøjtepumpen ( Figur 1B og C ; 8) og kør pumpen kort for at stramme stemplet og sikre stabil strømning.
- Tilsæt antistoffer og / eller farvestoffer til blodpladesuspensionen eller PRP forsigtigtBlandes med en plastpipette, og overfør blandingen til et 1,5 ml rør.
BEMÆRK: For en typisk 30 minutters perfusion ved forskydningshastighed 25 s-1 (7,5 μl / min) er der behov for mindst 225 μl blodpladesuspension. Antistofferne anvendt til de repræsentative resultater er vist i tabel 2 . - Flyt indløbsslangen, mens du klemmer, fra HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4, til et 1,5 ml rør, der indeholder enten PRP eller de vaskede blodplader og antistofferne og / eller farvestofferne ( Figur 1B og C ; 9).
BEMÆRK: Det er vigtigt, at rørene, når de overføres, slibes (tryk luften ud) for at forhindre luft i at komme ind i slangen. Det er muligt at behandle vedhængende blodplader med en række reagenser i et efterfølgende trin ved at flytte indløbsslangen til et andet rør på en lignende måde. En liste over potentielt nyttige reagenser er angivet i tabel 3 . - Vælg "live visualizatioN "i softwaren, fokusér mikroskopet på overfladen af det coatede dækglas og start pumpen med en forskydningshastighed på 1.600 s-1 (484 μL / min) indtil blodpladerne når strømningskammeret. Reducer forskydningshastigheden tilbage til 25 s-1 ved at ændre indstillingerne for sprøjtepumpen til en strømningshastighed på 7,5 μL / min.
- Overvåg overfladen af den coatede side af dækglaset, vent indtil det første blodplade begynder at klæbe, fokus mikroskopet på denne blodplade og start optagelsen ved at starte eksperimentet i softwaren. Se tabel 1 for de indspilningsindstillinger, der bruges her.
- Følg liveoptagelsen visuelt. Efter 30 minutter skal du stoppe sprøjtepumpen.
BEMÆRK: Sørg for, at blodpladerne forbliver i fokus i løbet af eksperimentet. Typisk føjes 20-30 blodplader i synsfeltet ved en forstørrelse på 1.000X; Det drejer sig om 2.000-3.000 blodplader i hele flowkanalen. - Fastgørelse ved hjælp afStrømningskammeret (valgfrit).
- Når strømmen er stoppet, efter at sprøjtepumpen er stoppet, overfør indløbsslangen (luftfri) til fikseringsopløsningen. Genstart pumpen og flow fixeringsbufferen gennem kanalen i mindst 10 min ved samme strømningshastighed som nævnt i trin 7.8.
- Fjern kammeret fra mikroskopet, rengør nedsænkningsolien fra glasset, afbryd vakuumet, og fjern forsigtigt glaspladen fra kammeret med en 18 G nål.
BEMÆRK: Undgå at dæksglaset brækker og beskadiger siliciumpladen. - Placer coverdækslet (med cellerne rettet opad) i en 4-brønds plade oven på et væv, forvædet med destilleret vand.
BEMÆRK: Dette forhindrer, at dækglaset klæber til brøndens overflade og forhindrer tørring. - Pipetter 750 μL fikseringsopløsning oven på dækglaset, og inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Hvis prøverne ikke kan analyseres direkte,Opbevar dem i 0,5% PFA (fortyndet af HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4) ved 4 ° C for at sikre stabil fixering. Fortsæt til afsnit 8 for at behandle coverglaset til billedbehandling.
- Efter brug skylles kammeret, slangen og pladen med destilleret vand og inkuberes natten over i en vaskemiddelopløsning. Inden genbrug af kammeret og andre komponenter skal skylles med destilleret vand.
- Gem mikroskopets rå datafiler, der indeholder alle metadata. Når det er nødvendigt, eksportere filmene til .MOV, h.264 komprimeret eller .AVI ukomprimeret. Gem separate rammer som JPEG- eller TIF-filer.
8. Prøveforberedelse til konfokal fluorescensmikroskopi
- Overfør afdækningsbrillerne til nye 4-brøndsplader og skyll 5 gange med 3 ml HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4. Tilsæt 3 ml / brønd af blokerende buffer og inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern blokeringsbufferen; Tilsæt 3 ml / brønd 0,15% glycin (M / V) i HEPES Tyrode's buffer, pH 7,4; Og inkuber i 15 minutter ved RT.
- Fjern glycinopløsning og vask 5 gange i 3 ml / brønd af blokeringsbuffer. Eventuelt tilsættes fluorophore-konjugerede antistoffer fortyndet i blokeringsbuffer til yderligere farvning. Inkubér i 1 time ved RT i mørke.
- Vask 5 gange med blokeringsbuffer og 2 gange med destilleret vand. Tør glasset ved at fjerne overskydende væske med et væv (fra kanterne indad) uden at berøre cellerne.
- Pipetter 60 μL polyvinylalkoholopløsning på et mikroskopglas. Placer coverglaset med cellerne nede på toppen af dråben og lad polyvinylalkoholen spredes mellem de to overflader. Inkubér natten over ved RT i mørket.
- Analyser cellerne ved hjælp af konfokal mikroskopi 14 .
- Gem de rå datafiler i de optagede stakdata, der indeholder alle metadata. Når det er nødvendigt, behandle de rå datafiler i MOV, h.264 komprimerede eller .AVI ukomprimerede filer. Gem separate stak som JPEG- eller TIF-filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser billeder af strømningskammeret og eksperimentelle opsætninger; Positionen og dimensionerne af siliciumpladen; Og rørforbindelser. Figur 2 giver detaljer om dimensioner af strømningskammeret. Figur 3 og film 1 viser en tidsserie af billeder af trombocytadhæsion og spredning på immobiliseret VWF. CD63 er et transmembranprotein, der indsættes i membranen af intracellulære tætte granuler af hvileplader 15 . Dens tidsafhængige mobilisering på blodpladeoverfladen er vist i grønt. Tilsvarende er P-selektin (Psel) et transmembranprotein indsat i membranen af intracellulære a-granuler af hvilende blodplader. Dens tidsafhængige mobilisering på blodpladeoverfladen er vist i orange. Figur 3B viser et repræsentativt billede ved en 45 ° vinkel, Erhvervet ved konfokal fluorescensmikroskopi efter et flowforsøg. Film 2 viser en vippeserie af samme eksperiment. Bemærk, at CD63 hovedsageligt er placeret i den centrale granulomere, mens P-selectin fordeles over hele cellens krop og fremstår koncentreret ved kanterne. Figur 4A og film 3 viser den tidsafhængige mobilisering af CD63 på blodpladeoverfladen (grøn). I disse forsøg blev blodplader (som ikke har nukleært DNA) præinkuberet med DAPI (blå), som pletter polyphosphat i tætte granulater 16 . På trods af tydelige tegn på tæt granulfrigivelse (enkeltcelleanalyser er vist på figur 4B og film 4 ), polyphosphat holdes indenfor eller på ydersiden af disse blodplader. Figur 5 og Movie 5 viser tidsafhængig mobilisering (eller rekruttering) af VWF, et trombogent multImerisk protein 17 opbevaret i a-granuler til blodpladeoverfladen (grøn). På samme måde som polyphosphat forbliver VWF forbundet med overfladen af de aktiverede blodplader.
Figur 1: Flow Chamber og Experiment Setup. ( A ) Billede af flowkammerdesign med indløb og udløb (1 og 2), en vakuumforbindelse (3), på hvilken silikonepladen (4) er anbragt. To ydre udskæringer (5) i siliciumpladen danner vakuumkanalerne for at fastgøre dæksglaset (6). En central udskæring (7) danner strømningskanalen ( B ) Billede af den eksperimentelle opsætning. Indløb og udløb (1 og 2), sprøjtepumpe (8) og prøveholder (9). ( C ) Skematisk oversigt over den eksperimentelle opsætning; Tallene er identiske med dem i A og B. ( D ) Skematisk oversigt med dimensionen Af den skræddersyede skåret silikoneplade. ( E ) Generel skematisk oversigt over poly (methylmethacrylat) flowkammeret . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Detaljeret tegning af flowkammer. Strømningskammeret består af en poly (methylmethacrylat) blok (1) , en lige polyoxymethylenindsats til vakuumindgangen (2) og to vinklede polyoxymethylenindsatser til prøveindløb og udløb (3) . De vinklede polyoxymethylenindsatser indeholder metalkapillærrør med diametre på 1,07 mm. Den lige indsats indeholder et kapillarrør med en diameter på 1,3 mm. 658 / 55658fig2large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Spredning af blodplader og degranulation på immobiliseret von Willebrand-faktor. ( A ) Tidsafhængig mobilisering af CD63 og P-selectin på overfladen af sprednings- og degranulerende blodplader. Hvidskalaen (øverst til venstre) indikerer 10 μm. ( B ) Repræsentativ konfokal fluorescensmikroskopi billede ved en 45 ° vinkel. Den hvide skala bar (nederst til venstre) angiver 2 μm. Grøn, CD63; Orange, P-selektin. Klik her for at se en større version af denne figur.
55658 / 55658fig4.jpg "/>
Figur 4: Blodpladefordeling, degranulation og mobilitet af tætte granuler på immobiliseret fibrinogen. ( A ) Tidsafhængig mobilisering af CD63 og polyphosphat på blodpladeoverfladen. Hvidskalaen (øverst til venstre) indikerer 10 μm. ( B ) Tidsserier af en enkelt blodplade (t = 0 repræsenterer den første adhæsion til overfladen). Den hvide skala bar (nederst til højre) indikerer 2 μm. Grøn, CD63; Blå, DAPI. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Overfladeforening af von Willebrand-faktor på blodpladeoverfladen af immobiliseret fibrinogen. Tidsafhængig mobilisering (eller rekruttering) af VWF til blodpladeoverfladen. THan hvidestang (øverst til venstre) angiver 5 μm. Grøn, VWF. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Indstilling | Værdi |
| Eksponeringstid FITC (Alexa488) | 200 ms / 300 ms |
| LED 488 intensitet FITC (Alexa488) | 50% |
| Eksponeringstid DIC | 30 ms |
| Spænding halogenlampe | 4,5 volt |
| Eksponeringstid TRITC (Alexa 546) | 400 ms |
| LED 555 intensitet FITC (Alexa546) | 50% |
| Eksponeringstid DAPI | 500 ms |
| LED 365 intensitet | 50% |
| Filtersæt FITC | Filtersæt 10 |
| Filtersæt TRITC | Filtersæt 20 |
| Filtersæt DAPI | Filtersæt 01 |
| Objektiv | Alpha Plan-Fluar 100x / 1,45 Olie |
| Billedhastighed, optagetid | 1 ramme / 10 s, 30 min |
| Filkomprimeringsfilm | MOV (h.264), AVI (ukomprimeret) |
| Filkomprimeringsbilleder | JPEG, TIF |
Tabel 1: Mikroskopindstillinger. Indstillinger bruges til de repræsentative forsøg.
| Mål | Antistof / Farve | Koncentration |
| CD63 | <Td> Anti-CD63-biotin *)325 ng / ml | |
| P-selectin | Anti-CD62P-biotin **) | 90 ng / ml |
| DNA | DAPI | 10 μg / ml |
| VWF | Anti-human VWF-FITC | 5 μg / ml |
| *) Anti-CD63-biotin-antistof blandes med streptavidin-Alexa488 i et molforhold på 1: 1 før anvendelse | ||
| **) anti-CD62P-biotin-antistof blandes med streptavidin-Alexa546 i et molforhold på 1: 1 før anvendelse | ||
Tabel 2: Antistoffer og farvestoffer. Anbefalede antistof- og farvestofkoncentrationer for de viste repræsentative eksperimenter.
| Reagens kategori | Eksempel kompounds |
| Blodpladeagonister | Trombin, ADP, PAR-1 eller -4 aktiverende peptider, U46619, Thromboxan A2, ADP |
| Enzyminhibitorer | Hirudin, PPACK, heparinoider (indirekte), majs trypsininhibitor, sojabønne trypsininhibitor |
| Receptor antagonister | Anti-glyprotein 1ba, anti-glycoprotein VI; Clopidogrel, (cykliske) RGD-holdige peptider |
| Aktiveringsinhibitorer | Aspirinbehandling, fiksering |
Tabel 3: Potentielt nyttige reagenser.
Supplerende film: Film 1: Tidsserie af billeder af blodplade (se Figur 1 ), Film 2: Hældningsserie i Figur 3B , Film 3: Tidafhængig mobilisering af CD63 på blodpladenOverflade (se figur 4 ), film 4: tidsserier af enkeltcelleanalyser (se figur 4B ), film 5: tidsafhængig mobilisering af VWF (se figur 5 ).
Klik her for at downloade film 1.
Klik her for at downloade Movie 2.
Klik her for at downloade film 3.
Klik her for at downloade film 4.
Klik her for at downloade Movie 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Globalt er trombose en ledende dødsårsag og morbiditet, og blodplader spiller en central rolle i udviklingen. Dette værk beskriver en metode til live-celle billeddannelse af blodplade degranulation under flow. Det antages generelt, at når blodplader bliver aktiveret, frigives alle granulære indhold direkte til opløsning. De medfølgende resultater tyder på, at dette ikke nødvendigvis er tilfældet. Under adhæsion og degranulering bevarer blodplader en signifikant mængde polyphosphat ( figur 4 ). Derudover er det multimere protein VWF forbundet med blodpladeoverfladen efter nedbrydning ( Figur 5 ). Dette indikerer, at de molekylære mekanismer, som styrer blodpladegranulatdigranulering, er subtilere end generelt antaget.
For at muliggøre levende celledannelse af blodplade-degranulation under strømning blev de eksperimentelle betingelser valgt for at holde blodpladeaggregering til et minimum. BlodpladerTs på 150.000 blodplader / μl blev anvendt. Dette er ved den nedre ende af det normale interval (150.000-450.000 blodplader / μL). Endvidere blev trombocytadhæsion og -spredning undersøgt på immobiliseret VWF eller fibrinogen, hvilket førte til mild blodpladeaktivering (i modsætning til for eksempel kollagen). I undersøgelser med vaskede blodplader bevæger de øgede forskydningsgrader disse celler til midten af strømmen. Dette interfererer med adhæsion og efterfølgende spredning og komplicerer undersøgelsen af degranulering.
I fysiologisk hæmostase er blodplade-margination vigtig. Denne proces er drevet af erythrocytter og forklarer hvorfor lav anæmi i nogle tilfælde ledsages af en blødende diatese. En begrænsning af den præsenterede teknik er, at visualiseringen af blodplade-degranulation (med de fremlagte materialer og reagenser) forstyrres af røde blodlegemer. Blodpladefunktionen påvirkes af forskydningsspænding, som er en funktion af viskositeten af væsken (μ), såvel somAf forskydningshastigheden. Derfor anbefales det at studere blodpladefunktion i strømningsmodeller i opløsninger med sammenlignelige viskositeter ( dvs. vaskede blodplader, rekonstitueret blod, PRP eller helblod).
Der er flere praktiske faktorer, der skal tages i betragtning ved udførelsen af disse eksperimenter. For det første påvirkes fluorescenssignaler stærkt af fokusområdet. Hvis mikroskopet ikke er i fokus, er signalet let sløret eller endda tabt. Forud for ankomsten af blodplader til strømningskanalen er det bedst at fokusere på kanalen selv (begynde ved kanten af silikonepladen / strømningskanalen væggen). Når blodplader begynder at klæbe, fokusere på denne vedhæftningsbegivenhed. Et andet problem er blegningen af visse fluoroforer ( fx FITC). Gentagen excitation vil føre til tab af signal, der forstyrrer undersøgelsen. Disse hindringer kan overvindes ved at bruge mere stabile fluoroforer, hvilket reducerer intensiteten af det spændende LED-lys, forkorter expOsuretider, og / eller sænker billedfrekvensen.
Modellen beskrevet her er meget nyttig til at udføre en detaljeret undersøgelse af blodplade responser på en lang række immobiliserede proteiner og ved forskellige strømningshastigheder. Denne metode kan også potentielt anvendes til at studere deres interaktion med aktiverede endotelceller 18 . De tekniske fremskridt, der giver mulighed for de specielle flowkammers fleksible design, åbner for øjeblikket muligheder for biokompatibilitetsstudier 19 . Levende cellebilleddannelse af blodpladereaktivitet under strømning vil afsløre værdifulde indblik i kompleksiteten af trombocytadhæsionsresponsen. I sidste ende bør disse erfaringer føre til udviklings-eksperimentelle flowmodeller, der muliggør den kombinerede undersøgelse af trombocytfunktion og indflydelse på koagulationssystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
CM anerkender finansiel støtte fra International Patient Organization for C1-Inhibitor Deficiencies (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht og Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
