Summary
Bu çalışma, trombosit yapışması, yayılması ve akış altında salgı çalışması için bir floresan mikroskopi tabanlı yöntem açıklanmaktadır. Bu çok yönlü platform tromboz ve hemostaz üzerine mekanik araştırma için trombosit fonksiyonunun araştırılmasını sağlar.
Abstract
Kan trombositleri, hemostazda vasküler ihlalleri gidermek için trombüs oluşumu için önemli oyunculardır. Ayrıca tromboz, vaskülatürü tıkayan tromboz oluşumu ve organları yaralamaya, hayati tehlike oluşturan sonuçlarla ilgilenmektedirler. Bu, trombosit fonksiyonu ve akış koşulları altında gerçekleşen hücre biyolojik süreçlerini izlemek için yöntemlerin geliştirilmesi üzerine bilimsel araştırmalara motive olur.
Trombosit yapışması ve toplanması, trombosit biyolojisinde iki temel olgu çalışması için çeşitli akış modelleri mevcuttur. Bu çalışma aktivasyon sırasında akım altında gerçek zamanlı trombosit degranülasyonunu incelemek için bir yöntem açıklamaktadır. Yöntem, geniş alanlı, ters çevrilmiş, LED tabanlı floresan mikroskop altında yerleştirilen bir şırınga pompası kurulumuna bağlı bir akış odası kullanır. Burada açıklanan kurulum, flüoresan etiketli antikorlar veya fluoresc tarafından gönderilen birden fazla florofor eşzamanlı uyarılmasına olanak tanırBoyalar. Canlı hücre görüntüleme deneylerinden sonra kapak gözlükleri statik mikroskopi ( örn. Konfokal mikroskopi veya taramalı elektron mikroskobu) kullanılarak daha da işlenebilir ve analiz edilebilir.
Introduction
Trombositler kan akışında dolaşan anükleat hücrelerdir. Ana işlevi yaralanma yerlerinde vasküler yaraları kapatmak ve kan kaybını önlemektir. Bu yaralanma yerlerinde, subendotelyal kollajen lifleri maruz kalır ve daha sonra multimerik protein olan von Willebrand faktörü (VWF) ile kaplanır. VWF, trombosit hızını yavaşlatan hücre yüzeyi 1 üzerindeki glikoprotein Ibα-IX-V kompleksine bağlı olan bir mekanizma içinde dolaşımdaki trombositler ile etkileşime girer. Bu, yüksek makaslama hızlarında özellikle önemlidir. Trombositler daha sonra kollajenden aktive edici uyaranlar alırken morfolojik değişiklikler yaparlar. Bu, geri döndürülemez yayılma ve nihayetinde platelet toplanmasına yol açar. Her iki işlem de trombosit-platelet çapraz-tokuşunu kolaylaştırmak için granül içeriğinin salgılanmasına bağlıdır. Diğerleri arasında platelet a-granülleri trombosit yapışmasına ve köprüye yardımcı olmak için fibrinojen ve VWF içerirTrombositler integrin bağımlı bir şekilde bir araya getirilir. Trombosit yoğun granülleri, trombosit aktivasyonunu güçlendirmeye yardımcı olan inorganik bileşikler 2 , kalsiyum ve adenosin difosfat (ADP) içerir. Ayrıca, trombositler, (alerjik) inflamasyon 3 , komplement kontrol proteinleri 4 ve anjiyogenez faktörleri 5,6 olan aracı maddeleri içerirler ve bu içeriklerin farklı koşullar altında farklı şekilde serbest bırakılıp bırakılmadığı ve nasıl verildiğine ilişkin sorular ortaya çıkarır.
1980'lerden bu yana, akım modellerinde platelet fonksiyonu çalışması, tromboz mekanizmalarının araştırılması için değerlidir7. O zamandan beri, çok teknik ilerleme kaydedildi ve fibrin oluşumunu içeren akış modelleri şu anda, terapötik trombosit konsantratlarının ex vivo 8 hemostatik potansiyelini test etmek için geliştirildi veyaKesilme hızlarındaki bozulmaların tromboz morfolojisi üzerindeki etkisini araştırır 9 . Stabil yapışma ve fizyolojik tromboz oluşumuna (hemostaz) neden olan patolojik tromboz oluşumuna (tromboz) neden olan moleküler ve hücre-biyolojik mekanizmalardaki farklılıklar çok ince olabilir ve bu subselülerlerin gerçek zamanlı görselleştirilmesine izin veren akış modelleri gelişimini motive edebilir süreçler.
Böyle bir kurulumun değerli olacağı bir işlem örneği, hücre içi polifosfatın yeniden (yeniden) dağılımı ve bunun fibrin ultrastrüktürü 10 üzerindeki zaman etkisine bağlı etkiyi ortaya çıkarmak için pıhtılaşma faktörlerinin alınmasıdır. Çalışmalar genellikle son nokta analizleriyle sınırlıdır. Açıklanan yöntemin asıl amacı, trombosit aktivasyonu sırasında akım altında gerçekleşen dinamik subselüler süreçlerin gerçek zamanlı görsel incelemesini sağlamaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Utrecht Üniversite Tıp Merkezi'nin Yerel Medikal Etik Komitesi, bu çalışmanın da dahil olduğu ex vivo araştırma amaçları için kan çizimini onayladı.
1. Çözüm Hazırlama
- 10 mM HEPES, 0.5 mM Na2HPO4, 145 mM NaCl, 5 mM KC1, 1 mM MgS04 ve 5.55 mM D-HPO4 çözeltisi ile bir 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) Tyrode tamponu hazırlayın. Damıtılmış su içindeki glikoz.
- Tamponun iki çeşidi yapın: pH seviyelerini sırasıyla 6.5 ve 7,4 olarak ayarlayın. Deneylerin her günü için taze tampon yapın. Belirtildiği yerlerde, 10 ng / mL prostasiklin ile tamamlayın.
- Damıtık suda 50 mM Tris ve 150 mM NaCl eriterek TRIS tamponlu salin (TBS) hazırlayın ve pH'ı 9.0'a ayarlayın.
- 85 mM Tri-sodyum sitrat, 71 mM sitrik asit ve 111 mM D-glükozun çözündürülmesi ile asit sitrat dekstrozu (ACD) hazırlayınTatlı su.
- HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4'e% 2 (v / v) paraformaldehit (PFA) ilavesiyle bir fiksatif solüsyon hazırlayın. Çözünecek şekilde ısıtın (50-70 ° C) ve pH'ı 7.4'e ayarlayın. -20 ° C'de ayırın ve saklayın. Kullanımdan önce 37 ° C'de çözünür.
- % 1 (m / v) insan serum albümini (HSA), HEPES Tyrode tamponu (pH 7.4) içinde çözülerek bloke edici tampon hazırlayın
- 12 g gliserole 4.8 g polivinil alkol ilave ederek bir polivinil alkol çözeltisi yapın ve iyice karıştırın. 12 mL damıtılmış su ilave edin ve gece boyunca oda sıcaklığında bir rotatorda bırakın.
- 24 mL 0.2 M Tris-HCL, pH 8.5 ilave edin. 30 dakika karıştırılarak 50 ° C'ye ısıtılır. 1.25 g 1,4-diazabisiklo [2.2.2] oktan (DABCO) ilave edin ve iyice karıştırın. 5 dakika boyunca 1,500 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı (1 mL, 15-20 slayt için yeterlidir) alınız ve -20 ° C'de saklayınız. Alikotları bir kez kullanın.
2. Kapak Cam Hazırlığı
- Yağ alma örtüsü(25 x 50 mm2) gece boyunca seyreltilmemiş kromosülfürik asit içerisinde kuluçkalandı. Kapak gözlüklerini damıtılmış suyla durulayın ve bir gece boyunca 60 ° C'de fırında kurutun.
- Bir damla su ile bir laboratuar tezgahının üzerine bir parafin filmi şerit (10 x 15 cm2) yapıştırın ve parafin filmi yumuşatarak havayı alın. Parafin film üzerine 80 μL, 10 μg / mL VWF veya 100 μg / mL fibrinojenden pipetleyin. Gözlükleri damlaların üzerine yerleştirin; Protein çözeltisi iki yüzey arasında camın tüm arka tarafını örterek yayılır. Oda sıcaklığında (RT) 1.5 saat inkübe edin.
- Parafin filmi çıkartın ve kaplama bardaklarını, kaplama yüzü bloke edici tamponlu 4 gözlü bir plakaya gelecek şekilde yerleştirerek bloke edin. 37 ° C'de 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Kontrol olarak, VWF veya fibrinojen ile kaplanmamış bir kapak camını kapatın.
3. Trombositten zengin plazmanın (PRP) hazırlanması
NOT: Santrifüjden sonra, üç kat (üstten alta doğru) gözlenebilir: PRP, beyaz kan hücreleri ve kırmızı kan hücreleri. Beyaz ve kırmızı hücreleri içermemeye dikkat edin. Tipik olarak 9 mL'lik bir kan tüpünün santrifüj edildikten sonra 3 mL PRP toplanabilir.
NOT: Bu ikinci santrifüj adımından sonra tipik olarak 2 mL toplanabilir.
NOT: Seyreltilmiş PRP'nin toplam hacmi donörün trombosit sayısına bağlıdır. Trombosit sayıları vericiler arasında çok çeşitlidir ve PRP seyrelmesi bireysel bazda değerlendirme gerektirir. 150.000 ve 450.000 trombosit / μL'de trombosit sayıları normal kabul edilir.
4. Yıkanmış Trombositlerin Hazırlanması
- Bir hücre analizcisi kullanarak PRP'deki ortalama trombosit hacmini (MPV) belirleyin.
NOT: Bu, platelet ön-aktifleştirme 11'in bir göstergesidir. Trombosit dinlenmesi için normal bir MPV 7.5-11.5 fL 11'dir . MPV, trombosit yıkama prosedürü sırasında 1,5 fL'den fazla artmamalıdır. - Trombosit ön-aktivasyonunu önlemek ve frensiz 400 xg ve RT'de 15 dakika süreyle santrifüjlemeyi önlemek için PRP'ye 1/10 hacim ACD ekleyin. Dosyayı kaldırPernatant hale getirin ve topağı HEPES Tyrode tamponunda (pH 6.5) özenle PRP'nin orijinal hacmine yeniden askıya alın.
- 10 ug / mL'lik bir konsantrasyona TBS ilave ederek bir kısım prostasiklin çözülür; Buzda tutun
- Trombosit aktivasyonunu önlemek için, yeniden askıya alınmış trombositlere 10 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyonda prostasiklin ekleyin ve hemen fren olmaksızın 400 xg'de ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüje tabi tutun. Süpernatantı çıkarın ve peleti HEPES Tyrode'un tamponu (pH 7.4) içinde dikkatle süspanse edin.
- Trombosit sayısını sayın (adım 3.5) ve MPV'deki değişikliği belirleyin (adım 4.1) (MPV, 1,5 fL'den fazla değişmemelidir).
- HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4 ile trombosit sayısını 150.000 trombosit / μL konsantrasyona ayarlayın. Deneylerden önce oda sıcaklığında 30 dakika kadar iyileşmek için trombositleri bırakın. İzolasyondan 4 saat sonra yıkanmış trombositleri deneyler için kullanın.
5. Akış Odası Meclisi
12'yi kullanmaktadır . Tercihen daha ileri analizler için çıkartılabilen bir kapak camı tuttuğu sürece, çeşitli ticari olarak üretilmiş akış bölmeleri kullanılabilir. Tanımlanan deneyler için kullanılan akış odası, mikroskop ekleme aşamasına tam olarak uyum sağlamak için poli (metil metakrilat) malzemesinden yapılmıştır. Giriş ve çıkış ( Şekil 1A - C ; 1, 2) ve vakum bağlantısı ( Şekil 1A ve C ; 3) içerir. Özelleştirilmiş bir silikon levha ( Şekil 1A ve D ; 4) üstüne yerleştirilir. Kapak camını ( Şekil 1A ; 6) odacığa sıkıca bağlamak için iki kesik boşluklar vakum kanalları oluşturur ( Şekil 1A ve D ; 5). Merkezi bir kesik akış kanalı oluşturur ( Şekil 1A D ; 7; 2.0 mm genişlik ve 0.125 mm yükseklik). Giriş ve çıkış akış kanalına bağlıdır ve vakum vakum kanalına bağlıdır.
- Akış odasının üst kısmını damıtılmış su ile örtün ve özelleştirilmiş silikon levhanın pürüzsüz yüzü aşağıda suya yerleştirin. Levhayı yerine koyarken fazla suyu çıkararak sayfayı yerlerine kaydırın.
NOT: Bu silikon levha yeniden kullanılabilir (silikon, inert nitelikleri ile bilinir); Genellikle, trombositlerin ona tutunduğu gözlemlenmemiştir. Levhalar deterjanla temizlenebilir ve malzeme hasar görene kadar tekrar kullanılabilir (özellikle kanallar arasındaki alanda yırtılma). Genel olarak, bir sayfa, günde birden fazla deneyle 20 gün boyunca kullanılabilir. - Silah silikon levhasını akış odasına sıkıca yapıştırmak için artık odayı buharlaştırmak için akış odasını 60 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Bir plastik Pasteur pipetiyle bir damlaTyrode'un tamponunu, pH 7.4'ü akış kanalına geçirir. Kapak camını (bkz. Bölüm 2) kaplamalı yüzü aşağıda olacak şekilde akış kanalına yerleştirin. Vakum pompasını vakum bağlantısına takın ( Şekil 1A ve C ; 3). ~ 10 kPa basınç uygulayın.
6. Trombositlerin ön boyanması ve antikorların hazırlanması
- Trombosit boyama
- Karanlıkta 37 ° C'de 30 dakika boyunca yıkanmış trombositleri 10 μg / mL DAPI ile inkübe edin. Bağlanmamış DAPI'yı yıkamak ve trombosit aktivasyonunu önlemek için 10 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyonda prostasiklin ekleyin ve hemen 400 xg'de ve frensiz RT'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Trombosit topağını HEPES Tyrode tamponu (pH 7.4) içinde 150.000 trombosit / μL trombosit konsantrasyonuna getirin.
- Antikorların hazırlanması
- Biyotinle etiketlenmiş antikoru Alexa ile etiketlenmiş strep ile karıştırın1: 1 molar oranda tavidin. Kullanmadan önce oda sıcaklığında minimum 10 dakika inkübe edin (adım 7.6).
NOT: Biyotin etiketleme etkinliği farklı yığınlar arasında değişebilir. Hedef moleküllerin görselleştirilmesinde sorunlar olması durumunda, başarılı biotinleme ve spesifik biyotinlenmiş antikorun hedefe bağlanma özelliklerini teyit etmek için kontrol deneyleri yapılmalıdır.
- Biyotinle etiketlenmiş antikoru Alexa ile etiketlenmiş strep ile karıştırın1: 1 molar oranda tavidin. Kullanmadan önce oda sıcaklığında minimum 10 dakika inkübe edin (adım 7.6).
Perfüzyon
- Floresan mikroskopu yanı sıra mikroskop yazılımı başlatmak. Tablo 1'de listelenen mikroskop ayarlarını kullanın.
NOT: Mikroskop yazılımında uygun bir deney yükleyerek, trombositlerin ve seçilen floresan etiketli antikorların ve / veya boyaların canlı hücre görselleştirilmesi ve kaydedilmesi için mikroskop ve kayıt ayarlarını başlatın. RT de akış deneyleri yapın. - 10 mL'lik bir şırıngayı boruya bağlayarak ve% 1'lik HSA bloğu emerek giriş tüpünü bloke edinTüpünü giriş borusuna sokun. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Giriş tüpünü, HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4'ü giriş borusuna aspire ederek durulayın.
- Kapatılan giriş tüpünü ve işlenmemiş çıkış tüpünü, oda girişine ve çıkışına 1.02 mm çapında ve ~ 20-30 cm uzunluğunda bağlayın. Çıkış tüpüne 10 mL'lik bir şırınga (veya daha düşük doğruluk için daha düşük hacim) bağlayın. Şırınga pompasını çalıştırın.
NOT: Şırınganın çapı, pompa üzerinde ayarlanan akış hızı ile birlikte hacimsel akış hızını belirler. Akış kanalının yüzey alanı ile birlikte kesme oranı, formül 13'e göre hesaplanabilir altında. Dolayısıyla şırınga pompasının akış oranını değiştirerek veya akış kanalının boyutlarını değiştirerek makaslama oranını değiştirmek mümkündür. Atım hızı 800-1,600 s -1 arteryel kan akışı için normalde modellenirken, venöz kan için 25 - 100 s-1 modelleriakar. Bu kurulum için, 7.5 μL / dak'lık bir akış hızı, 25 s -1'lik bir makaslanma oranına neden olur.
Makaslama hızı = s-1'de 6Q / saat 2 w
Burada: Q = hacimsel akış oranı (mL / s), h = yükseklik kanalı (cm) (0.0125 cm, silikon levhanın kalınlığıdır), w = genişlik kanalı (cm) (bu bölmede 0.2 cm). - 100X'lik bir objektif üzerine bir damla daldırma yağı yerleştirin (1.000X'lik toplam amplifikasyon) ve cam yüzeyi aşağı bakacak şekilde mikroskop üzerine oda monte edin.
- Giriş hortumunu, HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4 içeren bir tüp içine yerleştirin. Çıkış tüpüne bağlı şırınganın pistini elle çekin ve havayı sistemden çıkarmak için odanın içinden çözeltiyi çekin. Şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ( Şekil 1B ve C ; 8) ve pompayı kısaca çalıştırarak pistonu sıkıştırın ve dengeli akış sağlayın.
- Trombosit süspansiyonuna veya PRP'ye antikorlar ve / veya boyalar ekleyin, dikkatlicePlastik bir pipetle karıştırın ve karışımı 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
NOT: Kesme hızında 25 s-1 (7.5 μL / dak) olan tipik bir 30 dakikalık perfüzyon için minimum 225 μL trombosit süspansiyonu gerekir. Temsili sonuçlar için kullanılan antikorlar Tablo 2'de gösterilmektedir. - Giriş tüpünü sıkarken HEPES Tyrode tamponu pH 7.4'den, ya PRP ya da yıkanmış trombositleri, antikorları ve / veya boyaları ( Şekil 1B ve C ; 9) içeren 1.5 mL'lik bir tüpe getirin.
NOT: Havanın hortuma girmesini engellemek için hortumun transferinde hortumun sıkıştırılması (havanın bastırılması) önemlidir. Yapışkan trombositleri, çeşitli yöntemlerle, bir sonraki aşamada, benzer bir şekilde başka bir tüpe aktarılarak işleme tabi tutmak mümkündür. Potansiyel olarak yararlı reaktiflerin bir listesi Tablo 3'te verilmiştir . - "Canlı görselleştirme" yi seçinN "seçeneğine basın, mikroskopı kaplanmış kaplama camının yüzeyine odaklayın ve trombositler akış odasına ulaşıncaya kadar 1,600 s-1 (484 μL / dak) kesme hızında pompaya başlayın.Bu anda, Şırınga pompasının ayarlarını 7,5 μL / dak'lık bir akış oranına değiştirerek makaslama oranını 25 s-1'e düşürün.
- Kapak camının kaplanmış tarafının yüzeyini izleyin, ilk trombositlerin yapışmasına başlamasını bekleyin, mikroskopu bu trombosit üzerinde odaklayın ve yazılımı yazılımda denemeyi başlatarak kayıt işlemine başlayın. Burada kullanılan kayıt ayarları için Tablo 1'e bakın.
- Canlı kaydı görsel olarak takip edin. 30 dakika sonra şırınga pompasını durdurun.
NOT: Deney süresince trombositlerin odakta kalmasını sağlayın. Tipik olarak, 20-30 trombositler 1,000X'lık bir büyütme oranında görüş alanına eklenir; Bu akış kanalının tamamında yaklaşık 2.000-3.000 trombosittir. - Kullanarak sabitlemeAkış odası (isteğe bağlı).
- Şırınga pompası durdurulduktan sonra akış durdurulduğunda, giriş tüpünü (hava ücretsiz) sabitleme solüsyonuna aktarın. Pompayı tekrar başlatın ve sabitleme tamponunu 7.8. Adımda belirtildiği gibi aynı akış hızında en az 10 dakika kanal boyunca akıtırın.
- Mikroskop odasını çıkarın, daldırma yağı camdan temizleyin, vakum bağlantısını kesin ve 18 G'lik bir iğne ile kapak camını bölmeden dikkatli bir şekilde çıkarın.
NOT: Kapak camının silikon tabakasını kırıp hasar görmesini önleyin. - Kapak sürgüsünü (hücreleri yukarı doğru yönlendirdikçe) damıtık suyla önceden ıslatılmış bir doku üzerine 4 oyuklu bir plakaya yerleştirin.
NOT: Bu, kapak camının kuyu yüzeyine yapışmasını önler ve kurumayı engeller. - Kapak camının üzerine fiksatif çözelti 750 μL Pipetleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Numunelerin doğrudan analiz edilememesi durumunda,Sabit fiksasyon sağlamak için 4 ° C'de% 0.5 PFA (HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4 ile seyreltilmiş) içinde saklayın. Görüntüleme için kapak camını işlemek için 8. bölüme geçin.
- Kullandıktan sonra, bölmeyi, boruyu ve tabakayı damıtılmış suyla durulayın ve bir gece boyunca bir deterjan çözeltisi içerisinde inkübe edin. Hazne ve diğer bileşenlerin tekrar kullanılmadan önce damıtılmış su ile yıkayın.
- Tüm meta verileri içeren mikroskop ham veri dosyalarını kaydedin. Gerektiğinde, filmleri .MOV, h.264 sıkıştırılmış veya .AVI sıkıştırılmamış olarak dışa aktarın. Ayrı kareleri JPEG veya TIF dosyaları olarak kaydedin.
8. Konfokal Floresan Mikroskopi için Örnek Hazırlama
- Kapak gözlüklerini yeni 4 yuvalı plakalara aktarın ve 5 mL 3 mL HEPES Tyrode tamponu, pH 7.4 ile durulayın. 3 mL / oyuk bloke edici tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Bloke edici tamponu kaldırın; HEPES Tyrode tamponu (pH 7.4) içinde 3 mL / oyuk% 0.15 glisin (M / V) ilave edin; Ve 15 dakika boyunca R'de inkübe edinT.
- Glisin çözeltisini çıkarın ve bloke edici tamponun 3 mL / çukurunda 5 kez yıkayın. İsteğe bağlı olarak, ek boyama için bloke edici tamponda seyreltilmiş fluorofor-konjuge antikorlar ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Blok tamponu ile 5 kez ve damıtılmış su ile 2 kez yıkayın. Fazla sıvıyı bir doku ile (kenarlardan içe doğru) hücreye dokunmadan kaldırarak camı kurutun.
- Mikroskop slayt üzerine 60 μL polivinil alkol solüsyonu pipetleyin. Kapak camını, hücrelerin aşağı gelecek şekilde damla üstüne koyun ve polivinil alkolün iki yüzey arasında dağılmasına izin verin. Gece boyunca karanlıkta RT kuluçkalayın.
- Konfokal mikroskopi ile hücreleri analiz 14 .
- Tüm meta verileri içeren kaydedilmiş yığın verisinin ham veri dosyalarını kaydedin. Gerektiğinde, ham veri dosyalarını MOV, h.264 sıkıştırılmış veya .AVI sıkıştırılmamış dosyalar olarak işleyin. Ayrı yığınları JPEG veya TIF dosyaları olarak kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 , akış odasının görüntülerini ve deney düzeneğini göstermektedir; Silikon levhanın konumu ve boyutları; Ve hortum bağlantıları. Şekil 2 , akış haznesinin boyutlarıyla ilgili ayrıntılar sunmaktadır. Şekil 3 ve Film 1 , platelet yapışmasının ve sabitlenmiş VWF üzerine yayılma görüntülerinin bir zaman serisini göstermektedir. CD63, dinlenme plateletlerinin hücre içi yoğun taneciklerinin zarına 15 eklenen bir zararsız proteintir. Trombosit yüzeyine zamana bağlı mobilizasyon yeşil renkte gösterilir. Benzer şekilde, P-selektin (Psel), istirahat eden trombositlerin hücre içi a-granüllerinin zarına eklenen bir zar-ötesi proteintir. Trombosit yüzeyine zamana bağlı mobilizasyon turuncu renkte gösterilir. Şekil 3B , 45 ° açıda temsili bir görüntüyü göstermektedir, Bir akış deneyinden sonra konfokal flüoresan mikroskopisi ile elde edildi. Film 2 , aynı denemenin eğim serisini gösterir. CD63, esas olarak merkezi granülomere yerleşirken, P-selektin tüm hücre gövdesine dağılır ve kenarlar üzerinde yoğunlaşmış gibi görünür. Şekil 4A ve Film 3 , CD63'ün trombosit yüzeyine zamana bağlı mobilizasyonunu (yeşil) göstermektedir. Bu deneylerde, trombositlerin (nükleer DNA'sız), DAPI (mavi) ile ön kuluçkaya yatırıldığı, yoğun granüller halinde polifosfat boyadığı 16 . Dikkat çekici şekilde, yoğun granül bırakmanın açık işaretlerine (tek hücreli analizler Şekil 4B ve Film 4'te gösterilmiştir ) rağmen, polifosfat bu trombositlerin içinde veya dışında tutulmaktadır. Şekil 5 ve Film 5 , trombojenik bir mult olan VWF'nin zamana bağlı mobilizasyonunu (veya alımını) göstermektedirImeric protein 17 , trombosit yüzeyine (yeşil) α-granüllerde saklanır. Polifosfata benzer şekilde, VWF aktif trombositlerin yüzeyi ile ilişkili olarak kalır.
Şekil 1: Akış Odası ve Deneysel Kurulum. ( A ) Bir giriş ve çıkış (1 ve 2), silikon levhanın (4) üzerine yerleştirilmiş bir vakum bağlantısı (3) bulunan akış odası tasarımı görüntüsü. Silikon tabakasındaki iki dış kesi (5), kapak camını (6) takmak için vakum kanallarını oluşturur. Merkezi bir kesik (7) deneyin kurulduğu akış kanalı ( B ) görüntüsünü oluşturur. Giriş ve çıkış (1 ve 2), şırınga pompası (8) ve numune tutacağı (9). ( C ) Deneysel kurulumun şematik görünümü; Sayılar A ve B'deki ile aynıdır. ( D ) Boyutlu şematik özet Özelleştirilmiş kesilmiş silikon levha. ( E ) Poli (metil metakrilat) akış odasının genel şematik genel görünüşü . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Akış Odası Ayrıntılı Blueprint. Akış odası, bir vakum girişi (2) için bir düz polioksimetilen insert ve örnek giriş ve çıkış (3) için iki açılı polioksimetilen insert içeren bir poli (metil metakrilat) bloğundan (1 ) oluşur . Açılı polioksimetilen insertler 1.07 mm çaplı metal kılcal borular içerir. Düz insert, 1.3 mm çapında bir kılcal boru içerir. 658 / 55658fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: İmmobilize von Willebrand Faktörü Üzerindeki Trombosit Yayılması ve Degranülasyon. ( A ) CD63 ve P-selektinin, yayılım ve degranülasyon trombosit yüzeyine zamana bağlı mobilizasyonu. Beyaz çubuk (sol üst) 10 μm'yu işaret eder. ( B ) 45 ° açıdaki temsili konfokal flüoresan mikroskopi görüntüsü. Beyaz çubuk (sol alt sol) 2 μm'yu gösterir. Yeşil, CD63; Turuncu, P-selektin. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
55658 / 55658fig4.jpg "/>
Şekil 4: İmmobilize Fibrinojende Yoğun Granüllerin Trombosit Yayılması, Degranülasyonu ve Hareketi. ( A ) CD63 ve polifosfatın trombosit yüzeyine zamana bağlı mobilizasyonu. Beyaz çubuk (sol üst) 10 μm'yu işaret eder. ( B ) Tek bir trombositin zaman serileri (t = 0, yüzeye ilk yapışmayı temsil eder). Beyaz ölçekli çubuk (sağ alt) 2 μm'yi gösterir. Yeşil, CD63; Mavi, DAPI. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Von Willebrand Faktörünün İmmobilize Fibrinojenin Trombosit Yüzeyine Yüzey Birleşmesi. VWF'nin trombosit yüzeyine zamana bağlı mobilizasyon (veya alım). TO beyaz çizgili çubuk (sol üst) 5 μm gösterir. Yeşil, VWF. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| Ayar | değer |
| Maruz kalma süresi FITC (Alexa488) | 200 ms / 300 ms |
| LED 488 yoğunluklu FITC (Alexa488) | % 50 |
| Pozlama süresi DIC | 30 ms |
| Gerilim halojen lambası | 4.5 Volt |
| Maruz kalma süresi TRITC (Alexa 546) | 400 ms |
| LED 555 yoğunluklu FITC (Alexa546) | % 50 |
| Maruziyet zamanı DAPI | 500 ms |
| LED 365 yoğunluğu | % 50 |
| Filterset FITC | Filterset 10 |
| Filterset TRITC | Filterset 20 |
| Filterset DAPI | Filterset 01 |
| Amaç | Alpha Plan-Fluar 100x / 1.45 Yağ |
| Kare hızı, kayıt süresi | 1 çerçeve / 10 s, 30 dak |
| Dosya sıkıştırma filmleri | MOV (h.264), AVI (sıkıştırılmamış) |
| Dosya sıkıştırma resimleri | JPEG, TIF |
Tablo 1: Mikroskop ayarları. Temsili deneyler için kullanılan ayarlar.
| Hedef | Antikor / Boya | konsantrasyon |
| CD63 | <Td> Anti-CD63-biotin *)325 ng / mL | |
| P-selektin | Anti-CD62P-biotin **) | 90 ng / mL |
| DNA | DAPI | 10 ug / mL |
| VWF | Anti-insan VWF-FITC | 5 ug / mL |
| *) Anti-CD63-biyotin antikoru, kullanımdan önce streptavidin-Alexa488 ile 1: 1 molar oranda karıştırılır. | ||
| **) anti-CD62P-biyotin antikoru, kullanımdan önce streptavidin-Alexa546 ile 1: 1 molar oranında karıştırılır. | ||
Tablo 2: Antikorlar ve Boyalar. Gösterilen temsili deneyler için önerilen antikor ve boya konsantrasyonları.
| Reaktif kategorisi | Örnek kompozisyonunds |
| Trombosit agonistleri | Trombin, ADP, PAR-1 veya -4 aktive peptidleri, U46619, Thromboxane A2, ADP |
| Enzim inhibitörleri | Hirudin, PPACK, heparinoidler (dolaylı), mısır tripsin önleyicisi, soya fasulyesi tripsin önleyicisi |
| Reseptör antagonistleri | Anti-Glyprotein 1bα, anti-Glikoprotein VI; Klopidogrel, (siklik) RGD içeren peptidler |
| Aktivasyon inhibitörleri | Aspirin önişlemi, fiksasyon |
Tablo 3: Potansiyel olarak faydalı reaktifler.
Ek Filmler: Film 1: Trombositlerin zaman serileri (bkz. Şekil 1 ), Film 2: Şekil 3B'nin eğik serisi, Film 3: CD63'ün trombosit üzerine zamana bağlı mobilizasyonuFilm 4: Tekli hücre analizlerinin zaman serileri ( Şekil 4B'ye bakınız), Film 5: VWF'nin zamana bağlı mobilizasyonu (bakınız Şekil 5 ).
Film 1'i indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Film 2'yi indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Film 3 indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Film 4'ü indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Film 5'i indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dünya çapında tromboz önde gelen ölüm ve morbidite nedenidir ve trombositler gelişiminde merkezi bir rol oynamaktadır. Bu çalışma akış altında trombosit degranülasyonunun canlı hücre görüntülemesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Genellikle, trombositler harekete geçirildiğinde, tüm granül içeriği çözeltiye doğrudan salınır. Eşlik eden sonuçlar bunun mutlaka geçerli olmadığını göstermektedir. Yapışma ve degranülasyon sırasında, trombositler önemli miktarda polifosfat tutar ( Şekil 4 ). Ek olarak, multimerik protein VWF, degranülasyondan sonra platelet yüzeyi ile ilişkilidir ( Şekil 5 ). Bu, trombosit granül degranülasyonunu kontrol eden moleküler mekanizmaların genel olarak kabul edilenlerden daha inceltilmiş olduğunu gösterir.
Akım altında trombosit degranülasyonunun canlı hücre görüntülemesini sağlamak için, trombosit agregasyonunu asgari seviyede tutmak için deneysel koşullar seçildi. Trombosit konseyleri150.000 trombosit / μL ts kullanıldı. Bu normal aralığın alt ucunda (150,000-450,000 platelet / μL) bulunur. Dahası, platelet yapışması ve yayılması, hafif trombosit aktivasyonuna (örneğin kollajen aksine) yol açan immobilize VWF veya fibrinojen üzerinde çalışılmıştır. Yıkanan trombositler üzerinde yapılan çalışmalarda, kesilme hızları arttıkça bu hücreler akışın merkezine taşınır. Bu, adezyon ve müteakiben yayılmaya müdahale eder ve degranülasyonun araştırılmasını karmaşıklaştırır.
Fizyolojik hemostazda trombosit marjı önemlidir. Bu süreç, eritrositler tarafından yönlendirilir ve düşük anemiye bazen kanama diyatezi eşlik ettiğini açıklar. Sunulan tekniğin bir kısıtlılığı, trombosit degranülasyonunun (sunulan malzemeler ve reaktiflerle birlikte) görselleştirilmesinin kırmızı kan hücreleri tarafından bozulmasıdır. Trombosit fonksiyonu, sıvının viskozitesinin (μ) bir fonksiyonu olan kesilme stresinden etkilenir, hem deMakaslama oranı. Dolayısıyla, karşılaştırılabilir viskozitelerle ( yani, yıkanmış trombositler, sulandırılmış kan, PRP veya tam kan) çözeltilerdeki akış modellerinde trombosit işlevinin çalışılması önerilir.
Bu denemeleri gerçekleştirirken göz önüne almanız gereken birkaç pratik faktör vardır. Birincisi, flüoresans sinyalleri, odak alanı tarafından kuvvetle etkilenir. Mikroskop odağı değilse, sinyal kolayca bulanıklaşır veya kaybolur. Trombositlerin akış kanalı içine gelmeden önce kanalın kendisine odaklanması en iyisidir (silikon tabaka / akış kanalı duvarının kenarından başlamak). Trombositler tutunmaya başlayınca, bu yapışma olayına odaklanın. İkinci bir endişe noktası, belirli floroforların ağartılması ( örn., FITC). Tekrarlı uyarılma, araştırmayı bozarak sinyal kaybına yol açacaktır. Bu engeller daha kararlı fluoroforlar kullanarak, heyecan verici LED ışığının yoğunluğunu düşürerek, exp'yi kısaltarak üstesinden gelinebilirOsure zamanları ve / veya kare hızını düşürme.
Burada açıklanan model çok çeşitli immobilize proteinlere ve farklı akış hızlarına sahip platelet yanıtlarının detaylı bir çalışması için çok yararlıdır. Potansiyel olarak, bu yöntem aktifleştirilmiş endotel hücreleri ile etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir 18 . Özel akış odalarının esnek tasarımlarına olanak tanıyan teknik ilerlemeler şu anda biyouyumluluk çalışmaları için yollar açmaktadır 19 . Akış altındaki trombosit reaktivitesinin canlı hücre görüntülemesi trombosit yapışma tepkisinin karmaşıklığı üzerine değerli bilgiler verecektir. Sonuç olarak, bu deneyimler trombosit fonksiyonunun ve pıhtılaşma sistemi üzerindeki etkisinin kombine araştırılmasına imkan tanıyan deneysel akış modellerinin geliştirilmesine yol açmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
CM, C1 Hastalığı Önleyici Eksiklikler (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht ve Kan Transfüzyon Araştırması için Landsteiner Vakfı (LSBR) için Uluslararası Hasta Kuruluşu tarafından maddi desteği onayladı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
