Summary
यह काम प्लेटलेट आसंजन, फैल और स्राव के प्रवाह के अध्ययन के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी-आधारित पद्धति का वर्णन करता है। यह बहुमुखी मंच घनास्त्रता और हेमोस्टेसिस पर तंत्रिकी अनुसंधान के लिए प्लेटलेट समारोह की जांच को सक्षम करता है।
Abstract
रक्त प्लेटलेट हेमोस्टेसिस में आवश्यक खिलाड़ी हैं, रक्त वाहिका को तोड़ने के लिए thrombi का गठन। वे घनास्त्रता में भी शामिल हैं, थ्रॉम्बी का गठन होता है जो प्राणघातक और अंगों को घायल करते हैं, जीवन-धमकी के परिणाम के साथ। यह प्लेटलेट फ़ंक्शन पर वैज्ञानिक अनुसंधान और कोशिका-जैविक प्रक्रियाओं को ट्रैक करने के तरीकों के विकास को प्रेरित करता है क्योंकि वे प्रवाह की स्थिति के तहत होते हैं।
प्लेटलेट आइडियेशन और एकत्रीकरण के अध्ययन के लिए प्लेटलेट जीव विज्ञान में दो प्रमुख घटनाएं उपलब्ध हैं। यह कार्य सक्रियण के दौरान प्रवाह के अंतर्गत रीयल-टाइम प्लेटलेट डीग्रेन्युलेशन का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। विधि एक सिरिंज-पंप सेटअप के साथ मिलकर एक प्रवाह कक्ष का उपयोग करता है जो एक व्यापक-क्षेत्र, उल्टे, एलईडी-आधारित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के नीचे रखा जाता है। यहाँ वर्णित सेटअप फ्लोरोसेंट लेबलिंग एंटीबॉडी या फ्लोरोस के द्वारा वितरित कई फ्लोरोफोर्स के साथ-साथ उत्तेजना के लिए अनुमति देता हैएंट रंजक लाइव-सेल इमेजिंग प्रयोगों के बाद, कवर ग्लास को और आगे प्रोसेस किया जा सकता है और स्टैटिक माइक्रोस्कोपी ( यानी, कन्फोकल माइक्रोस्कोपी या स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है।
Introduction
प्लेटलेट रक्त कोशिकाओं में प्रसारित होते हैं जो रक्त प्रवाह में प्रसारित होते हैं। उनका मुख्य कार्य चोट की साइटों पर संवहनी उल्लंघनों को सील करना और रक्त के नुकसान को रोकने के लिए है। चोट की इन साइटों पर, उप-थिंटेल्हेियल कोलेजन फाइबर उजागर हो जाते हैं और बाद में मल्टीमीरिक प्रोटीन, वॉन विलेब्रांड फैक्टर (वीडब्ल्यूएफ) द्वारा कवर किया जाता है। वीडब्ल्यूएफ़ प्लेटलेट्स की गति को धीमा करते हुए सेल की सतह 1 पर ग्लाइकोप्रोटीन आईबीएनए-इले-वी कॉम्प्लेक्स पर निर्भर तंत्र में परिसंचरण के साथ संपर्क करता है। उच्च कतरनी दर पर यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। कोलेजन से क्रियाशील आवेगों को प्राप्त करते समय बाद में प्लेटलेट्स में रूपात्मक परिवर्तन होते हैं। इससे अपरिवर्तनीय फैल जाता है और आखिरकार प्लेटलेट एकत्रीकरण हो जाता है। प्लेटलेट-प्लेटलेट क्रोसस्टल की सुविधा के लिए दोनों प्रक्रियाएं ग्रेन्युल सामग्री के स्राव पर निर्भर करती हैं। दूसरों के बीच, प्लेटलेट α-granules में फाइब्रिनोजेन और VWF होते हैं जो प्लेटलेट आसंजन की सहायता करते हैं और पुलप्लेटलेट एक साथ एक एकीकृत-आधारित तरीके से प्लेटलेट-घने ग्रैन्यूल में कैल्शियम और एडेनोसिन डीफोफॉसेट (एडीपी) समेत अकार्बनिक यौगिक 2 होते हैं, जो प्लेटलेट सक्रियण को मजबूत करने में मदद करते हैं। इसके अलावा, प्लेटलेट में (एलर्जी) सूजन 3 , पूरक-नियंत्रण प्रोटीन 4 , और एंजियोजेनेस कारक 5 , 6 के मध्यस्थ होते हैं, ये प्रश्न उठाते हैं कि इन सामग्रियों को अलग-अलग परिस्थितियों में किस प्रकार अलग-अलग जारी किया जाता है।
1 9 80 के दशक से, प्रवाह मॉडल में प्लेटलेट फ़ंक्शन का अध्ययन थ्रोम्बोटिक तंत्रों की जांच के लिए मूल्यवान रहा है। तब से, बहुत तकनीकी प्रगति की गई है, और प्रवाह मॉडल जिनमें आतंच गठन शामिल है, वर्तमान में चिकित्सीय प्लेटलेट की हेमोस्टैटिक क्षमता परख लगाने के लिए विकसित किया गया है, पूर्व विवो 8 याथ्रोम्बस आकारिकी 9 पर कतरनी दर में गड़बड़ी के प्रभाव की जांच आणविक और सेल-जैविक तंत्रों में अंतर जो स्थिर आसंजन और शारीरिक थ्रोम्बस गठन (हेमोस्टैसिस) बनाम रोगी थ्रोम्बस गठन (घनास्त्रता) को लेकर बहुत अंतर हो सकता है और प्रवाह मॉडल के विकास को प्रेरित कर सकता है जो इन सबसुलुलर के वास्तविक-समय दृश्य के लिए अनुमति देते हैं। प्रक्रियाओं।
ऐसी प्रक्रिया का एक उदाहरण जिसके लिए ऐसी स्थापना बहुमूल्य होगी, अंतराल परमाणु पॉलीफोस्फेट (पुनः) वितरण और थक्केदार कारकों की भर्ती, समय-आश्रित प्रभाव को उजागर करने के लिए है, जो कि फाइब्रिन मूलभूत संरचना 10 पर है । अध्ययन अक्सर अंत-बिंदु के विश्लेषण तक ही सीमित होते हैं। वर्णित विधि का मुख्य उद्देश्य प्रवाह के तहत प्लेटलेट सक्रियण के दौरान होने वाली गतिशील उपसर्भक प्रक्रियाओं की रीयल-टाइम विज़ुअल जांच को सक्षम करना है।
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Protocol
यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर यूट्रेक्ट की स्थानीय मेडिकल एथिकल कमेटी ने इस अध्ययन के उन सहित, पूर्व विवो अनुसंधान उद्देश्यों के लिए रक्त के चित्रण को मंजूरी दी।
1. समाधान तैयारी
- 10 मिमी एचईपीईएस, 0.5 एमएम ना 2 एचपीओ 4 , 145 एमएम नाओक्ल, 5 एमएम केएलएल, 1 एमएम एमजीएसओ 4 , और 5.55 एमएम डी-डी-डी को भंग करके 4- (2-हाइड्रोक्सिथाइल) -1-पिपारसिथेनसल्फोनिक एसिड (हेपीस) टायरोड बफर तैयार करें। आसुत पानी में ग्लूकोज
- बफर के दो वेरिएंट करें: क्रमशः 6.5 और 7.4 पर पीएच स्तर सेट करें। प्रयोगों के प्रत्येक दिन के लिए ताज़ा बफर बनाएं। 10 एनजी / एमएल प्रोस्टेक्लीन सहित अनुपूरक जहां संकेत दिया गया।
- डिस्टिल्ड वॉटर में 50 एमएम ट्रिस और 150 एमएम नाक को भंग करके TRIS- बफरेड खारा (टीबीएस) तैयार करें और पीएच को 9.0 में समायोजित करें।
- 85 मिमी त्रि-सोडियम साइट्रेट, 71 एमएम साइट्रिक एसिड, और 111 एमएम डी-ग्लूकोस डिस्पोजेबल एसिड साइटेट डेक्सट्रोज़ (एसीडी) तैयार करें।टिल्ड वॉटर
- HEPES Tyrode के बफ़र, पीएच 7.4 में 2% (वी / वी) पैराफॉर्मालाहाइड (पीएफए) जोड़कर एक लगानेवाला समाधान तैयार करें। भंग करने के लिए गर्मी (50 - 70 डिग्री सेल्सियस) और पीएच को 7.4 पर सेट करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और स्टोर प्रयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर पिघलना।
- HEPES Tyrode के बफर में 1% (एम / वी) मानव सीरम एल्बूमिन (एचएसए) भंग करके अवरुद्ध बफर तैयार करें, पीएच 7.4
- ग्लिसरॉल के 12 ग्राम में 4.8 ग्राम पॉलीविनाल अल्कोहल जोड़कर और अच्छी तरह मिलाकर एक पॉलीविनाल अल्कोहल समाधान बनायें। डिस्टिल्ड वॉटर के 12 एमएल जोड़ें और इसे कमरे के तापमान पर एक चक्करदार पर रातोंरात छोड़ दें।
- 0.2 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.5 के 24 एमएल जोड़ें। 30 मिनट के लिए मिश्रण करते समय हीट 50 डिग्री सेल्सियस 1.25 ग्राम 1,4-डाइजैबिसिक्लो जोड़ें [2.2.2] ओकटाइन (डाबको) और अच्छी तरह से मिलाएं। 5 मिनट के लिए 1,500 xg पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला विभाज्य (1 एमएल 15-20 स्लाइड्स के लिए पर्याप्त है) और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एक बार में aliquots का उपयोग करें
2. कवर ग्लास तैयारी
- Degrease कवरचश्मा (25 x 50 मिमी 2 ) बिना उष्कृत क्रोमोसेल्फिक एसिड में रातोंरात इनक्यूबेट करके डिस्टिल्ड वॉटर के साथ कवर चश्मा कुल्ला और उन्हें ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सूखा।
- पैराफिन फिल्म को चौरसाई करके पानी की एक बूंद के साथ एक प्रयोगशाला बेंच के शीर्ष पर एक पैराफिन फिल्म (10 x 15 सेमी 2 ) की एक पट्टी का पालन करें और हवा को दूर करें। पैराफिन फिल्म पर 10 μg / ml VWF या 100 माइक्रोग्राम / एमएल फाइब्रिनोजेन की 80 μL की पिपेट। बूंदों पर चश्मा रखें; प्रोटीन समाधान कांच के पीछे की तरफ को कवर करने के लिए दो सतहों के बीच फैल जाएगा। कमरे के तापमान पर 1.5 घंटे के लिए सेते हैं (आरटी)
- पैराफिन फिल्म को निकालें और अवरुद्ध बफर के साथ एक 4-अच्छी तरह से थाली में लेपित पक्ष के साथ, उन्हें रखकर कवर चश्मा को ब्लॉक करें। 1 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। नियंत्रण के रूप में, कवर ग्लास को ब्लॉक करें जो कि वीडब्ल्यूएफ़ या फाइब्रिनोजेन के साथ लेपित नहीं है।
प्लेटलेट समृद्ध प्लाज्मा तैयार करना (पीआरपी)
नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, तीन परतें (ऊपर से नीचे तक) देखे जा सकते हैं: पीआरपी, सफेद रक्त कोशिकाओं और लाल रक्त कोशिकाएं। सुनिश्चित करें कि सफेद और लाल कोशिकाओं को शामिल न करें आमतौर पर, 9 एमएल रक्त ट्यूब के सेंट्रीफ्यूगिंग के बाद पीआरपी के 3 एमएल का संग्रह किया जा सकता है।
नोट: आमतौर पर, इस दूसरे सेंटीफ्यूगेशन चरण के बाद 2 एमएल एकत्र किया जा सकता है।
नोट: पतला पीआरपी का कुल मात्रा दाता के प्लेटलेट की संख्या पर निर्भर करता है। प्लेटलेट की संख्या दाताओं के बीच व्यापक रूप से भिन्न होती है, और पीआरपी कमजोर पड़ने के लिए एक व्यक्तिगत आधार पर मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। प्लेटलेट की गणना सामान्य माना जाता है जब 150,000 और 450,000 प्लेटलेट्स / μL के भीतर।
4. धोया प्लेटलेट्स की तैयारी
- एक सेल विश्लेषक का उपयोग करके पीआरपी में मतलब प्लेटलेट वॉल्यूम (एमपीवी) को निर्धारित करें।
नोट: यह प्लेटलेट प्री-एक्टिवेशन 11 का सूचक है प्लेटलेट्स को आराम करने के लिए सामान्य एमपीवी 7.5-11.5 एफएल 11 है । प्लेटलेट धोने की प्रक्रिया के दौरान एमपीवी को 1.5 एफएल से अधिक नहीं बढ़ाना चाहिए। - ब्रेक के बिना 400 xg और आरटी के 15 मिनट के लिए प्लेटलेट प्री-एक्टिवेशन और अपकेंद्रित्र को रोकने के लिए पीआरपी के लिए एसीडी का 1/10 वॉल्यूम जोड़ें। सु हटाएंपीआरएपी की मूल मात्रा में HEPES Tyrode के बफर, पीएच 6.5, में ध्यानपूर्वक और गोली को फिर से निलंबित करना।
- 10 माइग्रेट / एमएल की एकाग्रता में टीबीएस को जोड़कर प्रोस्टेसीक्लिन का एक विभाज्य पदार्थ पिघलाना; इसे बर्फ पर रखें
- प्लेटलेट सक्रियण को रोकने के लिए, फिर से निलंबित प्लेटलेटों को 10 एनजी / एमएल की अंतिम एकाग्रता में प्रोस्टासीक्लिन जोड़ने और ब्रेक के बिना 400 XG और RT के 15 मिनट के लिए तुरंत अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली को सावधानीपूर्वक HEPES Tyrode के बफर, पीएच 7.4 में निलंबित करें।
- प्लेटलेट्स की संख्या (चरण 3.5) की गणना करें और एमपीवी में बदलाव (चरण 4.1) निर्धारित करें (एमपीवी को 1.5 एफएल से अधिक नहीं बदलना चाहिए)
- एचईपीईएस टायरोड के बफर के साथ प्लेटलेट्स की संख्या को समायोजित करें, पीएच 7.4, 150,000 प्लेटलेट्स / μL की एकाग्रता के लिए। प्रयोगों से पहले आरटी पर 30 मिनट के लिए ठीक होने के लिए प्लेटलेट छोड़ें। पृथक्करण के बाद 4 घंटे के भीतर प्रयोगों के लिए धोया प्लेटलेट का प्रयोग करें।
5. फ्लो चैंबर विधानसभा
12 का इस्तेमाल होता है वाणिज्यिक रूप से निर्मित प्रवाह कक्षों की एक किस्म का उपयोग किया जा सकता है, जब तक कि वे एक आवरण कांच रख सकते हैं, जो आगे के विश्लेषण के लिए अधिमान्य रूप से हटाने योग्य है। वर्णित प्रयोगों के लिए प्रयुक्त प्रवाह कक्ष पॉली (मिथाइल मेथैक्र्रेलेट) से सूक्ष्मदर्शी निस्तारण चरण में ठीक से बना है। इसमें एक प्रवेश और आउटलेट ( चित्रा 1 ए - सी ; 1, 2), साथ ही एक वैक्यूम कनेक्शन ( चित्रा 1 ए और सी ; 3) शामिल हैं। एक अनुकूलित सिलिकॉन शीट ( चित्रा 1 ए और डी , 4) शीर्ष पर रखा गया है दो कट-आउट फॉर्म वैक्यूम चैनल ( चित्रा 1 ए और डी ; 5) कवर ग्लास को कवर करने के लिए ( चित्रा 1 ए ; 6) कसकर कक्ष में एक केंद्रीय कट आउट प्रवाह चैनल ( चित्रा 1 ए डी ; 7; 2.0 मिमी चौड़ाई और 0.125 मिमी ऊँचाई)। प्रवेश और आउटलेट प्रवाह चैनल से जुड़े हैं, और वैक्यूम वैक्यूम चैनल से जुड़ा है।
- आसुत जल के साथ प्रवाह कक्ष के शीर्ष को कवर करें और पानी पर चिकनी साइड के साथ अनुकूलित सिलिकॉन शीट रखें। शीट को स्थिति में रखते हुए अतिरिक्त पानी को हटाकर स्थिति में शीट फ्लोट करें।
नोट: यह सिलिकॉन शीट फिर से प्रयोग करने योग्य है (सिलिकॉन इसके निष्क्रिय गुणों के लिए जाना जाता है); आमतौर पर, प्लेटलेट्स इसे संलग्न करने के लिए नहीं देखा गया है। शीटों को डिटर्जेंट से साफ किया जा सकता है और जब तक सामग्री क्षतिग्रस्त नहीं हो जाती तब तक फिर से इस्तेमाल किया जाता है ( यानी , विशेष रूप से चैनलों के बीच के क्षेत्र में)। आम तौर पर, प्रति दिन कई प्रयोगों के साथ एक शीट 20 दिनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। - प्रवाह कक्ष में सिलिकॉन शीट का दृढ़ता से पालन करने के लिए शेष पानी को लुप्त होने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए प्रवाह कक्ष सेते हैं।
- एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के साथ, की एक बूंद जोड़ेंहेफ़्स ट्रायोड के बफर, पीएच 7.4, प्रवाह चैनल पर। कवर चैनल के नीचे लेपित किनारे के साथ कवर कांच (देखें अनुभाग 2), प्रवाह चैनल पर। वैक्यूम कनेक्शन में वैक्यूम पंप संलग्न करें ( आंकड़े 1 ए और सी ; 3)। ~ 10 केपीए दबाव लागू करें
6. प्लेटलेट्स के पूर्व धुंधला और एंटीबॉडी की तैयारी
- प्लेटलेट धुंधला हो जाना
- अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10 μg / mL डीएपीआई के साथ धोया प्लेटलेट सेते। अनबाउंड डीएपीआई को धोने और प्लेटलेट सक्रियण को रोकने के लिए, 10 एनजी / एमएल के अंतिम एकाग्रता में प्रोस्टासीक्लिन को जोड़ने और ब्रेक के बिना 400 एक्सजी और आरटी के 15 मिनट के लिए तुरंत सेंटीफ्यूज।
- एचईपीईएस टायरोड के बफर, पीएच 7.4 में प्लेटलेट गोली को 150,000 प्लेटलेट्स / μL की प्लेटलेट एकाग्रता में पुन: व्यवस्थित करें।
- एंटीबॉडीज की तैयारी
- एलेक्सा-लेबल वाले स्ट्रेप के साथ बायोटिन-लेबल एंटीबॉडी को मिलाएं1: 1 के दाढ़ अनुपात में टीविडिन उपयोग के पहले कमरे के तापमान पर न्यूनतम 10 मिनट के लिए सेते (चरण 7.6)।
नोट: बायोटिन लेबलिंग दक्षता विभिन्न बैचों के बीच भिन्न हो सकती है। लक्ष्य अणुओं के विज़ुअलाइज़ेशन के साथ समस्याएं होनी चाहिए, सफल बायोटिनिलेशन की पुष्टि के लिए नियंत्रण प्रयोगों को किया जाना चाहिए, साथ ही विशिष्ट बायोटिनिलेटेड एंटीबॉडी के लक्ष्य-बाध्यकारी गुणों के साथ।
- एलेक्सा-लेबल वाले स्ट्रेप के साथ बायोटिन-लेबल एंटीबॉडी को मिलाएं1: 1 के दाढ़ अनुपात में टीविडिन उपयोग के पहले कमरे के तापमान पर न्यूनतम 10 मिनट के लिए सेते (चरण 7.6)।
7. छिड़काव
- प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी, साथ ही माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर शुरू करें तालिका 1 में सूचीबद्ध सूक्ष्मदर्शी सेटिंग्स का उपयोग करें
नोट: माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में उचित प्रयोग लोड करके लाइव-सेल विज़ुअलाइज़ेशन और प्लेटलेट्स की रिकॉर्डिंग और चुना हुआ फ्लोरोसेंट लेबल वाला एंटीबॉडी और / या डाईज़ के लिए माइक्रोस्कोप और रिकॉर्डिंग सेटिंग आरंभ करें। आरटी पर प्रवाह प्रयोग करें - टयूबिंग के लिए 10-एमएल सिरिंज को जोड़कर इनलेट टयूबिंग को अवरुद्ध करें और 1% एचएसए ब्लॉ के शुभारंभकैलेट बफर इनलेट टयूबिंग में आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं एचईपीईएस टायरोड के बफर, पीएच 7.4, इनलेट टयूबिंग में लगाने से इनलेट टयूबिंग को कुल्ला।
- अवरक्त इनलेट टयूबिंग और अनुपचारित आउटलेट टयूबिंग से कनेक्ट करें, दोनों में 1.02 मिमी के व्यास और चैम्बर के प्रवेश और आउटलेट के लिए 20-30 सेमी लंबाई। आउटलेट टयूबिंग में 10-एमएल सिरिंज (या अधिक सटीकता के लिए कम मात्रा) से कनेक्ट करें। सिरिंज पंप पर पावर
नोट: सिरिंज का व्यास, पंप पर सेट प्रवाह दर के संयोजन में, वॉल्यूमेट्रिक फ्लो दर निर्धारित करता है। प्रवाह चैनल के सतह क्षेत्र के साथ, कतरनी दर को सूत्र 13 के अनुसार गणना किया जा सकता है नीचे। इसलिए, सिरिंज पंप की प्रवाह दर को बदलकर या प्रवाह चैनल के आयाम को बदलकर कतरनी दर में हेरफेर करना संभव है। धमनी रक्त के प्रवाह के लिए आमतौर पर 800-1,600 एस -1 की एक कतरनी दर, जबकि शिरापरक रक्त के लिए 25 - 100 एस -1 मॉडलबहे। इस सेटअप के लिए, 7.5 μL / मिनट का प्रवाह दर 25 एस -1 के कतरनी दर में परिणाम
शियर दर = 6 क्यू / एच 2 w s -1 में
जिसमें: Q = बड़ा फ्लो रेट (एमएल / एस), एच = ऊंचाई चैनल (सेमी) (0.0125 सेमी, यह सिलिकॉन शीट की मोटाई है), चौड़ाई = चौड़ाई वाला चैनल (सेमी) (इस कक्ष में 0.2 सेमी)। - एक 100X उद्देश्य (1,000X के कुल प्रवर्धन) पर विसर्जन तेल की एक बूंद रखें और ग्लास सतह के नीचे के साथ माइक्रोस्कोप पर कक्ष को माउंट करें।
- इनलेट टयूबिंग को एचईपीईएस टायरोड के बफर युक्त एक ट्यूब में रखें, पीएच 7.4। सिस्टम से हवा को निकालने के लिए आउटलेट टयूबिंग से जुड़े सिरिंज के सवार को मैन्युअल रूप से खींचकर समाधान के माध्यम से समाधान खींचें। सिरिंज पंप ( चित्रा 1 बी और सी ; 8) में सिरिंज रखें और सवार को कसने के लिए संक्षेप में पंप चलाएं और स्थिर प्रवाह सुनिश्चित करें।
- प्लेटलेट निलंबन या पीआरपी में एंटीबॉडी और / या डाईज को ध्यान से जोड़नाप्लास्टिक विंदुक के साथ मिश्रण करें, और मिश्रण को 1.5-एमएल ट्यूब में स्थानांतरण करें।
नोट: कतरनी दर 25 एस -1 (7.5 μL / मिनट) पर ठेठ 30 मिनट की छिड़काव के लिए, कम से कम 225 μL प्लेटलेट निलंबन की आवश्यकता होती है। प्रतिनिधि परिणामों के लिए इस्तेमाल एंटीबॉडीज़ तालिका 2 में दिखाए गए हैं - एचपीईएस ट्रायोड के बफर, पीएच 7.4 से 1.5 एमएल ट्यूब से या पीआरपी या धोया प्लेटलेट्स और एंटीबॉडी और / या डाईज ( चित्रा 1 बी और सी ; 9) से निचोड़ते हुए इनलेट टयूबिंग को हटा दें।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि, टयूबिंग को स्थानांतरित करते समय, टयूबिंग में प्रवेश करने से हवा को रोकने के लिए टयूबिंग निचोड़ा जाता है (वायु को दबाकर) इसी प्रकार से इनलेट टयूबिंग को दूसरी ट्यूब में ले जाकर आगे के चरणों में विभिन्न अभिकर्मकों के साथ अनुमत प्लेटलेट्स का इलाज करना संभव है। संभावित उपयोगी अभिकर्मकों की एक सूची तालिका 3 में प्रदान की गई है। - "लाइव विज़ुजिएटियो का चयन करेंएन "विकल्प, लेपित कवर गिलास की सतह पर माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करते हैं, और प्लेटलेट्स प्रवाह कक्ष में पहुंचने तक 1600 एस -1 (484 μL / मिनट) की कतरनी दर पर पंप शुरू करते हैं। इस समय, कतरनी दर को 25 एस -1 तक वापस करने के लिए सिरिंज पंप की सेटिंग को 7.5 μL / मिनट की प्रवाह दर में बदल कर।
- आवरण कांच के लेपित तरफ की सतह की निगरानी करें, जब तक प्लेटलेटलेट का पालन करना शुरू नहीं हो जाता तब तक इंतजार करें, इस प्लेटलेट पर माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें, और सॉफ्टवेयर में प्रयोग की शुरुआत करके रिकॉर्डिंग शुरू करें। यहां उपयोग की जाने वाली रिकॉर्डिंग सेटिंग्स के लिए तालिका 1 देखें।
- लाइव रिकॉर्डिंग नेत्रहीन का पालन करें 30 मिनट के बाद, सिरिंज पंप को रोकें।
नोट: सुनिश्चित करें कि प्रयोग के दौरान प्लेटलेट फ़ोकस में बने रहें। आमतौर पर, 20-30 प्लेटलेट 1,000x के आवर्धन पर देखने के क्षेत्र में संलग्न होते हैं; यह संपूर्ण प्रवाह चैनल में करीब 2,000-3,000 प्लेटलेट है। - फिक्सेशन का उपयोग करनाप्रवाह कक्ष (वैकल्पिक)
- जब सिरिंज पंप बंद हो जाने के बाद प्रवाह बंद हो जाता है, तो इनलेट टयूबिंग (एयर-फ्री) को लगानेवाला समाधान में स्थानांतरित करें। पंप को पुनरारंभ करें और चरण 7.8 में उल्लिखित समान प्रवाह दर पर न्यूनतम 10 मिनट के लिए चैनल के माध्यम से निर्धारण बफर को प्रवाह करें।
- माइक्रोस्कोप से कक्ष निकालें, ग्लास से विसर्जन तेल को साफ करें, वैक्यूम को डिस्कनेक्ट करें, और एक 18 जी सुई के साथ कक्ष से कवर गिलास को ध्यान से हटा दें
नोट: सिलिकॉन शीट को तोड़ने और हानि करने से कवर कांच को रोकें। - डिस्टिल्ड वॉटर के साथ प्री-गीलेटेड ऊतक के ऊपर एक 4-अच्छी तरह से थाली में कवर स्लाइड (ऊपर की ओर निर्देशित कोशिकाओं के साथ) रखें।
नोट: यह कवर ग्लास को अच्छी तरह से सतह का पालन करने से रोकता है और सुखाने से रोकता है। - कवर गिलास के ऊपर लगानेवाला समाधान के 750 μL पिपेट और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। यदि नमूने का विश्लेषण सीधे नहीं किया जा सकता है,स्थिर स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए उन्हें 4% सी पर 0.5% पीएफए (हेपस टरोड के बफर, पीएच 7.4 से पतला) में रखें। इमेजिंग के लिए कवर ग्लास पर प्रक्रिया करने के लिए अनुभाग 8 पर जाएं।
- उपयोग करने के बाद, डिब्बाबंद समाधान में चैम्बर, टयूबिंग और शीट कुल्ला, और एक डिटर्जेंट समाधान में रातोंरात सेते हैं। कक्ष और अन्य घटकों के पुन: उपयोग से पहले, आसुत जल के साथ कुल्ला।
- सभी मेटाडेटा वाले सूक्ष्मदर्शी कच्चे डेटा फ़ाइलों को सहेजें। आवश्यक होने पर, फिल्मों को .MOV, h.264 संपीड़ित, या .avi को असम्पीडित करें। JPEG या TIF फ़ाइलों के रूप में अलग फ़्रेम सहेजें
8. Confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयारी
- कवच के चश्मे को नई 4-अच्छी तरह प्लेटों में ट्रांसफर करें और 5 एमएल हेफ़ेस टायरोड के बफर के साथ 5 बार कुल्ला, पीएच 7.4। अवरोधक बफर के 3 एमएल / अच्छी तरह से जोड़ें और आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
- अवरुद्ध बफर निकालें; HEPES Tyrode के बफर में 3 एमएल / वेल्यू 0.15% ग्लिसिन (एम / वी) में जोड़ें, पीएच 7.4; और आर पर 15 मिनट के लिए सेते हैंटी
- ग्लाइसीन समाधान निकालें और 3 एमएल / अवरुद्ध बफर के ठीक से 5 बार धो लें। वैकल्पिक रूप से, अतिरिक्त धुंधला के लिए बफर अवरुद्ध करने में पतला फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडीज़ जोड़ें। अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
- अवरुद्ध बफर के साथ 5 बार और आसुत जल के साथ 2 बार धो लें। कोशिकाओं को छूने के बिना, एक ऊतक (आवक के किनारों से) के साथ अतिरिक्त तरल को निकालकर गिलास सूखा।
- एक सूक्ष्मदर्शी स्लाइड पर 60 μL पॉलीविनॉल अल्कोहल समाधान के पिपेट। ड्रॉप के ऊपर कोशिकाओं के साथ, कवर कांच रखें और दो सतहों के बीच पॉलीविनाल अल्कोहल फैल जाने दें। अंधेरे में आरटी पर रातोंरात सेते हैं।
- Confocal माइक्रोस्कोपी 14 द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण।
- सभी मेटाडेटा वाले रिकॉर्ड किए गए स्टैक डेटा की कच्ची डेटा फ़ाइलों को सहेजें। जब आवश्यक हो, कच्चे डेटा फ़ाइलों को MOV, h.264 संपीड़ित, या .avi असम्पीडित फ़ाइलों में संसाधित करें JPEG या TIF फ़ाइलों के रूप में अलग से ढेर सहेजें
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Representative Results
चित्रा 1 प्रवाह कक्ष और प्रायोगिक सेटअप की छवियों को दिखाता है; सिलिकॉन शीट की स्थिति और आयाम; और टयूबिंग कनेक्शन चित्रा 2 , प्रवाह कक्ष के आयामों पर विवरण प्रदान करता है। चित्रा 3 और मूवी 1 प्लेटलेट आसंजन की छवियों की एक समय-श्रृंखला दिखाती है और स्थिर वीडब्ल्यूएफ़ पर फैल रहा है। सीडी 663 एक ट्रांसमीटरब्रेन प्रोटीन है जो प्लेटलेट 15 को आराम के इंट्रासेल्युलर घने ग्रैन्यूल के झिल्ली में डाला जाता है प्लेटलेट की सतह पर इसका समय पर निर्भर जुड़ाव हरे रंग में दिखाया गया है। इसी प्रकार, पी-चयनिन (पीएसएल) एक प्लेटफ्लोमिबेन प्रोटीन है जिसे प्लेटलेटों के आराम के इंट्रासेल्युलर α-ग्रैन्यूल्स के झिल्ली में डाला गया है। प्लेटलेट की सतह पर इसका समय पर निर्भर जुटाई नारंगी में दिखाया गया है। चित्रा 3 बी 45 डिग्री कोण पर एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है, एक प्रवाह प्रयोग के बाद confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहण। मूवी 2 एक ही प्रयोग की झुकाव श्रृंखला दिखाती है ध्यान दें कि सीडी 63 मुख्य रूप से केंद्रीय ग्रेनुलोमेरे में स्थित है, जबकि पी-चयनिन पूरे कोशिका निकाय पर वितरित किया जाता है और किनारों पर ध्यान केंद्रित होता है। चित्रा 4 ए और मूवी 3 प्लेटलेट सतह (हरे) पर सीडी 663 के समय पर निर्भर जुटाई दिखाती है। इन प्रयोगों में, प्लेटलेट्स (जिन पर परमाणु डीएनए नहीं है) डीएपीआई (नीला) से पहले से जुड़े थे, जो घने ग्रैन्यूल 16 में पॉलीफोस्फेट को दागते हैं। उल्लेखनीय रूप से, घने ग्रेन्युल रिलीज (एकल-कोशिका के विश्लेषण को चित्रा 4 बी और मूवी 4 में दिखाया गया है) के स्पष्ट संकेत के बावजूद, पॉलीफोस्फेट इन प्लेटलेट्स के बाहर या बाहर रखा गया है। चित्रा 5 और मूवी 5 वीडब्ल्यूएफ़ के समय-आश्रित गतिशीलता (या भर्ती) को दिखाती है, जो एक थ्रोबोजेनिक मल्टइमेरिक प्रोटीन 17 α-ग्रैन्यूल्स में संग्रहीत, प्लेटलेट सतह (हरा) में। पॉलीफोस्फेट के समान, वीडब्लूएफ सक्रिय प्लेटलेट्स की सतह से जुड़ा रहता है।
चित्रा 1: फ्लो चेंबर और प्रायोगिक सेटअप। ( ए ) इनलेट और आउटलेट (1 और 2), एक वैक्यूम कनेक्शन (3) जिस पर सिलिकॉन शीट (4) रखा गया है, के साथ प्रवाह कक्ष डिजाइन की छवि। सिलिकॉन शीट में दो बाहरी कटआउट (5) को कवर ग्लास संलग्न करने के लिए वैक्यूम चैनल बनाते हैं (6)। एक केंद्रीय कटआउट (7) प्रवाह चैनल बनाता है ( बी ) प्रयोगात्मक सेटअप की छवि। इनलेट और आउटलेट (1 और 2), सिरिंज पंप (8), और नमूना धारक (9)। ( सी ) प्रयोगात्मक सेटअप के योजनाबद्ध अवलोकन; संख्याएं ए और बी में समान हैं। ( डी ) आयाम के साथ योजनाबद्ध सिंहावलोकन अनुकूलित कट सिलिकॉन शीट का ( ई ) पाली (मिथाइल मेथैक्रललेट) प्रवाह कक्ष के सामान्य योजनाबद्ध अवलोकन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: फ्लो चैंबर की विस्तृत खाका प्रवाह कक्ष में एक पाली (मिथाइल मेथैक्र्रेलेट) ब्लॉक (1) , वैक्यूम इनलेट (2) के लिए एक सीधे पॉलीओक्सीमाइथलीन डालें, और नमूना इनलेट और आउटलेट (3) के लिए दो एंग्लिड पॉलीओक्साइमिथिलीन आवेषण होते हैं। एंग्लिड पॉलीओक्सीमाइथलीन सम्मिलन में 1.07 मिमी के व्यास के साथ, धातु केशिका ट्यूब होते हैं। सीधे सम्मिलन में 1.3 मिमी व्यास के साथ केशिका ट्यूब होता है। 658 / 55658fig2large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: प्लेटलेट फैलाव और डिग्रानुलेशन पर immobilized वॉन विलेब्रांड फैक्टर। ( ए ) सीडी 663 और पी-चयन के समय-पर-निर्भर जुटाना प्लेटलेटों के फैल और डिगानुलेटिंग की सतह पर। सफेद स्केल बार (ऊपरी बाएं) 10 माइक्रोन का संकेत करता है ( बी ) प्रतिनिधि confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि एक 45 ° कोण पर। सफेद स्केल पट्टी (निचला बायीं तरफ) 2 माइक्रोन दर्शाता है ग्रीन, सीडी 63; नारंगी, पी-चयन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
55658 / 55658fig4.jpg "/>
चित्रा 4: प्लेटलेट फैलाव, डीग्रेन्युलेशन और गतिशील ग्रैनल्स की मोबिलिटी ऑन इमीबिलिज्ड फ़िब्रिनोजेन। ( ए ) प्लेटलेट की सतह पर सीडी 663 और पॉलीफोस्फेट के समय पर निर्भर जुटाई सफेद स्केल बार (ऊपरी बाएं) 10 माइक्रोन का संकेत करता है ( बी ) एकल प्लेटलेट के समय श्रृंखला (टी = 0 सतह के पहले आसंजन को दर्शाता है)। सफेद स्केल बार (निचला दायां) 2 माइक्रोन दर्शाता है ग्रीन, सीडी 63; ब्लू, डीएपीआई इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 5: स्थलीकृत फाइब्रिनोजेन की प्लेटलेट सतह पर फोन्स विलेब्रांड फैक्टर की भूतल एसोसिएशन। प्लेटलेट की सतह पर वीडब्ल्यूएफ़ का समय पर निर्भरता (या भर्ती) टीवह सफेद स्केल बार (ऊपरी बाएं) 5 माइक्रोन इंगित करता है ग्रीन, वीडब्ल्यूएफ़ इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
| सेटिंग | मूल्य |
| एक्सपोजर टाइम एफआईटीसी (एलेक्सा 488) | 200 एमएस / 300 एमएस |
| एलईडी 488 तीव्रता एफआईटीसी (एलेक्सा 488) | 50% |
| एक्सपोजर टाइम डीआईसी | 30 एमएस |
| वोल्टेज हलोजन दीपक | 4.5 वोल्ट |
| एक्सपोजर टाइम TRITC (एलेक्सा 546) | 400 एमएस |
| एलईडी 555 तीव्रता एफआईटीसी (एलेक्सा 546) | 50% |
| एक्सपोजर टाइम डीएपीआई | 500 एमएस |
| एलईडी 365 तीव्रता | 50% |
| फ़िल्टर्सेट एफआईटीसी | फ़िल्टर 10 |
| फ़िल्टसेट टीआरटीसी | फ़िल्टर 20 |
| फ़िल्टसेट डीएपीआई | फ़िल्टर्स 01 |
| लक्ष्य | अल्फा प्लान-फ़्लुअर 100x / 1.45 ऑयल |
| फ्रेम दर, रिकॉर्डिंग समय | 1 फ्रेम / 10 एस, 30 मिनट |
| फ़ाइल संपीड़न फिल्में | एमओवी (एच .264), एवीआई (असम्पीडित) |
| फ़ाइल संपीड़न चित्र | जेपीईजी, टीआईएफ |
तालिका 1: माइक्रोस्कोप सेटिंग्स। प्रतिनिधि प्रयोगों के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग।
| लक्ष्य | एंटीबॉडी / डाई | एकाग्रता |
| CD63 | <टीडी> एंटी-सीडी 63-बायोटिन *)325 एनजी / एमएल | |
| पी selectin | एंटी-सीडी 62 पी बायोटिन **) | 90 एनजी / एमएल |
| डीएनए | DAPI | 10 ग्राम / एमएल |
| VWF | मानव-विरोधी वीडब्ल्यूएफ़-एफआईटीसी | 5 μg / एमएल |
| *) एंटी-सीडी 63-बायोटिन एंटीबॉडी स्ट्रेप्टिविडिन-एलेक्सा 488 के साथ मिश्रित अनुपात में 1: 1 का उपयोग करने से पहले मिश्रित है | ||
| **) एंटी-सीडी 62 पी-बायोटिन एंटीबॉडी स्ट्रेप्टिविडिन-एलेक्सा 546 के साथ मिश्रित अनुपात 1: 1 का उपयोग करने से पहले मिश्रित अनुपात में मिलाया जाता है | ||
तालिका 2: एंटीबॉडी और रंजक दिखाए गए प्रतिनिधि प्रयोगों के लिए अनुशंसित एंटीबॉडी और डाई सांद्रता।
| अभिकर्मक श्रेणी | उदाहरण कंपोunds |
| प्लेटलेट एगोनिस्ट्स | थ्रोम्बिन, एडीपी, पीएआर -1 या -4 सक्रिय पेप्टाइड्स, यू 46619, थ्रोम्बॉक्सैन ए 2, एडीपी |
| एंजाइम अवरोधक | हिरडिन, पीपीएके, हेपरिनोइड्स (अप्रत्यक्ष), मकई ट्रिप्सिन अवरोधक, सोयाबीन ट्रिप्सिन अवरोधक |
| रिसेप्टर विरोधी | एंटी-ग्लाइप्रोटीन 1 बी, एंटी-ग्लाइकोप्रोटीन VI; क्लॉपिडोग्रेल, (चक्रीय) आरजीडी युक्त पेप्टाइड्स |
| सक्रियण अवरोधक | एस्पिरिन pretreatment, निर्धारण |
तालिका 3: संभावित उपयोगी अभिकर्मकों
पूरक फिल्में: मूवी 1: प्लेटलेट की छवियों की समय-श्रृंखला ( चित्रा 1 देखें), मूवी 2: चित्रा 3 बी की झुकाव श्रृंखला, मूवी 3: प्लेटलेट पर सीडी 663 का समय पर निर्भर जुटाईसतह ( चित्रा 4 देखें), मूवी 4: सिंगल-सेल विश्लेषण का समय श्रृंखला ( चित्रा 4 बी देखें), मूवी 5: वीडब्ल्यूएफ के समय पर निर्भर जुटाई ( चित्रा 5 देखें)।
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Discussion
दुनियाभर में, घनास्त्रता मौत और रोग का एक प्रमुख कारण है, और प्लेटलेट्स इसके विकास में एक केंद्रीय भूमिका निभाती हैं। यह काम प्रवाह के तहत प्लेटलेट डीग्रेन्युलेशन के लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन करता है। आम तौर पर माना जाता है कि, जब प्लेटलेट सक्रिय हो जाते हैं, तो सभी कणिक सामग्री को सीधे समाधान में छोड़ दिया जाता है। साथ के परिणाम बताते हैं कि यह मामला जरूरी नहीं है। आसंजन और degranulation के दौरान, प्लेटलेट्स polyphosphate ( चित्रा 4 ) की एक महत्वपूर्ण राशि को बरकरार रखती है। इसके अतिरिक्त, बहुप्रभावित प्रोटीन VWF प्लेटलेट की सतह से डीग्रेन्युलेशन ( चित्रा 5 ) के बाद जुड़ा हुआ है। यह इंगित करता है कि आणविक तंत्र जो प्लेटलेट ग्रेन्युल डीग्रेन्युलेशन को नियंत्रित करते हैं, आमतौर पर ग्रहण किए जाने की तुलना में सूक्ष्म होते हैं।
प्रवाह के तहत प्लेटलेट डीग्रेन्युलेशन के लाइव-सेल इमेजिंग को सक्षम करने के लिए, प्रायोगिक शर्तों को प्लेटलेट एकत्रीकरण न्यूनतम रखने के लिए चुना गया था। प्लेटलेट देश150,000 प्लेटलेट्स / μL के टीएस का इस्तेमाल किया गया था। यह सामान्य श्रेणी (150,000-450,000 प्लेटलेट / μL) के निचले अंत में है। इसके अलावा, प्लेटलेट आसंजन और फैलने का अध्ययन स्थिर वीडब्ल्यूएफ़ या फाइब्रिनोजेन पर किया गया, जिससे हल्के प्लेटलेट सक्रियण (उदाहरण के लिए, कोलेजन) के विपरीत हो। धोया प्लेटलेट्स के अध्ययन में, कतरनी दर बढ़ने से इन कोशिकाओं को प्रवाह के केंद्र में स्थानांतरित किया जाता है। यह आसंजन के साथ हस्तक्षेप करता है और बाद में फैलता है और डीग्रेन्युलेशन की जांच को जटिल बनाता है।
शारीरिक हेमोस्टेसिस में, प्लेटलेट मार्जिन महत्वपूर्ण है। यह प्रक्रिया एरिथ्रोसाइट्स द्वारा संचालित होती है, यह समझाते हुए कि कम एनीमिया कभी-कभी एक खून बह रहा डायथेसिस के साथ क्यों होता है। प्रस्तुत तकनीक की एक सीमा यह है कि प्लेटलेट डीग्रेन्युलेशन का दृश्य (प्रस्तुत सामग्री और अभिकर्मकों के साथ) लाल रक्त कोशिकाओं द्वारा परेशान है। प्लेटलेट फ़ंक्शन कतरनी तनाव से प्रभावित होता है, जो द्रव (μ) की चिपचिपाहट का एक कार्य है, साथ ही साथकतरनी दर का इसलिए, तुलनात्मक चिपचिपाहट ( यानी, धोया गया प्लेटलेट्स, पुनर्निर्माण रक्त, पीआरपी, या संपूर्ण रक्त) के समाधान में प्रवाह मॉडल में प्लेटलेट फ़ंक्शन का अध्ययन करने की सिफारिश की जाती है।
इन प्रयोगों को करते समय कई व्यावहारिक कारक हैं। सबसे पहले, प्रतिदीप्ति संकेत जोरदार फोकस क्षेत्र से प्रभावित हैं। यदि खुर्दबीन फोकस में नहीं है, तो संकेत आसानी से धुंधला हो सकता है या खो सकता है। प्रवाह चैनल में प्लेटलेटों के आने से पहले, चैनल पर ही ध्यान केंद्रित करना सर्वोत्तम होता है (सिलिकॉन शीट / प्रवाह चैनल की दीवार के किनारे से शुरू होता है)। जब प्लेटलेट्स का पालन करना शुरू हो जाता है, तो इस आसंजन घटना पर ध्यान केंद्रित करें। चिंता का दूसरा मुद्दा कुछ फ्लोरायोफोर्स ( जैसे, एफआईटीसी) की विरंजन है। दोहराया उत्तेजना संकेत की हानि के लिए नेतृत्व करेंगे, जांच परेशान। इन अवरोधों को अधिक स्थिर फ्लोरोफोर्स का उपयोग करके, रोमांचक एलईडी प्रकाश की तीव्रता को कम करके, समाप्ति को छोटा करकेOsure times, और / या फ्रेम दर को कम करने
यहाँ वर्णित मॉडल बहुत अधिक स्थिर प्रोटीन और विभिन्न प्रवाह दरों पर प्लेटलेट प्रतिक्रियाओं का विस्तृत अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी है। संभावित रूप से, इस पद्धति का उपयोग सक्रिय एंडोथिलियल कोशिकाओं 18 के साथ उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। तकनीकी प्रगत जो विशेष प्रवाह कक्षों के लचीले डिजाइनों की अनुमति देते हैं, वर्तमान में जैव-अनुकूलता अध्ययन 1 9 के लिए अवसर खोल रहे हैं। प्रवाह के नीचे प्लेटलेट जेटी के लाइव-सेल इमेजिंग प्लेटलेट आसंजन प्रतिक्रिया की जटिलता पर बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रकट करेंगे। अंत में, इन अनुभवों को विकास प्रायोगिक प्रवाह मॉडलों के लिए जाना चाहिए, जो प्लेटलेट फ़ंक्शन की संयुक्त जांच और जमावट प्रणाली पर प्रभाव की अनुमति देते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
सीए-इन्हिबिटर कमियों (हैई), स्टिचिंग वीरिएडन वैन हेट यूएमसी यूट्रेक्ट, और लैंडस्टीयर फाउंडेशन फॉर ब्लड ट्रान्सफ्यूजन रिसर्च (एलएसबीआर) के लिए अंतर्राष्ट्रीय रोगी संगठन से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
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