Summary
Эта работа описывает метод флуоресцентной микроскопии для изучения адгезии, распространения и секреции тромбоцитов в потоке. Эта универсальная платформа позволяет исследовать функцию тромбоцитов для механистических исследований тромбоза и гемостаза.
Abstract
Тромбоны крови являются важными игроками в гемостазе, образованием тромбов для герметизации сосудистых нарушений. Они также участвуют в тромбозе, образовании тромбов, которые закрывают сосудистую систему и повреждают органы, что приводит к опасным для жизни последствиям. Это мотивирует научные исследования функции тромбоцитов и разработки методов отслеживания клеточно-биологических процессов, происходящих в условиях потока.
Для изучения адгезии и агрегации тромбоцитов имеются две модели потока, два ключевых явления в биологии тромбоцитов. В этой работе описывается метод исследования дегрануляции тромбоцитов в реальном времени при потоке во время активации. В способе используется проточная камера, соединенная с установкой шприцевого насоса, которая помещается под широковолновым инвертированным светодиодным флуоресцентным микроскопом. Описанная здесь установка позволяет одновременно возбуждать множественные флуорофоры, которые доставляются флуоресцентно мечеными антителами или флуоресценциейКрасителей. После экспериментов по визуализации с живой клеткой покровные стекла могут быть дополнительно обработаны и проанализированы с использованием статической микроскопии ( например, конфокальной микроскопии или сканирующей электронной микроскопии).
Introduction
Тромбоциты представляют собой клетки, которые циркулируют в кровотоке. Их основная функция заключается в том, чтобы запечатать сосудистые нарушения на участках травмы и предотвратить потерю крови. На этих участках повреждения субэндотелиальные волокна коллагена подвергаются воздействию и затем покрываются мультимерным белком, фактором фон Виллебранда (VWF). VWF взаимодействует с тромбоцитами, циркулирующими в механизме, который зависит от комплекса гликопротеина Ibα-IX-V на поверхности клетки 1 , замедляя скорость тромбоцитов. Это особенно важно при высоких скоростях сдвига. Тромбоциты впоследствии подвергаются морфологическим изменениям, получая активирующие импульсы из коллагена. Это приводит к необратимому распространению и, в конечном итоге, к агрегации тромбоцитов. Оба процесса зависят от секреции содержимого гранул для облегчения перекрестных помех тромбоцитов. Среди прочего, α-гранулы тромбоцитов содержат фибриноген и VWF для содействия адгезии тромбоцитов и к мостикуТромбоцитов вместе в зависимости от интегрина. Плотные гранулы с тромбоцитами содержат неорганические соединения 2 , включая кальций и аденозиндифосфат (ADP), которые помогают усилить активацию тромбоцитов. Кроме того, тромбоциты содержат медиаторы (аллергического) воспаления 3 , комплементарные контрольные белки 4 и факторы ангиогенеза 5 , 6 , поднимая вопросы о том, как и как эти вещества дифференциально выделяются в различных условиях.
С 1980-х годов исследование функции тромбоцитов в моделях течения было ценным для исследования тромботических механизмов 7 . С тех пор был достигнут значительный технический прогресс, и в настоящее время разрабатываются модели потоков, включающие образование фибрина, для анализа гемостатического потенциала терапевтических концентратов тромбоцитов ex vivo 8 илиИсследовать влияние нарушений в скоростях сдвига на морфологию тромба 9 . Различия в молекулярных и клеточно-биологических механизмах, которые приводят к устойчивой адгезии и физиологическому образованию тромбов (гемостаз) по сравнению с патологическим образованием тромбов (тромбоз), могут быть очень тонкими и мотивировать разработку моделей течения, которые позволяют визуализировать эти субклеточные в реальном времени процессы.
Примером процесса, для которого такая установка была бы ценной, является (повторное) распределение внутриклеточного полифосфата и вербовка факторов свертывания, чтобы выявить зависящее от времени воздействие, которое оно оказывает на ультраструктуру фибрина 10 . Исследования часто ограничиваются анализом конечных точек. Основная цель описанного метода - дать возможность визуального исследования динамических субклеточных процессов в реальном времени, происходящих во время активации тромбоцитов в потоке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Местный Медицинский Этический Комитет Университета Медицинский Центр Утрехт одобрил рисунок крови для исследовательских целей ex vivo , в том числе исследований этого исследования.
1. Подготовка раствора
- Приготовили бутан 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES) Tyrode путем растворения 10 мМ HEPES, 0,5 мМ Na 2 HPO 4 , 145 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgSO 4 и 5,55 мМ D- Глюкозы в дистиллированной воде.
- Сделайте два варианта буфера: установите уровни pH 6,5 и 7,4 соответственно. Сделайте свежий буфер для каждого дня экспериментов. Дополните 10 мкг / мл простациклина, если это указано.
- Подготовить забуференный TRIS физиологический раствор (TBS) путем растворения 50 мМ Трис и 150 мМ NaCl в дистиллированной воде и довести рН до 9,0.
- Приготовить кислотную цитратную декстрозу (ACD) путем растворения 85 мМ цитрата натрия, 71 мМ лимонной кислоты и 111 мМ D-глюкозы вВода.
- Подготовьте фиксирующий раствор, добавив 2% (об. / Об.) Параформальдегида (PFA) в буфер HEPES Tyrode, pH 7,4. Растворить до 50 - 70 ° C и установить рН до 7,4. Аликвоту и хранить при -20 ° C. Оттепель при 37 ° C перед использованием.
- Подготовьте блокирующий буфер, растворяя 1% (м / об) человеческий сывороточный альбумин (HSA) в буфере HEPES Tyrode, pH 7,4
- Сделайте раствор поливинилового спирта, добавив 4,8 г поливинилового спирта к 12 г глицерина и хорошо перемешайте. Добавить 12 мл дистиллированной воды и оставить ее на ротаторе при комнатной температуре в течение ночи.
- Добавляют 24 мл 0,2 М Трис-HCl, pH 8,5. Нагреть до 50 ° С при перемешивании в течение 30 мин. Добавить 1,25 г 1,4-диазабицикло [2.2.2] октана (DABCO) и хорошо перемешать. Центрифуга при 1500 мкг в течение 5 мин. Аликвоту супернатант (1 мл достаточно для 15-20 слайдов) и хранить при -20 ° C. Используйте аликвоты один раз.
2. Подготовка стекла к стеклу
- Обезжиривающее покрытие(25 х 50 мм 2 ) путем инкубации в течение ночи в неразбавленной хромосульфоновой кислоте. Промойте покровные стекла дистиллированной водой и высушите их в течение ночи при температуре 60 ° C в духовке.
- Прикрепите полосу парафиновой пленки (10 x 15 см 2 ) на верхней части лабораторной скамьи с каплей воды и удалите воздух, сгладив парафиновую пленку. Пипетируйте 80 мкл капель 10 мкг / мл VWF или 100 мкг / мл фибриногена на парафиновую пленку. Поместите очки на капли; Белковый раствор будет распространяться между двумя поверхностями, чтобы покрыть всю заднюю сторону стекла. Инкубируйте в течение 1,5 ч при комнатной температуре (RT).
- Удалите парафиновую пленку и заблокируйте покровные стекла, поместив их, с покрытой стороной вверх в 4-луночный планшет с блокирующим буфером. Инкубируйте в течение 1 часа при 37 ° C или в течение ночи при 4 ° C. В качестве контроля заблокируйте покрытие, которое не покрыто VWF или фибриногеном.
3. Получение плазмы, богатой тромбоцитами (PRP)
ПРИМЕЧАНИЕ. После центрифугирования можно наблюдать три слоя (сверху вниз): PRP, лейкоциты и эритроциты. Не включайте белые и красные ячейки. Как правило, 3 мл PRP можно собирать после центрифугирования пробирки объемом 9 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Как правило, после второй стадии центрифугирования можно собирать 2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Общий объем разбавленного PRP зависит от количества тромбоцитов донора. Количество тромбоцитов широко варьируется между донорами, а разведение PRP требует оценки на индивидуальной основе. Количество тромбоцитов считается нормальным, когда в пределах 150 000 и 450 000 тромбоцитов / мкл.
4. Получение промытых тромбоцитов
- Определите средний объем тромбоцитов (MPV) в PRP с помощью анализатора клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ. Это индикатор предварительной активации тромбоцита 11 . Нормальный MPV для покоящихся пластинок составляет 7.5-11.5 fL 11 . MPV не должен увеличиваться более чем на 1,5 фл во время процедуры промывки тромбоцитов. - Добавьте 1/10 объема ACD в PRP для предотвращения предварительной активации тромбоцитов и центрифугирования в течение 15 минут при 400 xg и RT без тормоза. Удалить suПернатант и повторно суспендировать таблетку в буфере HEPES Tyrode, pH 6,5, до первоначального объема PRP.
- Оттереть аликвоту простациклина путем добавления TBS до концентрации 10 мкг / мл; Держите его на льду.
- Чтобы предотвратить активацию тромбоцитов, добавьте простациклин с конечной концентрацией 10 нг / мл к повторно суспендированным тромбоцитам и сразу же центрифугируйте в течение 15 минут при 400 xg и RT без тормоза. Удалите супернатант и повторно суспендируйте таблетку осторожно в буфере HEPES Tyrode, pH 7,4.
- Подсчитайте количество тромбоцитов (шаг 3.5) и определите изменение MPV (шаг 4.1) (MPV не должен изменяться более чем на 1,5 fL).
- Отрегулируйте количество тромбоцитов с буфером HEPES Tyrode, pH 7,4, до концентрации 150 000 тромбоцитов / мкл. Оставьте тромбоциты восстанавливаться в течение 30 мин при комнатной температуре до проведения экспериментов. Используйте промытые тромбоциты для экспериментов в течение 4 часов после выделения.
5. Сборка измерительной камеры
12 . Можно использовать различные коммерческие камеры потока, если они могут удерживать покровное стекло, которое предпочтительно снимается для дальнейшего анализа. Потоковая камера, используемая для описанных экспериментов, изготовлена из поли (метилметакрилата), чтобы точно подогнать ступень вставки микроскопа. Он содержит вход и выход ( рис. 1A - C , 1, 2), а также вакуумное соединение ( рис. 1A и C ; 3). Наверху помещается индивидуальный силиконовый лист ( рис. 1A и D ; 4). Две вырезы образуют вакуумные каналы ( рис. 1A и D ; 5), чтобы плотно прикрепить покрытие к крышке ( рис. 1A ; 6). Центральный вырез образует проточный канал ( рис. 1А D ; 7; Ширина 2,0 мм и высота 0,125 мм). Вход и выход подключены к проточному каналу, а вакуум подключен к вакуумному каналу.
- Накройте верхнюю часть проточной камеры дистиллированной водой и поместите индивидуальный силиконовый лист с гладкой стороной вниз на воду. Положите лист на место, удалив лишнюю воду, удерживая лист в нужном положении.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот силиконовый лист повторно используется (силикон известен своими инертными свойствами); Как правило, тромбоциты не были прикреплены к нему. Листы можно очищать моющим средством и повторно использовать до тех пор, пока материал не будет поврежден ( т. Е. Разрывается, особенно в области между каналами). Как правило, лист можно использовать в течение 20 дней с несколькими экспериментами в день. - Инкубируйте проточную камеру в течение 1 часа при 60 ° C для испарения остаточной воды, чтобы прочно удерживать силиконовый лист в проточной камере.
- С помощью пластиковой пипетки Пастера добавьте каплюHEPES Tyrode, pH 7,4, на канал потока. Поместите крышку (см. Раздел 2) стороной с покрытием вниз на канал потока. Присоедините вакуумный насос к вакуумному соединению ( рис. 1A и C ; 3). Примените давление ~ 10 кПа.
6. Предварительное окрашивание тромбоцитов и получение антител
- Окрашивание тромбоцитов
- Инкубируйте промытые тромбоциты 10 мкг / мл DAPI в течение 30 мин при 37 ° С в темноте. Чтобы смыть несвязанный DAPI и предотвратить активацию тромбоцитов, добавьте простациклин с конечной концентрацией 10 нг / мл и сразу же центрифугируйте в течение 15 минут при 400 xg и RT без тормоза.
- Восстановить гранулы тромбоцитов в буфере HEPES Tyrode, pH 7,4, до концентрации тромбоцитов 150 000 тромбоцитов / мкл.
- Получение антител
- Смешать биотин-меченое антитело с Alexa-меченым стрептококкомТавидина при молярном отношении 1: 1. Инкубируйте в течение минимум 10 минут при комнатной температуре перед использованием (шаг 7.6).
ПРИМЕЧАНИЕ. Эффективность маркировки биотина может варьироваться между различными партиями. Если возникают проблемы с визуализацией молекул-мишеней, следует провести контрольные эксперименты, чтобы подтвердить успешную биотинилирование, а также связывающие мишень свойства специфического биотинилированного антитела.
- Смешать биотин-меченое антитело с Alexa-меченым стрептококкомТавидина при молярном отношении 1: 1. Инкубируйте в течение минимум 10 минут при комнатной температуре перед использованием (шаг 7.6).
7. Перфузия
- Запустите флуоресцентный микроскоп, а также программное обеспечение микроскопа. Используйте настройки микроскопа, указанные в таблице 1 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Инициируйте настройки микроскопа и записи для визуализации и записи живых клеток и регистрации тромбоцитов и выбранных флуоресцентно меченых антител и / или красителей путем загрузки соответствующего эксперимента в программное обеспечение микроскопа. Выполните эксперименты с потоком при RT. - Заблокируйте входную трубу, подсоединив шприц объемом 10 мл к насосно-компрессорной трубе и аспирирую 1% HSA bloБуфером для подачи в входную трубу. Инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре. Промойте впускную трубу аспирационным буфером HEPES Tyrode, pH 7,4, во входную трубу.
- Подключите блокированную впускную трубу и необработанную выпускную трубу, диаметр которой составляет 1,02 мм, а длина ~ 20-30 см - на входе и выходе камеры. Подключите шприц объемом 10 мл (или более низкий объем для большей точности) к выпускной трубе. Включите насос шприца.
ПРИМЕЧАНИЕ. Диаметр шприца в сочетании с расходом, установленным на насосе, определяет объемный расход. Вместе с площадью поверхности проточного канала скорость сдвига может быть рассчитана по формуле 13 ниже. Следовательно, можно управлять скоростью сдвига, изменяя скорость потока шприцевого насоса или изменяя размеры канала потока. Скорость сдвига 800-1600 с -1 типично моделирует артериальный кровоток, а 25-100 с-1 модели для венозной кровитечь. Для этой установки скорость потока 7,5 мкл / мин приводит к скорости сдвига 25 с -1 .
Скорость сдвига = 6Q / h 2 w в с -1
Где: Q = объемный расход (мл / с), h - высота канала (см) (0,0125 см, это толщина силиконового листа), w = ширина канала (см) (0,2 см в этой камере). - Поместите каплю погружного масла на цель 100X (суммарное усиление 1000X) и установите камеру на микроскоп со стороной стекла вниз.
- Поместите впускную трубу в трубу, содержащую буфер HEPES Tyrode, pH 7,4. Вручную вытащите плунжер шприца, подключенного к выпускной трубе, и вытащите раствор через камеру, чтобы удалить воздух из системы. Поместите шприц в шприцевой насос ( рис. 1B и C ; 8) и ненадолго запустите насос, чтобы затянуть плунжер и обеспечить стабильный поток.
- Добавьте антитела и / или красители к суспензии тромбоцитов или PRP, тщательноСмешать с пластмассовой пипеткой и перенести смесь в 1,5-мл пробирку.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для типичной 30-минутной перфузии при скорости сдвига 25 с-1 (7,5 мкл / мин) требуется минимум 225 мкл суспензии тромбоцитов. Антитела, используемые для репрезентативных результатов, показаны в таблице 2 . - Переместите впускную трубу, сжимая, из буфера HEPES Tyrode, pH 7,4, в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую либо PRP, либо промытые тромбоциты, и антитела и / или красители ( фиг. 1B и C ; 9).
ПРИМЕЧАНИЕ. Важно, чтобы при переносе трубки шланг был сжат (отжав воздух), чтобы воздух не попал в трубу. На последующей стадии можно обрабатывать прилипшие тромбоциты различными реагентами, перемещая впускную трубу в другую трубку аналогичным образом. Список потенциально полезных реагентов приведен в таблице 3 . - Выберите "live visualizatio"N "в программном обеспечении, сфокусируйте микроскоп на поверхности покрытого покровного стекла и запустите насос со скоростью сдвига 1600 с-1 (484 мкл / мин) до тех пор, пока тромбоциты не достигнут проточной камеры. В этот момент, Уменьшите скорость сдвига до 25 с-1 , изменив настройки шприцевого насоса на скорость потока 7,5 мкл / мин.
- Контролируйте поверхность покрытой стороны покрывающего стекла, дождитесь, пока первый тромбоцит начнет прилипать, сфокусируйте микроскоп на этом тромбоците и начните запись, инициировав эксперимент в программном обеспечении. См. Таблицу 1 для параметров записи, используемых здесь.
- Следите за живой записью визуально. Через 30 минут остановите насос шприца.
ПРИМЕЧАНИЕ. Убедитесь, что тромбоциты остаются в фокусе во время эксперимента. Как правило, 20-30 тромбоцитов прикрепляются в поле зрения при увеличении 1000X; Это около 2000-3000 тромбоцитов во всем проточном канале. - Фиксация с использованием(Необязательно).
- Когда поток остановился после остановки шприцевого насоса, переместите впускную трубу (без воздуха) в фиксирующий раствор. Перезапустите насос и пропустите буфер фиксации через канал в течение минимум 10 минут при той же скорости потока, как указано на шаге 7.8.
- Извлеките камеру из микроскопа, очистите иммерсионное масло от стекла, отсоедините вакуум и осторожно снимите крышку с камеры иглой 18 G.
ПРИМЕЧАНИЕ. Предотвратите разрушение и повреждение покрывного стекла. - Поместите обложку (с ячейками, направленными вверх) в 4-луночный планшет поверх ткани, предварительно смоченной дистиллированной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ. Это предотвращает прилипание покровного стекла к поверхности скважины и предотвращает сушку. - Нанесите 750 мкл фиксирующего раствора поверх покровного стекла и инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре. Если образцы не могут быть проанализированы напрямую,Хранить их в 0,5% PFA (разбавленный буфером HEPES Tyrode, pH 7,4) при 4 ° C для обеспечения стабильной фиксации. Перейдите к разделу 8, чтобы обработать покрытие для визуализации.
- После использования промойте камеру, трубку и лист дистиллированной водой и инкубируйте в течение ночи в моющем растворе. Перед повторным использованием камеры и других компонентов промойте дистиллированной водой.
- Сохраните исходные файлы данных микроскопа, содержащие все метаданные. При необходимости экспортируйте фильмы в .MOV, h.264 сжатые или .AVI без сжатия. Сохраните отдельные кадры в формате JPEG или TIF.
8. Подготовка образца для конфокальной флуоресцентной микроскопии
- Перенесите покровные стекла на новые 4-луночные планшеты и промойте 5 раз 3 мл буфера HEPES Tyrode, pH 7,4. Добавьте 3 мл / лунку блокирующего буфера и инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Удалите блокирующий буфер; Добавьте 3 мл / лунку 0,15% глицина (M / V) в буфере HEPES Tyrode, pH 7,4; И инкубируют в течение 15 мин при RТ.
- Удалите раствор глицина и промойте 5 раз в 3 мл / лунку блокирующего буфера. При необходимости добавьте конъюгированные с флуорофором антитела, разбавленные в блокирующем буфере для дополнительного окрашивания. Инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.
- Промыть 5 раз с блокирующим буфером и 2 раза дистиллированной водой. Высушите стекло, удалив избыток жидкости с помощью ткани (с краев внутрь), не касаясь клеток.
- Пипеткой 60 мкл раствора поливинилового спирта на слайде микроскопа. Поместите покрывающее стекло, с помощью клеток вниз, сверху капли и позвольте поливиниловому спирту распространяться между двумя поверхностями. Инкубируйте на ночь при комнатной температуре в темноте.
- Анализ клеток путем конфокальной микроскопии 14 .
- Сохраните необработанные файлы данных записанных данных стека, содержащих все метаданные. При необходимости обрабатывайте необработанные файлы данных в сжатые файлы MOV, h.264 или .AVI. Сохраните отдельные стеки в виде файлов JPEG или TIF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показаны изображения проточной камеры и экспериментальной установки; Положение и размеры листа кремния; И трубных соединений. На рисунке 2 приведены детали размеров камеры потока. Рисунок 3 и Фильм 1 показывают временные ряды изображений адгезии тромбоцитов и распространения на иммобилизованном VWF. CD63 представляет собой трансмембранный белок, который вводится в мембрану внутриклеточных плотных гранул покоящихся пластинок 15 . Его зависящая от времени мобилизация на поверхность тромбоцитов показана зеленым цветом. Аналогично, P-селектин (Psel) представляет собой трансмембранный белок, введенный в мембрану внутриклеточных α-гранул покоящихся тромбоцитов. Его зависящая от времени мобилизация на поверхность тромбоцитов показана оранжевым цветом. На фиг.3В показано репрезентативное изображение под углом 45 °, Полученный путем конфокальной флуоресцентной микроскопии после эксперимента потока. В фильме 2 показан ряд наклона того же эксперимента. Обратите внимание, что CD63 в основном расположен на центральном гранулеме, а P-селектин распределен по всему телу клетки и появляется концентрированным по краям. На рис. 4А и в фильме 3 показана зависящая от времени мобилизация CD63 на поверхность тромбоцитов (зеленая). В этих экспериментах тромбоциты (которые не имеют ядерной ДНК) предварительно инкубировали с DAPI (синий), который окрашивает полифосфат в плотные гранулы 16 . Примечательно, что, несмотря на четкие признаки плотного выделения гранул (одноклеточные анализы показаны на рис. 4B и Фильме 4 ), полифосфат сохраняется внутри или снаружи этих тромбоцитов. Рисунок 5 и фильм 5 показывают зависящую от времени мобилизацию (или набор) VWF, тромбогенного мультиImeric белка 17, хранящегося в α-гранулах, до поверхности тромбоцитов (зеленый). Подобно полифосфату, VWF остается связанным с поверхностью активированных тромбоцитов.
Рисунок 1: Камера потока и экспериментальная установка. ( A ) Изображение конструкции проточной камеры с впускным и выпускным отверстиями (1 и 2), вакуумное соединение (3), на котором размещен силиконовый лист (4). Два внешних выреза (5) на кремниевом листе образуют вакуумные каналы для прикрепления покровного стекла (6). Центральный вырез (7) образует проточный канал ( B ). Изображение экспериментальной установки. Вход и выход (1 и 2), шприцевой насос (8) и держатель образца (9). ( C ) Схематический обзор экспериментальной установки; Числа идентичны номерам в A и B. ( D ). Обзор схемы с измерением Из специально отрезанного силиконового листа. ( E ) Общий схематический обзор проточной камеры поли (метилметакрилата) . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Детальный чертеж проточной камеры. Потоковая камера состоит из блока (1) поли (метилметакрилата), одной прямой полиоксиметиленовой вставки для вакуумного входа (2) и двух наклонных полиоксиметиленовых вставок для входа и выхода пробы (3) . Угловые полиоксиметиленовые вставки содержат металлические капиллярные трубки диаметром 1.07 мм. Прямая вставка содержит капиллярную трубку диаметром 1,3 мм. 658 / 55658fig2large.jpg «target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Распространение тромбоцитов и дегрануляция на иммобилизованный фактор Виллебранда. ( A ) Зависимая от времени мобилизация CD63 и P-селектина на поверхность расширительных и дегрануляционных тромбоцитов. Белая шкала (верхний левый) указывает 10 мкм. ( B ) Репрезентативное изображение конфокальной флуоресцентной микроскопии под углом 45 °. Белая шкала (слева внизу) показывает 2 мкм. Зеленый, CD63; Оранжевый, P-селектин. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
55658 / 55658fig4.jpg "/>
Рисунок 4: Распространение тромбоцитов, дегрануляция и мобильность плотных гранул на иммобилизованном фибриногене. ( A ) Зависимая от времени мобилизация CD63 и полифосфата на поверхность тромбоцитов. Белая шкала (верхний левый) указывает 10 мкм. ( B ) Временные ряды одного тромбоцита (t = 0 представляет собой первую адгезию к поверхности). Белая шкала (справа внизу) показывает 2 мкм. Зеленый, CD63; Синий, DAPI. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Поверхностная ассоциация фактора фон Виллебранда на поверхность тромбоцитов иммобилизованного фибриногена. Зависимая от времени мобилизация (или вербовка) VWF на поверхность тромбоцитов. TБелый шкала (верхний левый) указывает 5 мкм. Зеленый, VWF. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| настройка | Стоимость |
| Время экспозиции FITC (Alexa488) | 200 мс / 300 мс |
| Светодиод 488 FITC (Alexa488) | 50% |
| Время экспозиции DIC | 30 мс |
| Галогенная лампа напряжения | 4,5 В |
| Время экспозиции TRITC (Alexa 546) | 400 мс |
| Светодиод 555 FITC (Alexa546) | 50% |
| Время экспозиции DAPI | 500 мс |
| Светодиод 365 | 50% |
| Filterset FITC | Фильтр 10 |
| Filterset TRITC | Фильтр 20 |
| Фильтр DAPI | Фильтр 01 |
| Задача | Alpha Plan-Fluar 100x / 1.45 Масло |
| Частота кадров, время записи | 1 кадр / 10 с, 30 мин |
| Файлы для сжатия файлов | MOV (h.264), AVI (несжатый) |
| Фотографии сжатия файлов | JPEG, TIF |
Таблица 1: Настройки микроскопа. Настройки, используемые для репрезентативных экспериментов.
| цель | Антитело / краситель | концентрация |
| CD63 | <Td> Анти-CD63-биотин *)325 нг / мл | |
| Р-селектина | Анти-CD62P-биотин **) | 90 нг / мл |
| ДНК | DAPI | 10 мкг / мл |
| ФВ | Анти-человеческий VWF-FITC | 5 мкг / мл |
| *) Анти-CD63-биотин-антитело смешивают с стрептавидином-Alexa488 в молярном соотношении 1: 1 перед использованием | ||
| **) анти-CD62P-биотин-антитело смешивают со стрептавидином-Alexa546 в молярном соотношении 1: 1 перед использованием | ||
Таблица 2: Антитела и красители. Рекомендуемые концентрации антител и красителей для показанных репрезентативных экспериментов.
| Категория реагента | Пример compounds |
| Агонисты тромбоцитов | Тромбин, ADP, PAR-1 или -4-активирующие пептиды, U46619, тромбоксан A2, ADP |
| Ингибиторы ферментов | Hirudin, PPACK, гепариноиды (косвенные), ингибитор трипсина кукурузы, ингибитор трипсина соевых бобов |
| Антагонисты рецепторов | Анти-Glyprotein 1bα, анти-гликопротеин VI; Клопидогрель, (циклические) RGD-содержащие пептиды |
| Ингибиторы активации | Предварительная обработка аспирином, фиксация |
Таблица 3: Потенциально полезные реагенты.
Дополнительные фильмы: фильм 1: временные ряды изображений тромбоцитов (см. Рис. 1 ), фильм 2: серия наклона на рисунке 3B , фильм 3: зависящая от времени мобилизация CD63 на тромбоцит(См. Рис. 4 ), фильм 4: временные ряды анализов с одной ячейкой (см. Рисунок 4B ), фильм 5: зависящая от времени мобилизация VWF (см. Рис. 5 ).
Нажмите здесь, чтобы скачать фильм 1.
Нажмите здесь, чтобы скачать фильм 2.
Нажмите здесь, чтобы скачать фильм 3.
Нажмите здесь, чтобы скачать фильм 4.
Нажмите здесь, чтобы скачать фильм 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Во всем мире тромбоз является основной причиной смерти и заболеваемости, а тромбоциты играют центральную роль в его развитии. В этой работе описывается метод визуализации живого изображения дегрануляции тромбоцитов под потоком. Обычно считается, что при активировании тромбоцитов все гранулированное содержимое непосредственно высвобождается в раствор. Сопутствующие результаты показывают, что это не обязательно так. При адгезии и дегрануляции тромбоциты сохраняют значительное количество полифосфата ( рис. 4 ). Кроме того, мультимерный белок VWF связан с поверхностью тромбоцитов после дегрануляции ( фиг. 5 ). Это указывает на то, что молекулярные механизмы, которые регулируют дегрануляцию гранулы тромбоцитов, являются более тонкими, чем обычно предполагалось.
Чтобы включить визуализацию жировой клетки дегрануляции тромбоцитов в потоке, экспериментальные условия были выбраны так, чтобы сохранить агрегацию тромбоцитов до минимума. Страна тромбоцитаTs 150 000 тромбоцитов / мкл. Это находится на нижнем конце нормального диапазона (150 000-450 000 тромбоцитов / мкл). Кроме того, адгезия и распространение тромбоцитов изучались на иммобилизованном VWF или фибриногене, что приводило к легкой активации тромбоцитов (в отличие от, например, коллагена). В исследованиях с промытыми тромбоцитами увеличенные скорости сдвига перемещают эти клетки в центр потока. Это препятствует адгезии и последующему распространению и усложняет исследование дегрануляции.
В физиологическом гемостазе важное значение имеет маргинальность тромбоцитов. Этот процесс обусловлен эритроцитами, объясняя, почему низкая анемия иногда сопровождается кровоточащим диатезом. Ограничение представленной методики заключается в том, что визуализация дегрануляции тромбоцитов (с представленными материалами и реагентами) нарушается эритроцитами. На функцию тромбоцитов влияет напряжение сдвига, которое зависит от вязкости жидкости (μ), а такжеОт скорости сдвига. Следовательно, рекомендуется исследовать функцию тромбоцитов в моделях течения в растворах со сравнимой вязкостью ( т. Е. Промытых тромбоцитов, восстановленной крови, PRP или цельной крови).
При проведении этих экспериментов необходимо учитывать несколько практических факторов. Во-первых, флуоресцентные сигналы сильно зависят от области фокусировки. Если микроскоп не находится в фокусе, сигнал легко размыт или даже потерян. Перед поступлением тромбоцитов в канал потока лучше всего сосредоточиться на самом канале (начинайте с края кремниевого листа / стенки канала потока). Когда тромбоциты начинают прилипать, сосредоточьтесь на этом событии адгезии. Вторая проблема заключается в отбеливании некоторых флуорофоров ( например, FITC). Повторное возбуждение приведет к потере сигнала, нарушающему исследование. Эти препятствия можно преодолеть, используя более стабильные флуорофоры, уменьшая интенсивность возбуждающего светодиода, сокращая значение expВремя ожидания и / или понижение частоты кадров.
Описанная здесь модель очень полезна для детального изучения реакции тромбоцитов на широкий спектр иммобилизованных белков и при разных скоростях потока. Потенциально этот метод также может быть использован для изучения их взаимодействия с активированными эндотелиальными клетками 18 . Технические достижения, которые обеспечивают гибкие конструкции специальных проточных камер, в настоящее время открывают возможности для исследований биосовместимости 19 . Отображение живого изображения реакционной способности тромбоцитов в потоке выявит ценную информацию о сложности реакции адгезии тромбоцитов. В конечном счете, этот опыт должен привести к разработке экспериментальных моделей потока, которые позволят комбинированное исследование функции тромбоцитов и влияния на систему коагуляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
КМ признает финансовую поддержку Международной организации пациентов за недостатки C1-ингибитора (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht и Фонда Landsteiner для исследования переливания крови (LSBR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostacyclin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodium citrate | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Citric acid | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Cover glasses | Menzel-Gläser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness. |
| Chromosulfuric acid (2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4 well dish, non-treated | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | 823022 | |
| Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Cell analyser | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematology analyzer | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Harvard apparatus 22 | |
| 10 mL syringe with 14.5 mm diameter | BD biosciences | 305959 | Luer-Lok syringe |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | AB134331 | |
| Anti-CD62P-biotin | R&D Systems | Dy137 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| Immersion oil | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Detergent solution | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hydrochloride | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Sheep Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn film | Bemis | PM-996 | 4 in. x 125 ft. Roll. |
| Silicone sheet non-reinforced | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels | in-house made | Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Observer Z1 | Equiped with LED excitation lights. | |
| Microscope software | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G needle (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastic pasteur pipet | VWR | 612-1681 | 7 mL non sterile, graduated up to 3 mL. |
| Silicone tubing | VWR | 228-0656 | Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Microscope slides | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end. |
References
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).
- May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
- Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
- Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
- Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
- Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
- Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
- Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
- Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
- Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
- Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
- Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
- Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
- Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
- Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
- Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).
