Summary
우리는 개구리 및 제브라 피쉬 배아와 같은 수생 생물에 사용하기위한 새로운 저산소 챔버 시스템을 소개합니다. 우리의 시스템은 간단하고 견고하며 비용 효과적이며 생체 내 및 최대 48 시간 동안 저산소증의 유도 및 지속을 허용합니다. 우리는 저산소증의 효과를 모니터하기 위해 2 가지 재현 가능한 방법을 제시한다.
Abstract
여기에서는 개구리 및 제브라 피쉬 배아와 같은 수생 생물에서 저산소증의 영향을 연구하기 위해 개발 한 저산소증 유도를위한 새로운 시스템을 소개합니다. 우리의 시스템은 챔버의 구성이 간단하지만 어떤 실험 솔루션에서도 특정 산소 농도와 온도를 유도하고 유지할 수 있습니다. 제시된 시스템은 매우 비용 효율적이지만 기능이 뛰어나 생체 내 및 48 시간 이하의 다양한 기간 동안 직접 실험 을 위한 저산소증의 유도 및 지속을 허용합니다.
저산소증의 영향을 모니터하고 연구하기 위해 우리는 전체 배아 또는 특정 조직에서 저산소 - 유도 성 인자 1 알파 (HIF-1α)의 수준 측정과 5-에 티닐 -2 '에 의한 망막 줄기 세포 증식의 측정, 데 옥시 우리 딘 (EdU)이 DNA에 통합되었다. HIF-1α 수준은 전체 배아 또는 조직에서 일반적인 저산소증 마커로 작용할 수있다선택의 여지가, 여기 배아 망막. 배아 망막의 증식하는 세포 내로의 EdU 결합은 저산소증 유도의 특정 산출물이다. 따라서 우리는 저산소 배아 망막 전구 세포가 개구리와 제브라 피쉬 배아의 5 % 산소 하에서 배양 1 시간 이내에 증식을 감소 시킨다는 것을 보여 주었다.
마스터 한 후에는 작은 수생 모델 생물체, 직접 생체 내 실험, 임의의 주어진 시간 및 정상, 저산소 또는 고 산소 산소 농도 또는 임의의 다른 주어진 가스 혼합물 하에서 사용하기 위해 본 장치를 사용할 수있다.
Introduction
저산소증 연구는 수많은 응용 분야를 가지고 있습니다. 여기에는 저산소증 1 과 급성 고산병 2에 의해 특징 지어지는 병적 상태에 대한 조사와 병적 치료법 개발이 포함됩니다. 저산소증 스트레스는 산소를 필요로하는 모든 유기체에서 중요한 대사 변화를 일으 킵니다. 저산소증 스트레스는 자궁 내 성장 제한을 포함한 여러 가지 인간 질병의 태아 성장 및 발달 및 병인에 영향을 미친다. 저산소증은 출생 체중 감소, 태아 및 신생아 사망률을 감소시킬뿐만 아니라 심혈관 질환, 2 형 당뇨병, 비만 및 고혈압과 같은 성인 생활에서 많은 합병증을 유발할 수 있습니다. 저산소증 스트레스는 또한 종양 조직이 혈액 공급을 초과하여 성장하는 고형 종양 발생시 종종 관찰됩니다. 따라서 생체 내에서 저산소증의 효과를 직접적으로 연구 할 수 있어야합니다. yonic 개발.
발달 중 저산소증의 영향을 연구하기 위해 사용 된 가장 잘 알려진 방법 중 하나는 저칼륨 챔버에서 생균 배양 또는 배양에서 염화 코발트를 사용하는 것입니다. 염화 코발트는 저산소증 유도 성 인자 -1 알파 (HIF-1α)의 proteosomal degradation을 방지하여 안정화시키는 역할을하기 때문에 인위적으로 정상 산소 농도에서 저산소 반응을 유도합니다 5 , 6 , 7 . 그러나, 편리한 방법 8 일 때, 코발트 염화물뿐만 아니라 다른 유사한 화학 저산소증 모방 체의 사용은 세포 및 조직, 예를 들면 , 아폽토시스 9 에 대해 비특이적 인 해로운 효과를 가질 수있다. 따라서 저산소 챔버는 정상적인 발달 과정을 통해 살아있는 생물체에서 "자연 hypoxia"를 유도하는 더 좋은 방법입니다.
ntent "> 우리는 수생 동물 배아에서 저산소증 유도 시스템 개발에 중점을 두었습니다. 개구리와 제브라 피시 모두 다양한 생물학적 과정의 연구를위한 유익한 척추 모델 생물뿐만 아니라 다양한 인간 질병의 모델이되었습니다. 개구리와 제브라 피쉬 태아 모체 보상의 합병증을 제거하고 외부 적으로 발달하며 신속한 개발 과정을 통해 환경 요인을 조작하고 장기 형성의 표현형 변화를 실시간으로 관찰 할 수 있습니다. 또한 주요 신호 전달 경로의 많은 구성 요소는 이 모델 생물체는 많은 문헌에 의해 상세하게 특성화되어 있습니다. 개구리와 제브라 피쉬 배아를 사용하여 척추 동물의 발달에 저산소증의 영향을 연구 할 때의 주요 이점은 산소가 배아에 빠르게 침투하기 때문에 모든 과정을 직접 모니터링 할 수 있다는 것입니다. 따라서 개구리와 제브라 피쉬에서는 다른 모델 생물과 달리마우스 배아에서 특정 산소 농도의 영향은 기능 조직계의 존재 또는 부재를 고려하지 않고 관심있는 조직에서 연구 될 수있다.저산소 배양을위한 상업적으로 이용 가능한 대부분의 설치는 비교적 크고 상응하는 높은 운전 비용을 갖는 단점이있다. 초기 저비용 및 가스 소비가 높다는 점을 제외하고 일반적인 저산소 챔버의 평형 유지 및 유지는보다 큰 크기 및 / 또는 생물학적 호흡으로 인해 자연적으로 이러한 챔버에서 발생하는 가스 구배에 대해 일정한 저산소 대기를 유지해야합니다. 이것은 가스 팬과 냉각 장치의 사용을 필요로하며, 이는 필요한 추가 장치의 양을 증가시키고 연구자의 손재주를 방해하며 실험 절차의 단순성을 감소시킨다. 대조적으로, 우리가 여기에 제시 한 설정은 비교적 견고하지만 매우 비용 효율적이고 작고 설치하기 쉽고 f천 가스 평형, 안정적인 저산소 대기 및 챔버 내의 재료 및 용액의 간단한 교환. 우리 시스템은 관심있는 수생 모델 유기체와 함께 사용할 수 있습니다.
우리는 편리하게 작은 저산소 챔버를 만들었고, 따라서 특정 온도에서 실험 절차를 쉽게 허용하는 일반적인 실험실 배양기 안에 배치 할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 저산소 배양기에 대한 우리 시스템의 장점은 배지의 산소 농도뿐만 아니라 온도의 편리한 조절을 제공하여 크기가 작고 비용 효율성이 우수하다는 것입니다. 따라서 대부분의 연구실에서 사용할 수있는 일반 실험실 소모품을 사용하여 설정을 구성 할 수 있으며 값 비싼 재료가 필요하지 않습니다. 또한 시판되는 저산소 배양기와는 달리 열을 발생시키지 않으며 인큐베이터에 넣은 실내 온도보다 낮은 온도에서 사용할 수 있습니다. 라발달 및 신진 대사 속도가 강하게 온도 의존적 인 개구리와 물고기와 같은 냉혈 생물과의 작업에 특히 중요합니다.
매우 비용 효율적이고 쉽게 구축 할 수 있기 때문에 GE의 가스 보온 챔버는 다양한 저산소 또는 고 산소 상태를 구축하는 데 매우 유용 할뿐만 아니라 방대한 수의 실험 조건에 대해 다양한 매체 및 솔루션을 빠르고 쉽게 관리 할 수 있습니다. 또한 일반적으로 사용되는 접시 또는 실험실 탱크 10 , 11 , 12 대신 24-well plate를 사용하여 여러 가지 돌연변이 조건을 한 번에 관찰하고 실험적으로 처리 할 수 있습니다.
저산소증의 정확한 유도를 조절하기 위해 우리는 Western blot detection에 의해 HIF-1α 단백질의 수준을 모니터링했습니다. 또한, 배양 전후의 증식하는 세포의 수저산소실의 n은 저산소증이 조직에 유도되었는지를 결정하는데 사용될 수있다. 이 방법은 저산소증의 유도시 배아 망막 줄기 세포 틈새의 증식이 감소 함을 보여주는 이전에 발표 된 결과 13을 기반으로합니다. 따라서 우리는 배아 배지에 5- ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)을 첨가하고 새로 증식하는 세포의 DNA 로의 결합을 측정함으로써 망막 줄기 세포 증식의 수준을 모니터링했다.
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Protocol
이 프로토콜은 캠브리지 대학의 동물 관리 지침을 따릅니다.
1. 동물 관리
- 개구리 태아
참고 : 배아는 동물 및 실험실 시설에 따라 키우고 유지할 수 있습니다. 여기에서 동물 유지 관리의 예가 설명됩니다.- 0.88mM NaCl, 10μM KCl, 24μM NaHCO 3 , 100μM HEPES, 8.2μM MgSO 4 , 3.3μM Ca (NO 3 ) 2 및 4.1μM CaCl 2 , pH 7.6을 0.1x 수정 된 바스 용액 (MBS) .
- 체외 수정에 의해 Xenopus laevis 배아를 얻습니다.
- 알을 낳기 전에 임신 한 마리의 혈청 생식선 자극 호르몬을 1 주일 (60 IU) 및 12 시간 (500 IU) 주입하여 성인 여성 아프리카 발톱 개구리 ( Xenopus laevis) 에서 배란을 유도하십시오.
- oocytes를 수집하고 homogenized 남성 고환과 체외에서 그들을 비옥하게.
- 라이16 배에서 18 배까지 0.1 배 MBS 배아에서 배양 하였다. Xenopus laevis 14 의 정상 표에 따라 배아를 준비하십시오. 실험을 위해 전체 및 살아있는 배아를 선택하는데주의하십시오.
- 제브라 피쉬 배아
참고 : 배아는 동물 및 실험실 시설에 따라 키우고 유지할 수 있습니다. 여기에서 동물 유지 관리의 예가 설명됩니다.- 배아 매체 : 5 MM NaCl, 0.17 MM KCl, 0.33 MM CaCl 2 , 0.33 MM MgSO 4 , 0.00001 % 메틸렌 블루를 준비합니다.
- 26.5 ° C에서 WT AB strain Danio rerio 를 유지하고 번식하십시오.
- 수정의 아침에 배아를 수집, 위에서 설명한대로 준비 배아 매체 28 ° C에서 4 d 수정 (dpf) 때까지 인상, 이전에 설명한대로 선택하고 무대.
2. 생체 내 저산소증 유도
- 저산소 챔버 건설을 위해 어류 시설에서 일반적으로 사용되는 번식 수생 조 ( 그림 1A )를 사용하십시오. 이 탱크는 24-well plate에 적합해야합니다.
- 그림 1 과 같이 mesh-bottom 24-well plate를 준비한다. 이 목적으로 밀링 머신을 사용하여 24 웰 플레이트 ( 그림 1B )의 플라스틱 바닥을 제거하십시오 ( 예 : .).
- 우물의 플라스틱과 판의 벽 사이의 공간을 에폭시 수지로 채 웁니다. 수지로 코팅 된 플라스틱에 메쉬 직경이 0.1-0.2 mm 인 모든 나일론 필터 ( 그림 1C )를 부착하고 판이 완전히 건조되도록하십시오.
- 일단 건조되면, 길이 10mm, 지름 5mm의 터널 ( 그림 1D )을 수지 및 메쉬 코팅 플레이트 벽에 3 ~ 4 개의 터널을 뚫습니다 ( 그림 1D ). 플라스틱 또는 테프론로드 부착( 그림 1E ) 적절한 터널의 길이와 30mm 길이를 선택하고 원하는 탱크에 판을 놓으십시오.
- 메쉬 - 하단 24 - 웰 플레이트를 선택의 수생 탱크에 놓습니다. 실리콘 튜브 ( 그림 1F )를 사용하여 적절한 가스 조절기 (I) (BOC 200)를 사용하여 분배기 밸브 ( 그림 1H )에 원하는 O 2 / N 2 혼합물 또는 다른 가스 혼합물을 혼합 한 가스 탱크 ( 그림 1G ) 바). 여기, 여기에 제시 hypoxia 실험에서 5 % 산소와 95 % N 2 의 혼합물을 포함 가스 탱크를 사용합니다.
- 챔버 매체의 산소 유속을 0.0017-0.0019 m3 / s로 조정하십시오. 이 기체 유속 하에서, 매질의 우물에서 매질의 방해가 보이지 않아야한다.
- 이러한 목적으로 고순도 2 단 가스 조절기를 사용하십시오. th의 내부 압력을 줄이기 위해 레귤레이터를 설정하십시오.e 가스 탱크 (1000 - 2500 PSI)를 실험 전반에 걸쳐 10 PSI의 배출 압력으로 설정합니다. 따라서이 가스 조절기의 사양에 따라 실험을 통해 초당 0.00189 입방 미터의 유량이 달성되었습니다.
- 실리콘 튜빙과 분배 밸브를 수조 내부의 세라믹 디스크 디퓨저 ( 그림 1J )에 연결하십시오. 수조를 닫고 뚜껑을 조심스럽게 밀봉하고 실리콘 그리스 ( 그림 1K )로 코팅하십시오 ( 그림 1 참조 ). 특정 비 실내 온도가 필요한 경우 저온 챔버를 필요한 온도의 실험실 배양기에 놓으십시오.
- 실험에 사용 된 배아의 유형에 따라 저온 챔버 탱크에 적절한 배아 배지를 채우고 세라믹 디스크 디퓨저를 통해 가스 혼합물을 확산시키기 시작하십시오. 10-15 분 동안 평형을 유지하십시오.
- th와 평형 후원하는 산소 혼합물을 측정하기 위해 옥시 미터 또는 산소 프로브를 사용하여 물의 산소 농도를 측정하십시오. 여기에 광섬유 용해 산소 및 온도 센서가있는 옥시 미터를 사용하십시오.
- 조심스럽게 실험을위한 배아를 선택, hypoxia 부화에 대한 전체 및 살아있는 배아를 사용합니다. 여기에 제시된 실험에서 무대 38의 배아 또는 제브라 피쉬 배아 4 dpf를 개구리로 만듭니다.
- 가스 배양 챔버가 포함 된 인큐베이터 ( 그림 1K )에 배아 접시를 놓고 인큐베이터 온도로 평형을 이루도록하십시오.
- 조심스럽게 플라스틱 피펫을 사용하여 가스 부화 챔버의 메쉬 24 잘 접시 ( 그림 1B )의 우물로 배아를 전송합니다. 항상 프로토콜을 통해 배아 전송을 위해 플라스틱 피펫을 사용하십시오.
참고 :이 판의 각 구멍은 위쪽을 포함 할 수 있습니다무대 38의 5 마리의 개구리 배아 또는 4dpf의 7 마리의 zebrafish 배아까지. 다른 genotypes를 사용하는 경우 신중하게 우물을 라벨. - 가스 혼합 챔버를 5 시간 동안 또는 실험에 적합한 더 긴 시간 동안 일정한 주입하에 유지한다. 여기에 5 % O 2 와 95 % N 2 의 혼합물을 사용하십시오.
- 조심스럽게 가스 배양 챔버에서 배아 유형에 해당 normoxic 매체로 배아를 전송하고 즉시 3 또는 4 단계로 진행합니다.
- 추가 정상 산소 처리가 필요한 경우 배아를 조심스럽게 배아 유형에 해당하는 정상 산소 배지로 옮깁니다.
3. HIF-1α 수준을 모니터링하여 성공적인 저산소증 유도 제어
- 준비
- 0.1x MBS에서 0.4mg / mL MS222 용액을 준비합니다.
- 균질화 버퍼 준비 : 방사 면역 침전 분석 완충액 (RIPA buffer)를 사용하여 Protease Inhibitor로 실험에 필요한 완충액을 최종 농도 1 : 100 v / v로 보충하십시오.
- Western blot을위한 솔루션을 준비하십시오.
- 425 mM Tris pH 8.0, 40 % v / v 글리세롤, 8 % v / v SDS, 4 % v / v 베타 - 메르 캅토 에탄올, 0.5 % w / v 브로 모 페놀 블루, 10 mL 총 부피 ddH 2 영형.
- 5x 달리기 완충액을 준비하십시오 : Trizma 염기 15g, 글리신 72g, SDS 5g, 총 부피 1 ddH 2 O.
- 전달 버퍼 준비 : 2.66 g Trizma 염기, 14.4 g 글리신, 200 mL 100 % 메탄올, 1 L 총 부피 ddH 2 O.
- 10x TBST : 5 ML 1 M 트리스 pH 8.0, 30 ML 5M NaCl, 2.5 ML 트윈 20, 1 L 총 볼륨 H 2 O를 준비합니다.
- 블로킹 솔루션을 준비하십시오 : 1 % TBST에서 4 % w / v 탈지 분유.
- 조직 수거
- 0.4 MG / ML MS222 솔루션에 입욕하여 태아 마취16 , 17 로 옮겨 플라스틱 피펫을 사용하여 균질화 완충액으로 채워진 플라스틱 반응 튜브에 옮긴다. 배아 당 20 μL 버퍼를 사용하십시오. HIF1α 단백질 수준의 중요한 변화를 결정하기 위해서는 4 단계 dpf의 38 또는 7 개의 제브라 피쉬 배아가 적어도 5 마리의 개구리 배아가 필요하다는 점에 유의하십시오.
- 적절한 조직 균질 기 또는 초음파 분쇄기를 사용하여 조직을 균질화하십시오. 원심 분리 (15 분, 13,000 XG, 4 ° C)로 파편을 제거합니다.
- 또는, anaesthetized 개구리 배아에서 망막을 해부 17 위의 균질. 10 개의 망막 당 균질화 완충액 20 μL를 사용하십시오.
- 피펫을 사용하여 85 ° C에서 변성시킨 후 상층 액을 취하여 Laemmli gel loading buffer로 1x v / v의 최종 농도를 보충하십시오 ( 예 : 15 μL homogenate에 4 x Laemmli buffer 5 μL 첨가). 웨스를 위해이 상등액을 사용하십시오.-20 ℃에서 샘플을 얼리거나 동결시킨다.
- 서양 얼룩
- 1x v / v Running buffer를 사용하여 전기 영동 시스템에서 프리 캐스트 12 % 젤에 3.2 단계에서 설명한대로 준비한 샘플을로드하십시오. 단백질 크기 결정을 위해 단백질 사다리를 사용하십시오. 4 ° C에서 얼음에 포장 한 1 시간 동안 전달 버퍼에서 니트로 셀룰로오스 멤브레인 (0.45 μm 막)으로 단백질을 옮기고, 제조사의 프로토콜대로.
- 60 분 동안 차단 완충액에서 멤브레인을 배양하는 비특이적 결합 사이트 차단. 1x TBST에서 3 x 10 분 세척을 계속하십시오.
- RT에서 2.5 시간 동안 Blocking solution에서 각각 1 : 100 v / v와 1 : 5000 v / v로 희석 한 토끼 항 HIF-1α 항체와 마우스 anti-α-tubulin 용액으로 막을 배양한다. 1x TBST에서 3 x 10 분 세척을 계속하십시오.
- 검출을 위해, 염소 항 토끼 및 염소 항 마우스 HRP - 결합 항체를 1 시간 동안 블로킹 용액으로 1 : 1000 v / v로 희석하여 배양한다.1x TBST에서 3 x 10 분 세척 한 후 시판용 키트와 선택 가능한 현상기를 사용하여 HRP 염색을 시각화합니다.
- 디지털 부량을 사용하여 HIF1α 단백질의 양을 정량하십시오.
4. 저산소증에서의 세포 증식 모니터링
- 준비
- 선택의 배아 매체 5 MM EDU 솔루션을 준비합니다. 이 용액은 즉시 사용하거나 분주하고 -20 ° C에서 6 개월 동안 보관할 수 있습니다.
- Phosphate-Buffered Saline (PBS)을 준비하거나 PBS에서 상업 자원을 구입하십시오. 115 ° C에서 10 분간 오토 클레이브.
- EdU 통합 검색 솔루션을 준비하십시오.
- 고정 솔루션을 준비하십시오 : PBS에 16 % 포름 알데히드 재고 솔루션 4 % v / v.
- 자당 용액을 준비하십시오 : PBS에 30 % w / v 자당.
- PBST : PBS 중 0.1 % v / v Triton X-100 준비.
- 블로킹 용액 준비 : 10 % v / v 열 활성 염소 혈청 (HIGS).
- DAPI 솔루션 : PBST에 1 : 1000 v / v 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)을 준비하십시오.
- EdU 도입을위한 저산소 배아의 배양
- 1 % v / v DMSO로 보충 된 5 mM EdU 용액 400-500 mL로 가스 배양 챔버를 채 웁니다. 실험 15 분 전에 실험에 사용 된 동일한 가스 혼합물로 용액을 미리 평형시킨다. 배양 용액의 부피는 짧은 막대 ( 그림 1E )를 메쉬 바닥 판에 붙임으로써 최소화 할 수 있습니다.
- 가스 튜브를 5 % O 2 와 95 % N 2 의 가스 혼합물이 들어있는 가스 실린더에 연결하십시오. 15 분 동안 용액을 부화시킨다.
- 배아를 저산소 챔버로 옮기고 배양액을 균등하게 배양하여 2 시간 동안 배양한다. 각 우물은 무대 38의 개구리 배아 5 개 또는 제브라 피쉬 배아 4 개 dpf까지 7 개까지 넣을 수 있습니다.
- 배아 분석EdU 통합을 위해
- 저산소증 및 EdU 도입시 배아 배양의 시간 경과
- 가스 배양 챔버를 배아 배지 500 mL로 채 웁니다. 가스 튜브를 5 % O 2 와 95 % N 2 의 가스 혼합물이 들어있는 가스 실린더에 연결하고 15 분 동안 가스 혼합물로 매질을 평형시킨다.
- 배아를 저산소 챔버로 옮기고 배양액을 균등하게 배양하여 48 시간 동안 원하는 시간 동안 배양하십시오. 마지막 1 H 들어, 1 %의 V / V DMSO로 보충 5 MM EDU 솔루션으로 배아 매체를 대체하십시오.
- 배아를 정상 산소가있는 접시로 옮기고 EdU 도입을 위해 분석하십시오.
- EdU 통합 탐지 및 분석
- 0.4 MG / ML MS222 솔루션에 입욕하여 태아를 마취.
- 배아를 적절한 유리 병에 옮기고 고정 솔루션에서 2 시간 동안 배양하여 고칠 수 있습니다4 ℃에서 RT 또는 O / N. PBS로 3 x 10 분 씻으십시오. 조심스럽게 조직 cryoprotection에 대한 자당 솔루션에 배아를 전송합니다. 배아가 유리 병의 바닥에 싱크 때까지 또는 4 시간 동안 품어.
- embedding medium (최적의 절삭 온도 화합물)에 배아를 삽입합니다. Cryosection은 즉시 배아를 차단하거나 -80 ° C에서 최대 14 일 동안 저장할 수 있습니다.
- Cryosection은 저온 유지 장치를 사용하여 배아가 들어있는 블록입니다. 현미경 슬라이드에 12 μm (zebrafish 배아) 또는 16 μm (개구리 배아) 두께의 섹션을 수집하고 말리십시오. 즉시 cryosection을 처리하거나 최대 3 개월 동안 -20 ° C에서 보관하십시오.
- 상업용 화학 키트를 사용하여 면역 형광 염색법으로 EdU 도입을 검출합니다. 제조사의 설명에 따라 실험에서 cryosection의 수에 필요한 EdU 반응 믹스의 양을 준비하십시오.
- EdU 반응 믹스 500 μL의 경우, 1X EdU 반응 완충액 430 μL, 2CuSO 4 0 μL, Alexa Fluor azide 1.2 μL, 1X EdU 완충 첨가제 50 μL.
- 조직을 permeabilize PBST와 embedding 매체와 3 X 5 분 제거하기 위해 PBS로 한 번 cryosections을 씻으십시오. cryosection을 Blocking solution으로 30 분 동안 부화시킵니다.
- 1 시간 동안 EdU 반응 믹스와 cryosections를 품어과 PBST에서 3 X 10 분 씻어서 따라 갔다. 15 분 동안 DAPI 용액으로 저온 절편을 유지하고 PBST에서 3 x 10 분 세척합니다. 마운트 매체에 스테인드 cryosections와 함께 마운트, coverslips로 커버하고 형광 현미경으로 분석하기 전에 건조 또는 최대 1 년 동안 4 ° C에서 저장하기 전에 둡니다.
- 거꾸로 공 촛점 스캐닝 현미경하에 안티 EdU 얼룩이있는 cryosections를 분석하고 디지털 부량을 사용하여 EdU 양성 세포의 수를 결정합니다.
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Representative Results
여기에 제시된 저산소 챔버 시스템을 사용하면 전체 생체 내 에서 저산소증의 효과를 개별적으로 또는 생체 내 에서 연구 할 수 있습니다. 저산소증 (hypoxic) 챔버 ( 그림 1 )에 전체 개구리 또는 제브라 피쉬 배아를 놓아서 저산소증을 유발할 수 있으며, 다양한 조건의 조합에 착수 할 수 있습니다. 완성 된 가스 챔버 설정 이미지가 그림 2에 나와 있습니다. 우리는 실험 중 다른 시점에서 광섬유 산소 센서 (2.1.9)를 사용하여 배양 배지의 산소 농도를 모니터링했습니다. 이 데이터는 우리가 실험을 통해 안정한 저산소증 (6-6.5 % 용존 산소)을 유도했다는 것을 나타냅니다 ( 표 1 ).
첫째, 우리는 저산소실에서 유도 된 정상 산소와 저산소증에서 HIF-1α의 유비쿼터스 수준과 망막 수준을 평가했습니다. HIF-1α낮은 산소 농도에서 안정화 된 단백질입니다. 우리는 정상적인 산소 농도 또는 5 % 저산소 상태의 격리 된 전체 개구리 배아 용 해물 및 격리 된 망막의 용질에서 HIF-1α 수준을 측정했다. 그림 3 에서 볼 수 있듯이 HIF-1α는 전체 배아와 망막에서 저산소 상태에서 안정화되었다. HIF - 1α의 안정화는 메쉬 - 바닥 배양 판 ( 그림 S1 )의 다른 우물에서 이루어집니다.
우리가 이전에 보여준 바와 같이, 저산소증은 망막의 섬모 경계 구역 (CMZ)에서 망막 줄기 세포 전구 세포의 증식에 영향을 미친다. 따라서 EdU 도입을 통해 CMZ의 증식을 모니터링하는 것이 저산소증의 성공적인 유도에 좋은 지표입니다. 우리는 5 % 산소를 유지하는 저산소 챔버에서 배아를 배양하고 단계 4.2에서 설명한대로 망막 증식을 평가했다. 예상대로정상 산소 대조 망막은 CMZ에서 강렬한 EdU 염색을 보 였는데, 증식 전구체는 개구리 ( 그림 4B 및 4D )와 제브라 피쉬 태아 ( 그림 5A 및 5C ) 모두에 존재한다. 저산소실에서의 산소 결핍 후, 개구리 ( 그림 4C-4D )와 제브라 피쉬 태아 (그림 5B, 5C)에서 CMZ 전구체 증식의 강력한 감소가 관찰되었다. 효과의 범위를 결정하기 위해 우리는 시간 과정을 수행하여 4.3 시간에 설명 된대로 EdU 통합에 의한 확산을 모니터링하면서 24 시간까지 장기간 저산소 챔버에서 배아를 배양했다. 우리는 망막 전구 세포 증식의 감소가 2 시간 내에 급격하고 가장 컸음을 보여 주며 많은 시간 동안 지속되었다 ( 그림 4D ). 배아는 발달 단계에 따라 정상적으로 발달했다. 이 결과는 우리 시스템이 표적 조직에서 저산소증을 효과적으로 유도 할 수 있음을 시사한다짧은 배양 시간에 흥미를 느낄뿐 아니라 정상적인 배아 발달을지지하면서 더 오랜 기간 동안 이러한 조건을 유지할 수 있습니다.
그림 1 : 실험용 가스 챔버 설치의 개략도. ( A ) 번식 수조 (22 (세로) × 가로 10.5 (높이)) ( B ) 메쉬 바닥 24- 웰 플레이트 (웰 직경 12.8 x 8.6 x 1.7 x 1.5 cm) ( C ) 나일론 ( D ) 터널 10 (길이) x 5 mm (지름) ( E ) 적절한 직경과 길이 30 mm의 테플론 또는 PVC로드 ( F ) 실리콘 튜빙 ( G ) 가스 탱크 원하는 산소 / 이산화탄소 혼합물 ( H ) 분배 밸브 ( I ) 가스 밸브 ( J )아미 디스크 디퓨저 ( K ) 탱크 뚜껑. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 실험용 가스 챔버 설치 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 가스 챔버에서의 상이한 인큐베이션 타임에 따른 산소 농도의 측정 . 이 f의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. igure.
그림 3 : Xenopus 태아 및 그들의 망막에서 저산소증 유도시 증가하는 HIF-1α 수치. 전체 배아 ( A ) 또는 격리 된 배아 망막 ( B )에서 정상적인 산소 농도 또는 저산소 상태로 유지 된 단백질 용 해물의 웨스턴 블 럿트. HIF-1α 아 단위 및 α- 튜 불린에 대해 블롯을 조사 하였다. 각 조건 ( n = 5)에 대해 적어도 5 개의 배아 또는 22 개의 망막을 채취 하였다 ( C, D ) ( A, B )에서 수행 된 웨스턴 블랏의 정량. HIF-1α의 단백질 수준은 α- 튜 불린의 단백질 수준으로 표준화되었다. 오차 막대는 실험 간의 표준 편차를 나타냅니다. * p - 값 <0.05, *** p - 값 <0.001; n = 5이다.d / 55710 / 55710fig3large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 4 : 저산소증은 개구리 태아의 망막 줄기 세포 벽감에있는 전구 세포의 증식을 감소시킵니다. ( A ) 섬모 주변 영역 (CMZ) ( B , C )의 위치를 나타내는 38 단계의 Xenopus 망막을 통과하는 단면의 도식적 표현 38 스테이지에서 DAPI로 염색 된 망막에서 2 시간 EdU 펄스 후 측정 한 EdU 통합 ( B ) 또는 저산소실 ( C )에서 유지되는 개구리 배아. Magenta = DAPI 얼룩; 회색 = EdU 얼룩. 눈금 막대 = 50 μm ( D ) B 및 C 에서 수행 된 실험의 정량화. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. ***
도표 5 : 저산소증은 4 dpf Zebrafish 태아의 망막 줄기 세포 벽감에있는 전구 세포의 증식을 감소시킵니다. 4 dpf 오래된 WTe 제브라 피쉬 배아에서 DAPI로 염색 된 망막에서 2 시간 EdU 펄스 후 측정 한 EdU 도입( A ) 또는 저산소실 ( B ). Magenta : DAPI 얼룩; 회색 : EdU 얼룩. 눈금 막대 = 50 μm ( C ) B 및 C 에서 수행 된 실험의 정량화. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. *** p - 값 <0.001; n = 7. 각 조건에 대해 10-15 개의 망막이 정량화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1 : HIF-1α 수치는 플레이트의 다른 웰과 다른 실험 사이에서 지속적으로 저산소증 유도시 증가합니다. 일반적인 Xenopus 배아의 단백질 용 해물의 웨스턴 블랏실험 1 ( A ) 또는 실험 2 ( B )에서 2 시간 동안 저산소증 유발하에 저산소 챔버의 2 개의 다른 웰에 투여 하였다. HIF-1α 아 단위 및 α- 튜 불린에 대해 블롯을 조사 하였다. 무대 38의 5 마리의 개구리 배아는 각 조건을 위해 취해졌다. 실험 1과 실험 2는 각각 ( A, B )에서 수행 된 서양 블롯의 독립적 인 생물학적 복제 ( C, D ) 정량이다. HIF-1α의 단백질 수준은 α- 튜 불린의 단백질 수준으로 표준화되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서는 개구리 및 제브라 피쉬 배아와 함께 사용하도록 조정 된 저산소증을 유도하는 쉽고도 강력한 새 방법을 제시했지만 다른 수생 생물에도 적합 할 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 단순성과 비용 효율성입니다. 그럼에도 불구하고이 방법으로 얻은 결과는 매우 강력합니다. 우리는 hypoxia가 전체 조직뿐만 아니라 특정 조직 (여기서는 망막)에서 챔버 내에서 효과적으로 유도 될 수 있음을 보여주었습니다. hypoxia 유도의 효과를 결정하기 위해, 우리는 전체 배아와 망막 lysates에서 HIF - 1α 단백질의 수준을 모니터링했습니다. 우리의 결과에 따르면 저산소증에서 HIF-1α 수치의 증가가 저산소실에서 정상 산소 대조군에 비해 관찰 될 수 있고 α-tubulin 수치를 사용하여 전지구 단백질 수준으로 정상화되면 저산소증 유도가 성공적이라고 볼 수 있습니다 컨트롤로. 우리는 줄기 세포 증식 인자를 관찰함으로써 조직에서 저산소증의 활성을 확인했다EdU 조직에 의한 망막의 변화를 관찰 할 수 있었고, 우리가 이전에 발표 한 결과 13 에 따라, 여기 제시된 설정을 사용하여 유도 된 저산소 상태가 개구리 및 제브라 피쉬 배아 모두에서 망막 줄기 세포 증식을 감소 시킨다는 것을 보여줄 수 있었다.
이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 저산소 챔버가 적절히 밀봉되도록하는 것입니다. 그것은 우리의 경우 실리콘 그리스였던 탱크 뚜껑에 적절한 씰을 사용하여 수행됩니다. 또한 인큐베이터 안에 배치하면 추가 장벽을 제공하여 대기 중의 산소가 챔버로 누출되는 것을 방지 할 수 있습니다. 적절한 프로브 또는 전극을 사용하여 산소 농도를 측정하면 저산소 산소 수준이 안정적이고 변동없이 유지됩니다. 또한, 장기간 동안 챔버가 개방되는 것을 피하면서 실험 사이에서 용액이나 샘플을 교환 할 때주의를 기울여야합니다.
주어진 빠른 equil저산소 발생을위한 10-15 분의 진동 시간은 대표적인 결과 (24 시간)보다 긴 시간 동안조차 시스템을 유지하기 위해 약간의 혼합 가스와 낮은 가스 유량이 필요합니다. 실험에 사용 된 용액은 챔버에서 배양하기 전에 15 분 동안 저산소증을 달성하기 위해 사전 평형을 이루어야한다 (4.2.1에서 설명). 우리는 산소 농도 측정 ( 표 1 )에서 알 수 있듯이 오류없이 일정한 저산소 상태의 48 시간 동안 저산소 챔버를 사용했습니다. 정확한 가스 확산은보다 긴 배양 시간 동안 제어되어야한다는 점에 유의해야합니다. 마지막으로, 다른 돌연변이 동물 / 실험 조건에서 배아의 혼합을 피하기 위해 배아를 우물에 배치하는 동안주의를 기울여야합니다 (2.2.1 단계.). 이것은 플레이트의 단일 웰의 비교적 높은 벽을 감안할 때 매우 간단합니다.
단순하지만 효과적 임에도 불구하고저산소 유도를위한 견고한 시스템으로 인해 여기에 설명 된 챔버의 사용에는 값 비싼 배양 용액 및 배지를 사용해야하는 실험에 대한 한 가지 단점이 있습니다. 챔버 탱크의 최소 용적은 400 mL 미만으로 떨어지지 않아야합니다. 그러나 더 낮은 부피에 맞추기 위해 조절할 수 있습니다 : 플레이트 (2.1.4 및 4.2.1)에 부착 된로드 ( 그림 1E )의 길이를 조정하여 미디어 / 솔루션이 50 mL 만 필요할 것입니다 . 배양 시간이 길면 이상적이지는 않지만이 설치는 동일한 가스 튜빙에 적합 할 수 있으며 최대 8 시간 동안 충분한 저산소 상태를 유지하도록 적절히 밀봉 될 수 있습니다.
우리의 가스 챔버 셋업은 모든 수생 모델 생물체와 함께 사용할 수 있으며 단순성, 경제성 및 견고 함으로 다른 상업적으로 이용 가능한 시스템과 차별화됩니다. 마스터 한 후에는 직접적인 생체 내 실험, 특정 기간 및 어떤 욕망에도 사용할 수 있습니다저산소증, 고 산소 또는 다른 가스 혼합물을 포함하는 d 가스 분위기를 포함한다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 웰컴 트러스트 SIA 100329 / Z / 12 / Z에서 WAH 로의 지원과 HK에 수여 된 DFG Fellowship KH 376 / 1-1에서 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl/0.1x MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3/0.1x MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1x MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca(NO3)2/0.1x MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | CG10 | Frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | Gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | Aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | Gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | Hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | Hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | Hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | For embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | Embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | Tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | Tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4x Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4x Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4x Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10x TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | Tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | Tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Oxoid | BR0014G | 1x |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) | Sigma | G6767-100ml | Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | Embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | Mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
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