Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Lysmedieret reversibel modulering af den mitogenaktiverede proteinkinasevej under celledifferentiering og Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55823
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 2, 2, 1,3,4
1Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Comparative Biosciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver en optogenetisk strategi til modulering af mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) aktivitet under celledifferentiering og Xenopus embryonal udvikling. Denne metode muliggør reversibel aktivering af MAPK-signalvejen i pattedyrcellekultur og i multicellulære levende organismer, som Xenopus- embryoner, med høj rumlig og tidsmæssig opløsning.

Abstract

Kinaseaktivitet er afgørende for en overflod af cellulære funktioner, herunder celleproliferation, differentiering, migration og apoptose. Under tidlig embryonal udvikling er kinaseaktiviteten meget dynamisk og udbredt over embryoet. Farmakologiske og genetiske metoder anvendes almindeligt til at sonde kinaseaktiviteter. Desværre er det udfordrende at opnå en bedre rumlig og tidsmæssig opløsning ved hjælp af disse strategier. Endvidere er det ikke muligt at kontrollere kinasaktiviteten på en reversibel måde i levende celler og multicellulære organismer. En sådan begrænsning forbliver en flaskehals for at opnå en kvantitativ forståelse af kinaseaktivitet under udvikling og differentiering. Dette arbejde præsenterer en optogenetisk strategi, der udnytter et bicistronisk system, der indeholder fotoaktiverbare proteiner Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) og det N-terminale domæne i Cryptochrome-interaktive basic-helix-loop-helix (CIBN). ReversiBle-aktivering af den mitogenaktiverede proteinkinase (MAPK) signalveje opnås gennem lysmedieret proteintranslokation i levende celler. Denne fremgangsmåde kan anvendes til pattedyrcellekulturer og levende hvirveldyrembryoner. Dette bicistroniske system kan generaliseres til at kontrollere aktiviteten af ​​andre kinaser med lignende aktiveringsmekanismer og kan anvendes til andre modelsystemer.

Introduction

Vækstfaktorer er involveret i et bredt spektrum af cellefunktioner, herunder proliferation, differentiering, migration og apoptose og spiller pivotale roller i mange biologiske hændelser, herunder embryonal udvikling, aldring og regulering af mental status 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Mange vækstfaktorer signalerer gennem komplekse intracellulære signalkaskader. Disse signaleringshændelser drives ofte af reversibel proteinphosphorylering på en præcis reguleret måde 6 , 7 . Således er en forståelse af signaleringsresultaterne af proteinkinaser, som er ansvarlige for proteinphosphorylering, grundlæggende vigtig.

Forskellige vækstfaktorer virker gennem et ret almindeligt intracellulært signalnetværk, selv om de stimulerer distInkt cellulære responser 8 , 9 . Almindelige intracellulære mediatorer af receptortyrosinkinaser indbefatter Ras, Raf, ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK), mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) / ERK-kinase (MEK), phosphoinositid-3-kinase (PI3K), Akt og phospholipase C gamma (PLCy) 10 , 11 . Akkumulerende beviser tyder på, at signaleringsdiversitet og specificitet afhænger af rumlig og tidsmæssig regulering af signalaktivitet 12 . For eksempel aktiverer epidermal vækstfaktor (EGF) stimulering i rottefokromocytomceller (PC12), som resulterer i celleproliferation, transient aktiveringen af ​​ERK-pathway 9 . På den anden side aktiverer stimulering med nervevækstfaktor (NGF), som fører til celledifferentiering, aktiviteten af ​​ERK-vejen på en vedvarende måde 9 , 13 . I dyrkede rVed hippocampale neuroner fremmer transient signalering af hjerneafledt neurotrof faktor (BDNF) primær neuritudvækst, mens vedvarende signalering fører til øget neuritforgrening 14 . Under tidlig embryonal udvikling er phosphoryleret ERK-aktivitet temporalt dynamisk og er udbredt på tværs af embryoet 6 . En nylig genetisk skærm under tidlig Xenopus embryogenese viste, at ERK- og Akt-signaleringskaskader, to nedstrøms primære vækstfaktorveje, viser scenespecifikke aktiveringsprofiler 7 . En forståelse af kinasignaliseringsresultater kræver således værktøjer, der kan sonde de rumlige og tidsmæssige egenskaber ved kinaseaktivitet med tilstrækkelig opløsning.

Konventionelle eksperimentelle fremgangsmåder til at undersøge den dynamiske natur af signaltransduktion under udvikling mangler den ønskelige rumlige og tidsmæssige opløsning. F.eks. Udnytter farmakologiske fremgangsmåder lille kemIcal eller biologiske molekyler til at stimulere eller undertrykke signaltransduktion i celler og væv. Disse små molekylers diffusive natur gør det udfordrende at begrænse deres handling til en bestemt region af interesse 15 . Genetiske tilgange ( fx transgenese, Cre-Lox-systemet eller mutagenese) fører ofte til den irreversible aktivering eller undertrykkelse af målgenekspression eller proteinaktivitet 16 , 17 , 18 . Tet-On / Tet-Off-systemet 19 tilbyder forbedret temporal kontrol af gentranskription, men mangler streng rumlig kontrol, fordi den er afhængig af diffusionen af ​​tetracyclin. Nylige udviklinger i kemisk induceret proteindimerisering 20 eller foto-uncaging 21 , 22 , 23 , 24 har kraftigt forbedringRedegjorde for den tidsmæssige kontrol af signalnetværk. Den rumlige kontrol forbliver dog udfordrende på grund af den diffusive karakter af de kendte kemikalier.

Nyligt fremkomne optogenetiske fremgangsmåder, som udnytter lysets evne til at kontrollere protein-protein-interaktioner, muliggør modulering af signalveje med høj spatiotemporal præcision såvel som reversibilitet. Kort efter sin oprindelige succes i styringen af ​​neuronfyring 25 , 26 , 27 er optogenetikum blevet udvidet til at kontrollere andre cellulære processer, såsom gentransskription, translation, celle-migration, differentiering og apoptose 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . En strategi der bruger pHotoaktiverbart proteinpar Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) protein og det N-terminale domæne af kryptokrom-interagerende basic-helix-loop-helix (CIBN) blev for nylig udviklet til at kontrollere Rafl-kinaseaktivitet i pattedyrceller og Xenopus- embryoner 35 . CRY2 binder til CIBN ved blåt lys stimulering, og CRY2 / CIBN proteinkomplekset dissocierer spontant i mørket 34 . Blåt lys exciterer CRY2 cofactor, flavin adenin dinucleotid (FAD), hvilket fører til en konformationel ændring i CRY2 og dens efterfølgende binding til CIBN. Konstitutivt aktive (W374A) og flavin-deficiente (D387A) -mutanter af CRY2 kan fremstilles gennem mutationer i FAD-bindingslommen: CRY2 W374A- mutanten binder til CIBN uafhængig af lys, mens CRY2 D387A- mutanten ikke binder til CIBN under blå -lys stimulering 36 , 37 . Det optogenetiske system beskrevet iN denne protokol anvender vildtype CRY2 og CIBN til at inducere proteintranslokationsmedieret Raf1-aktivering i levende celler. Det er kendt, at membranrekruteringen af ​​Raf1 øger dens aktivitet 38 . I dette system er et tandem CIBN-modul forankret i plasmamembranen, og CRY2-mCherry er fusioneret til N-terminalen af ​​Raf1 35 . I mangel af blåt lys forbliver CRY2-mCherry-Raf1 i cytoplasmaet, og Raf1 er inaktivt. Blålys stimulering inducerer CRY2-CIBN binding og rekrutterer Raf1 til plasmamembranen, hvor Raf1 aktiveres. Rafaktivering stimulerer en Raf / MEK / ERK signaleringskaskade. Både CRY2- og CIBN-fusionsproteiner er kodet i et bicistronisk genetisk system. Denne strategi kan generaliseres til at kontrollere andre kinaser, såsom Akt, hvis aktiveringstilstand også kan tændes ved proteintranslokation i celler 39 . Dette arbejde præsenterer detaljerede protokoller til gennemførelse af denne optogenetiske strategi i pattedyrcellekultusRes og multicellular organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Animal forskning blev udført i overensstemmelse med retningslinjer fastsat af Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og University of Illinois Department of Animal Resources (DAR).

1. Optogenetisk Induktion af Protein Lokalisering i BHK21 Mammal Cell Cell Culture

BEMÆRK: Trin 1.1-1.3 giver en metode til at samle et cellekulturkammer til billeddannelse med høje forstørrelsesmål ( f.eks. 63X eller 100X), som typisk har korte arbejdsafstande. Disse mål kræver et tyndt glasdækslip ( f.eks. # 1,5, 170 μm tykkelse) som billeddannende substrat. Alternativt kan en glasbundet celledyrkningsskål / dias anvendes. I et sådant tilfælde kan trin 1.1-1.3 springes over.

  1. Rengøring af glasdæksler
    1. Placer 30 glasdækslip i en afdækningsholder.
    2. I et 600 ml plastbægre tilsættes 20 g vaskemiddel og 400 ml varmt vand fra vandet. PlacE bægeret på en magnetisk omrører og rør indtil alt detergent er opløst. Fjern skummet med tissuepapir.
    3. Brug bunden af ​​en 100 mm x 15 mm petriskål som spacer fra omrøringsstangen og som overflade til dækslipholderen. For at opretholde tilstrækkelig strømning under rengøringsprocessen, lav 3-4 dræningshuller i petriskålen.
    4. For at lave dræningshullerne opvarmes et loddejern og brændes gennem plastik i en ventileret hætte.
      FORSIGTIG: Berør ikke det opvarmede loddejern med bare hænder.
    5. Placer afdækningsholderen på petriskålen i bægeret. Omrør i 2 timer til natten ved stuetemperatur.
    6. Vask tre gange med 500 ml DI vand i et 1000 ml bægerglas. Vaskemiddelopløsningen kan genanvendes.
    7. Pick up individuelle coverlips med tang. Dæk dækslerne i 190-proof (95%) ethanol i 1 min.
    8. Tør dækslisterne i en steril hætte. Opbevar dækslerne i en steril plastbeholder indtil brug.
    9. Fremstilling af poly-L-lysin (PLL) -coated coverlips
      1. Lav 0,1 M boratbuffer ved at opløse 1,24 g borsyre og 1,9 g dinatriumtetraborat i 400 ml vand. Juster pH til 8,5 med 10 M NaOH.
      2. Opløs PLL i boratbufferen til en slutkoncentration på 1 mg / ml. Aliquot PLL-opløsningen i 50 ml sterile centrifugerør.
      3. Tilsæt 50 ml PLL belægningsløsning til en 10 cm vævskulturskål. Placer opskålen i en 37 ° C inkubator for at opvarme PLL-opløsningen.
      4. Åbn afdækningsbeholderen (trin 1.1.8) i en steril hætte.
      5. Sænk de rensede dækglas en efter en i den forvarmede PLL-opløsning i vævskulturskålen. Undgå bobleformation for at dyppe alle overflader.
      6. Placér parabolen med dækslet i en 37 ° C CO 2 inkubator natten over. Tag hver dæksel ud og læg den i en steril dækselholder. Skyl tre gange med autoklaveret ultrapure vand (18,2 MΩ & #183; cm resistivitet) i et 1000 ml bæger i en steril hætte.
      7. Tør dækslipene i afdækningsholderen i den sterile hætte. Opbevar dækslerne i en steril plastbeholder indtil brug.
    10. Montering af polydimethylsiloxan (PDMS) cellekulturkamre
      1. I en plastikbeholder vejer 40 g PDMS base og tilsæt 4 g hærdemiddel for at opnå et 10: 1 vægt / vægtforhold af PDMS og hærdemiddel. Bland PDMS / hærdningsmidlet ved omrøring med en pipettespids i 2 minutter. Alternativt kan du bruge en centrifugalblander.
      2. Brug et bægerglas med en diameter på 4 tommer som en skabelon til at gøre en holder med et stykke aluminiumsfolie. Placer aluminiumfolieholderen i en 15 cm petriskål. Anbring en 4 tommer siliciumskive i denne aluminiumsfolieholder.
      3. Hæld den blandede PDMS-opløsning i holderen. Brug en tynd glasstang til forsigtigt at berøre kanten af ​​waferen. Fjern eventuelle luftbobler fanget under waferen.
      4. Indsæt 15 cm petriskålen i et vakuumkambeR til afgassning af PDMS-opløsningen. Fortsæt afgassning i ca. 20 minutter, indtil der ikke genereres bobler. I mellemtiden forvarme en konvektionsovn til 65 ° C.
      5. Anbring forsigtigt 15 cm petriskålen i ovnen. Inkubér i 2 timer.
      6. Fjern pladen fra ovnen. Brug en glasstang til forsigtigt at berøre kanten af ​​PDMS og sikre fuldstændig tværbinding. Hvis ikke, inkuber længere, indtil PDMS er fast og ikke klæbrigt.
      7. Fjern aluminiumfolien fra pladen og skræl den af ​​siliciumpladen. Start fra kanten, skyll forsigtigt de hærdede PDMS ud af siliciumpladen.
        FORSIGTIG: Undgå at anvende for meget kraft, da det kan bryde waferen.
      8. Trim PDMS i 20 mm x 30 mm rektangulære stykker for at passe 24 mm x 40 mm dækslip med et barberblad.
      9. Brug et mejselformet blad til at skære en rektangulær åbning på 10 mm x 20 mm fra midten af ​​hvert PDMS stykke.
      10. Rengør PDMS-kamrene ved hjælp af detergentprotokollen beskrevet i trin 1.1.
      11. Tør PDMS-kamrene i en ren hætte. Placer de tørre kamre i en autoklaverbar beholder dækket af aluminiumsfolie.
      12. Autoklaver beholderen ved hjælp af tyngdekraften (121 ° C, 15 psi) i 30 minutter og opbevar beholderen ved stuetemperatur.
    11. BHK21-celledyrkning og transfektion
      1. Lav 500 ml medium til BHK21-cellekultur ved at blande 445 ml DMEM med 50 ml FBS og 5 ml 100 × Penn-Strep-Glutamin (10.000 U / ml penicillin, 10 mg / ml streptomycin og 29,2 mg / ml L -glutamin). Sørg for, at den endelige koncentration af FBS er 10%.
      2. Aliquot 10 ml ikke-HEPES CO 2 -afhængigt medium til levende-celledannelse.
        BEMÆRK: CO 2 -afhængigt medium understøtter cellevækst uden en CO 2- inkubator og er ideel til billeddannelse af celler under atmosfæriske forhold. Se Materialelisten for detaljerede oplysninger. Foruden BHK21 cellelinien bør andre typer af pattedyrceller også giveLignende resultater.
      3. Saml en cellekulturindretning ved at anbringe et autoklaveret, sterilt PDMS-kammer (trin 1.3) på en steril PLL-belagt dækslip (trin 1.2) i en steril hætte.
      4. Placer hver enhed i en steril 60 mm petriskål.
      5. Brug 0,5 ml 0,25% trypsin til at løsne cellerne fra en brønd i en 12-brønd vævskulturplade. Tæl celletætheden med et hæmocytometer. Plad 20.000 BHK21 celler i kammeret (ca. 10.000 celler / cm2) med 200 μl cellekulturmedium.
      6. Klargør DNA-plasmid med et plasmidforberedelsessæt (se Materialelisten).
        BEMÆRK: Designet og funktionaliteten af ​​CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX er vist i figur 1A - 1B .
      7. 24 timer efter celleplettering transficere cellerne med 50-100 ng CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX plasmid i overensstemmelse med producentens protokol.
      8. Tre (3) timer efter transfektion, skift mEdium til 200 μl frisk dyrkningsmedium (trin 1.4.1) og lade cellerne tilbagesøge natten over ved at inkubere kulturen i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator.
    12. Fluorescens levende celle billeddannelse
      1. Tænd en computer, lyskilde, mikroskop og kamera. Brug et konfokal fluorescensmikroskop (udstyret med et 100X olie-nedsænkningsmål) for resten af ​​protokollen.
        BEMÆRK: Et inverteret epifluorescensmikroskop kan også anvendes.
      2. Udskift cellekulturmediet med 200 μl CO 2 -afhængigt medium.
      3. Indstil data-overtagelsesprotokollen, før cellerne placeres på mikroskopet. Brug 488 nm excitation FITC kanal til optogenetisk stimulering. Brug 561 nm excitations TRITC kanal til at lokalisere transfekterede celler og spore cellelokalisering af mCherry-mærket protein.
      4. Indstil forstærkningen af ​​FITC og TRITC-kanaler som henholdsvis 120 og 200. Brug en pixel-boligtidspunkt på 2,21; s og størrelse 512 x 512 pixels.
      5. Mål kraften i 488 nm-lyset ved at placere en effektmåler tæt på objektivvinduet. En total effekt på 2 μW (ca. 10.000 W / cm2 ved fokus) er tilstrækkelig til at inducere CIBN-CRY2PHR-forening.
      6. Opsæt en tidsstempelforbindelse med et 5 s interval og en samlet opkøbstid på 2 min.
      7. Anbring passende indeks-matchende materiale (nedsænkning af olie) på objektivvinduet. Brug fasekontrasttilstanden til at fokusere på cellerne på dækslipfladen.
      8. Find en transficeret celle under 561 nm lys ved at flytte mikroskopetrinnet.
        FORSIGTIG: Undgå at bruge blåt lys under dette trin, da det vil aktivere forbindelsen mellem fotoaktiverbare proteiner.
      9. Når en transficeret celle er placeret, skal du indlede dataindsamling.
        BEMÆRK: Transficerede celler skal med succes vise fluorescens i både FITC (fra 2CIBN-GFP-CaaX) og TRITC (fra CRY2-mCherry-Raf1) kanaler ( Figur 1C-D
      10. Optag en række tidsstemplede billeder i både FITC- og TRITC-kanalerne ( Figur 1D ).
      11. For at afprøve den spontane dissociation af CRY2-CIBN-proteinkomplekset registreres en anden tidsstempel med Txred-kanalen alene i 20 minutter med et interval på 30 s.
      12. Gem det tidsstemplede billede til dataanalyse.
    13. Billedanalyse
      1. Åbn billederne med en billedanalysesoftware, der kan udtrække intensiteten fra et billede 40 .
      2. Vælg to repræsentative snapshots: et før blåt lys eksponering og den anden eksponering efter blåt lys.
      3. Tegn en linje på tværs af cellen, der spænder over baggrunden, plasmamembranen og cytoplasmaet. Projicere intensiteten langs denne linje. Gem værdierne og plot dem ud for at sammenligne forskellen før og efter lys eksponering ( Figur 1D ).
      4. For at analysere proteinforeningens kinetik selecT et repræsentativt område af interesse (ROI) i plasmamembranen, et ROI i cytoplasmaet og et ROI i baggrunden.
      5. Opnå de gennemsnitlige intensiteter af plasmamembranen (I PM ), cytoplasmaet (I CYT ) og baggrunden (I BKD ) for billedstakken.
      6. Beregn forholdet mellem membran / cytosolisk intensitet for hvert billede ved brug af følgende ligning:
        Ligning 1
      7. Plot forholdet versus tid og bestem bindings- eller dissociationskinetikken for CRY2-CIBN ( Figur 1E -F ).

    2. Opførelse af et LED-array til langsigtet lysstimulering i en CO 2- inkubator

    BEMÆRK: Den overordnede skematiske af eksperimentelle opsætning er vist i figur 2A .

    1. Lav LED-arrayet ved at indsætte 12 blå LED'er i to brødboerDs og forbinder strømbegrænsende modstande.
      BEMÆRK: Med en 30 V strømforsyning kan fire LED'er tilsluttes i serie, og deres lysstyrke kan styres af en strømbegrænsende modstand.
    2. Sæt brødbrætene i en aluminiumskasse.
      BEMÆRK: Aluminiumsbeholderens højde skal være 2 cm. Denne højde er optimal til belysning af en 12-brønds vævskulturplade, fordi størrelsen af ​​det divergerende lyspunkt er det samme som for en enkelt brønd.
    3. Brug to metaltråde til at forbinde til strømforsyningen. Sørg for, at ledningens længde er tilstrækkelig, når lysboksen er anbragt inde i en CO 2- inkubator.
    4. Brug en gennemsigtig lysdiffusor som dækslet til lysboksen ( figur 2C ).
    5. Kalibrere effekten af ​​hver LED på en række spændingsindgange. Brug en effekt på 0,2 mW / cm 2 til 24 h PC12-celledifferentieringsassayet. Brug en effekt på 5 mW / cm 2 til levende Xenopus embryoner eller eksplantaterassays.

    3. Optogenetisk induktion af PC12-celledifferentiering

    1. Cellekultur og transfektion
      1. Lav 500 ml medium til en cellekultur med rottefeochromocytom (PC12) ved at blande 407,5 ml F12K med 75 ml hesteserum + 12,5 ml FBS + 5 ml 100 × Penn-Strep-Glutamin (slutkoncentrationer af hesteserum og FBS : Henholdsvis 15% og 2,5%). Lav lav-serummedium ved at blande 1 volumen fuldmedium i 99 volumener F12K-medium.
      2. Plade PC12 celler i en 12-brønds plade med en tæthed på 300.000 celler / brønd eller 75.000 celler / cm2.
      3. Transfekter cellerne med CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX 24 timer efter celleplating (svarende til trin 1.4.7). Brug 1,2 μg DNA til hver brønd. Lad cellerne tilbagesøge natten over i dyrkningsmedium i en 37 ° C inkubator suppleret med 5% CO2. Kontroller transfektionseffektiviteten 16 timer efter transfektion.
        BEMÆRK: En 30-50% transfektion effDer bør opnås en effektivitet for at sikre et tilstrækkeligt antal celler.
      4. Ændre mediet til lavt serummedium 24 timer efter transfektion. Brug 1 ml medium pr. Brønd af en 12-brønds plade.
    2. Lysinduceret PC12 celledifferentiering
      1. Placer LED-arrayet i en CO 2- inkubator. Slut det til strømforsyningen ved hjælp af et par ledninger. Indstil LED'ens effekt til 0,2 mW / cm 2 . Placer 12-brøndspladen indeholdende transficerede PC12-celler (trin 3.1.3) på LED-arrayets vindue. Anvend kontinuerlig lysbelysning i 24 timer i en 37 ° C inkubator suppleret med 5% CO2.
    3. Fluorescens levende celle billeddannelse
      1. Følg trin 1.5.1-1.5.4 for mikroskop og prøve forberedelse.
      2. Indstil enkelt-øjebliks dataindsamling. Brug 200 ms til både GFP og Txred kanalen.
      3. Optag billeder af de transficerede celler i både GFP- og Txred-kanalerne. Optag ca. 200 celLs for hver tilstand. Gem filerne til dataanalyse.
    4. Billedanalyse
      1. Tæl procentdelen af ​​differentierede celler over det samlede antal transfekterede celler.
      2. Brug et celletællermodul i billedanalyseprogrammet til at tælle cellerne.
      3. Tæller manuelt de differentierede celler.
        BEMÆRK: Differentierede celler defineres som dem, hvor mindst en neurit er synlig længere end cellelegemet ( Figur 3A -3B ).
      4. Gentag trin 3.4.3 med udifferentierede celler.
      5. Beregn differentieringsforholdet ved hjælp af følgende ligning:
        Ligning 2

    4. Optogenetisk kontrol af kinaseaktivitet i Xenopus embryoer

    1. Fremstilling af buffere
      1. Forbered 1 l af 1x Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mMNaCl, 2 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 og 5 mM HEPES; PH 7,5.
    2. Fremstilling af mRNA
      1. Fordøj CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX plasmid-DNA'et (2 μg) med 1 μl ApaI (50 enheder) ved 37 ° C i 2 timer.
      2. Præcipiterer lineariseret DNA i 60 μl 100% ethanol. Spin ved 12.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at pille DNA'et. Fjern forsigtigt supernatanten og vask pellet igen med 60 μl 70% ethanol. Spin ved 12.000 × g i yderligere 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt supernatanten og resuspender DNA-pellet i 6 μl RNase-fri H20.
      3. Udfør in vitro transkription ved inkubering af 1 μg lineariseret DNA med 2 μl leveret SP6 RNA polymerase, en ribonucleotid blanding (10 mM ATP, CTP og UTP; 2 mM GTP og 8 mM cap analog) og 20 μl nuklease- Frit vand ved stuetemperatur i 1 time.
      4. Fjern DNA-skabelon ved DNase I-fordøjelse ved 37 ° C i mindst 15 minutter og rens det syntetiserede RNA ved anvendelse af en silicium-membran-spin-søjle.
      5. Stop reaktionen og præcipiter RNA'et ved at tilsætte 30 μl nukleasefrit vand og 30 μl LiCl-udfældningsopløsning. Bland grundigt og chill i 30 minutter ved -20 ° C.
      6. Centrifuger ved 4 ° C i 15 minutter ved 12.000 x g for at pille RNA'et.
      7. Fjern forsigtigt supernatanten. Vask RNA en gang med 1 ml 70% ethanol og resuspender i 40 μl nukleasefrit vand.
      8. Indlæs 40 μL RNA i en rotationssøjle. Centrifuger ved 4 ° C i 1 minut ved 12.000 x g for at fjerne de inkorporerede nukleotider og hætter.
    3. Harvest Xenopus embryoner
      1. Følg protokollen beskrevet af Sive et al. 41 for at opnå Xenopus embryoer.
    4. MRNA mikroinjektion
      1. fabrikereNåle til mikroinjektion ved at trække glaskapillærer med en kapillærtræk. Indstil trækkeprogrammet til: varme = 355, trækstyrke = 80, hastighed = 50 og tid = 100.
      2. Fjern jellyfrakken fra embryonerne ved at behandle dem med 3% cystein (fortyndet i 0,2x MMR).
      3. Overfør embryonerne til 3% polysucrose og 0,5x MMR opløsning til mikroinjektion. Injicer 500 pg til 1 ng CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA i hvert embryo.
        BEMÆRK: Injektion af en dosis højere end 1 ng resulterer i blå lysuafhængig aktivering af MAPK-signalering.
    5. Optogenetisk stimulering af kinaseaktivitet
      1. Kultur mikroinjicerede embryoner i 3% polysucrose, 0,5x MMR opløsning ved stuetemperatur, indtil de når midten gastrula fase (trin 12). Derefter dyrk embryoerne i 0,2x MMR opløsning.
      2. Overfør embryoner eller eksplanterede stoffer til en 12-brønds plade. Placer 12-brøndspladen på det hjemme-indbyggede LED-array (trin 2.5) for blå-lighT (475 nm) behandling.
      3. Placer et spejl på toppen af ​​12-brøndspladen for at sikre fuld blåt lysbelysning af embryoner eller eksplanter.
      4. Indstil kraften i det blå lys til 5 mW / cm 2 .
        BEMÆRK: Blålysbehandling kan udføres på et hvilket som helst ønsket tidspunkt i enten 3% polysucrose, 0,5x MMR opløsning eller 0,2x MMR opløsning.
      5. Høst embryoerne til enhver tid. Brug dem til histologisk, Western-blot eller gen-ekspressionsanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ratiometrisk ekspression af fotoaktiverbare proteinpar: Figur 1A viser designet af en bicistronisk optogenetisk konstruktion, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (betegnet CRY2-2A-2CIBN) baseret på porcine teschovirum- 1 2A (P2A) peptid, som viser den højeste ribosom-skipping effektivitet blandt pattedyrcellelinier 42 . I tidligere arbejde er det blevet fastslået, at det optimale forhold for CIBN-GFP-CaaX: CRY2-mCherry-Raf1 er 2: 1 35 . Denne konfiguration muliggør tilstrækkelig membranrekruttering og aktivering af CRY2-mCherry-Raf1 ( figur 1B ). Celler, der alene transficeres med CRY2-2A-2CIBN, viser tydelig fluorescens i både GFP- og Txred-fluorescerende kanaler, enten under epi-belysning ( figur 1C ) eller konfokalmikroskopi ( figur 1D ). Blå lysmedieret membranNe rekruttering af CRY2-mCherry-Raf1 ( Figur 1D ) kan tydeligt detekteres i konfokal mikroskopi. Forbindelsen sker inden for få sekunder efter blåt lys eksponering ( Figur 1E ), og CRY2-CIBN proteinkomplekset dissocieres med en halveringstid på ca. 5,5 min. ( Figur 1F ).

Lysstyret PC12-celledifferentiering i fravær af nervevækstfaktor: En spændende observation i vækstfaktorsignaleringen er, at almindelige nedstrøms signalveje ( f.eks. ERK, PI3K-Akt og PLCγ) fremkalder mangfoldighed og specificitet i signalresponser. En bedre forståelse af vækstfaktormedieret signalering kan opnås ved at muliggøre teknologi, der muliggør den præcise spatiotemporale regulering af individuelle kaskader. Den optogenetiske tilgang, der indføres i denne protokol, demonstrerer en sådan teknologi, der muliggør den specifikke aktiveringN af Raf / MEK / ERK signalvejen med høj temporal opløsning. Fordi denne fremgangsmåde omgår processen med NGF-binding til dets membranreceptorer, afhænger signaleringskinetikken ikke længere af de endogene receptorer. I stedet kan en præcis kinetisk kontrol opnås ved at modulere stimulatorlysets tidsmæssige profil ( figur 2A ). Denne fremgangsmåde åbner således nye muligheder for at studere kinaseaktivitetens signalkinetik. Derudover giver denne eksperimentelle opsætning en ekstremt enkel og økonomisk måde at integrere den optogenetiske tilgang til i studier af intracellulær signaltransduktion ( figur 2B -2D ). Til PC12-celledifferentieringsassayet er en 24-timers kontinuerlig lysstimulering ved 0,2 mW / cm2 tilstrækkelig til at inducere signifikant neuritudvækst ( Figur 3A ). Negative kontroller, herunder transficerede celler uden lys ( Figur 3B) og ikke-transficerede celler med eller uden lys ( Figur 3C -3D ), viser ikke signifikant neuritudvækst. Ved denne effekt undergår celler transficeret med en konstitutivt aktiv Raf1 (CA-Raf1) normal differentiering ( Figur 3E ). Specielt producerer celler transficeret med den bicistroniske optogenetiske konstruktion et signifikant højere differentieringsforhold end celler co-transficeret med to konstruktioner, hvilket når værdien induceret af CA-Raf1 ( figur 3F ). Differentieringsforholdet beregnes ved at dividere antallet af differentierede celler med antallet af transficerede celler styret af GFP-fluorescens. Differentierede celler defineres som dem med mindst en neurit længere end størrelsen af ​​cellelegemet 35 . Denne forbedring i differentieringsforholdet stammer fra: 1) en bedre levering af fotoaktiverbare proteiner med det bicistroniske system og 2) en opTidsbegrænset ekspressionsforhold mellem CIBN og CRY2 35 .

Den reversible optogenetiske stimulering af Raf / MEK / ERK signalvejen i levende Xenopus laevis embryoner: X. laevis er en veletableret modelorganisme til undersøgelse af gentranskription, signaltransduktion og embryonisk udvikling. Tidligere arbejde har opdaget, at aktiveringen af ​​Raf / MEK / ERK-banen fører til en ændring i celleforandring, hvilket resulterer i dannelsen af ​​en ektopisk hale-lignende struktur ved tailbud-scenen 43 . Som en kraftig mesoderminducer kan overudtrykt Raf1 fremkalde ektopisk mesoderm under kimlagsspecifikationen, som forekommer under blastula og tidlige gastrula stadier, og resulterer i dannelsen af ​​ektopiske hale-lignende strukturer senere. Alternativt kan overudtrykt Raf1 udløse en epithelial-mesenchymal overgang (EMT) -lignende begivenhed efter at kimlagsspecifikationen har afsluttet og kan direkteTransformere ektoderm til neurale og mesoderm lineages. Dette efterfølges af spredning og udvidelse af disse strukturer 43 . I disse eksperimenter blev RNA'er kodende for MET-receptor, Ras og Raf1 injiceret i embryoner i tocellefasen. Kort efter, at RNA blev injiceret i embryoet, begyndte det overudtrykte MET / Ras / Raf1 at konstitutivt aktivere nedstrøms signaleringskaskader. Derfor var det teknisk udfordrende at omgå de tidlige udviklingsstadier og aktivere Raf1 specifikt efter kimlagsspecifikation. Det var umuligt at anvende en sådan strategi til at bestemme, om aktivering af Raf / MEK / ERK-signalering efter kimlagsspecifikation ville fremkalde en ændring i celleforløb, hvilket resulterede i dannelsen af ​​den ektopiske hale-lignende struktur.

Optogenetics giver en mekanisme til at styre timingen af ​​Raf1 aktivitet. Når RNA af CRY2-2A-2CIBN blev injiceret i embryoner i tidlig udviklingsstadiumS, Raf1 forblev inaktiv indtil det blå lys blev leveret. Animal cap testet blev bekvemt brugt til at karakterisere signaludfaldet, fordi den basale ERK aktivitet er lav i dyrehætter. Den lysmedierede aktivering af Raf / MEK / ERK signaleringskaskaden inducerede en signifikant opregulering af xbra, en mesodermal markør, som bestemt ved RT-PCR ( Figur 4A ) eller helmonteret in situ hybridisering ( Figur 4B ). Dynamiske ændringer i phosphoryleringen af ​​ERK som reaktion på blåt lys blev også påvist ved Western-blot-analyse ( figur 4C ). I hele embryoner blev en blanding af CRY2-2A-2CIBN og n-β-gal-RNA injiceret i 8-celletrinnet i et af de dorsale dyrblastomerer, som senere giver anledning til dorsalt anteriorvæv. Sammenlignet med ubehandlede embryoner ( Figur 4D -4E ) injiceres de injicerede med CRY2-2A-2CIBN og behandles med blåt lys tilMed ektopiske hale-lignende strukturer ( figur 4F -4G ). Injicerede embryoner i mørket ( Figur 4H ) eller uinjiceret under blåt lysbelysning ( Figur 4I ) dannede ikke hale-lignende struktur. Blålysbelysning efter kimlagsspecifikation inducerede betydelige hale-lignende strukturer ( Figur 4J ).

figur 1
Figur 1: Mekanismen for lysinduceret proteinlokalisering og aktivering af kinasignaliseringsvejen. ( A ) Design af en bicistronisk konstruktion med et optimeret CIBN-til-CRY2-forhold (2 CIBN: 1 CRY2), som muliggør den lysinducerede aktivering af Raf / MEK / ERK-kinase-signalvejen. Ved ribosomal skipping genererer et mRNA-transkript to proteiner: CRY2-mCherry-Raf1-N2A (slutterMed aminosyrer NPG) og prolin-2CIBN-GFP-CaaX. ( B ) Lysinduceret binding mellem CIBN og CRY2 fører til membranrekruttering af CRY2-mCherry-Raf1, som aktiverer Raf / MEK / ERK signalvejen. ( C ) Fluorescensbilleder af BHK21-celler transficeret med CRY2-2A-2CIBN under epi-belysning. Skalestang: 20 μm. ( D ) Konfokal fluorescensbilleddannelse af celler transficeret med CRY2-2A-2CIBN. Det venstre panel viser spaltet 2CIBN-GFP-CaaX lokaliseret på plasmamembranen; Midtpanelet viser et øjebliksbillede af CRY2-mCherry-Raf1 inden blåt lys stimulering; Højre panel viser et snapshot af CRY2-mCherry-Raf1 efter 10 pulser med blåt lys stimulering. Bundpanelet viser normaliserede intensitetsprofiler langs en gul prikket linje over cellen, før og efter lysstimulering. Skalbjælke = 20 μm. ( E - F ) Kinetik for lysinduceret CRY2-CIBN-forening ( E ) og spontan dissociatioN ( F ) af CRY2-CIBN-proteinkomplekset i mørket. Figur 1A- B blev tilpasset fra reference 35 , reproduceret med tilladelse fra selskabet af biologer. Figur 1E -F blev tilpasset fra reference 44 under Creative Commons Attribution (CC BY) -licensen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Design og kalibrering af det hjemmebyggede LED-array. ( A ) Skematisk af eksperimentelle opsætninger for den lysstyrede kinaseaktivitet i levende celler. ( B ) Kredsløbsplade til det hjemmebyggede LED-array. ( C ) En ligHt boks, der kan bruges til langsigtet lysstimulering i en CO 2 inkubator. Højden på aluminiumskassen er 2 tommer. ( D ) Typisk LED udgangseffekt versus spænding. Værdier lysstyrken pr. LED i et kredsløb, hvor en strømbegrænsende modstand og fire lysdioder er forbundet i serie. Figur 2A blev tilpasset fra reference 35 , reproduceret med tilladelse fra selskabet af biologer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Optogenetisk induktion af PC12-celledifferentiering. ( A ) Multikanals snapshots af PC12-celler transficeret med CRY2-2A-2CIBN efter 24 timers blåt lysstimulering (0,2 mW / cm 2 ). En cIrcle markerer en differentieret celle. En firkant markerer en udifferentieret celle. ( B ) Samme som ( A ), medmindre der ikke blev anvendt blåt lys stimulering. ( C - D ) Ikke-transficerede PC12-celler under 24 timer med blåt lysstimulering (0,2 mW / cm2) ( C ) eller mørk inkubation ( D ). ( E ) Repræsentative billeder af celler transficeret med Raf1-GFP-CaaX (CA-Raf1). Cirkel og rektangel markerer differentierede og udifferentierede celler. ( F ) Differentieringsforhold for PC12-celler transficeret med CA-Raf1, co-transficeret med CRY2-mCherry-Raf1 og CIBN-GFP-CaaX og transficeret enkelt med CRY2-2A-2CIBN. 24 timer efter transfektion blev celler enten udsat for lys eller inkuberet i mørke i yderligere 24 timer. Værdierne repræsenterer middelværdien ± SD fra fire uafhængige datasæt. Kun celler udsat for blåt lys viste signifikant differentiering. Figur 3FBlev tilpasset fra reference 35 , gengivet med tilladelse fra selskabet af biologer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Optogenetisk induktion af kinaseaktivitet i levende Xenopus- embryoner. ( A ) RT-PCR-resultater, der viste, at eksponering for blåt lys inducerede ekspressionen af xbra, en pan-mesodermal markør, i CRY2-2A-2CIBN-injicerede dyrekapsler i det tidlige gastrula stadium. ( B ) Helmonteret in situ hybridisering af xbra i embryoner . Lysinduceret aktivering af MAPK-aktivitet modulerer den rumlige fordeling af xbra (røde pile i nederste højre panel). Sorte pile markerer atom β-gaLactosidase som linjesporeren. AP: dyrestang. VP: vegetabilsk pol. ( C ) Western-blot-analyse, der viste, at i et dyrekapassay inducerede CRY2-2A-2CIBN blå lysafhængig, reversibel phosphorylering af ERK. ( D ) Billeder, der viser morfologien for normale embryoner, uden mRNA-injektion og uden lette behandlinger. ( E ) Et zoomet billede af et enkelt embryo. ( F - G ) Zoomede ind og helfeltbilleder til embryoner injiceret med CRY2-2A-2CIBN mRNA og udsat for blåt lys stimulering. Aktivering af Raf1 ved behandling af CRY2-2A-2CIBN-injicerede embryoner med blåt lys inducerer ektopiske hale-lignende strukturer i hovedområdet. ( H - I ) Negative kontroller, herunder embryoner injiceret med CRY2-2A-2CIBN, men under mørk inkubation ( H ) og ikke-injicerede embryoner under lysstimulering ( I ). Alle lysstimuleringsforsøg blev udført med en effekt på 5 mW / cm <Sup> 2. ( J ) Statistisk analyse af procentdelen af ​​embryoner, der viser ektopisk hale-lignende struktur under hver tilstand. Målestang = ( D ) og ( G ): 1 mm; ( E - F ) og ( H - I ) 0,5 mm. Figur 4A , C , E - F og H - J blev tilpasset fra reference 35 , reproduceret med tilladelse fra selskabet af biologer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ved opbygning af lysboksen bør effekten af ​​de enkelte lysdioder måles. Baseret på tidligere erfaringer kan strømudgangen variere mellem individuelle lysdioder på grund af fremstillingsvarianter. Vælg et sæt lysdioder, der har en effekt inden for 10% af hinanden. Antallet af lysdioder, strømbegrænsende modstand og strømindgang kan ændres til forskellige typer cellekulturbeholdere ( f.eks. En 6-brønds eller 24-brønds plade). En 24 timer lysbelysning med en effekt på 0,2 mW / cm2 fremkalder ikke detekterbar fototoksicitet 44 . Hvis der bruges en højere effekt, overvej at bruge intermitterende lys for at reducere varmegenerering og fototoksicitet. Det optogenetiske system, der indføres i denne protokol, inducerer neuritudvæksten i PC12-celler under intermitterende lysstimulering, der er sammenlignelig med den for kontinuerlig lysstimulering, idet det mørke interval mellem de to tilstødende lysimpulser er mindre end 45 min. 44 . På grundTil egentlige forskelle i kinetikken af ​​proteinforening og dissociation, skal varigheden mellem lysimpulser indstilles for hvert unikt proteinpar. Overekspression af cytosolisk Raf1 forårsager ikke PC12-celledifferentiering uden blåt lysbelysning. Ved at kontrollere mængden af ​​mRNA injiceret i hvert embryo blev der ikke observeret signifikante embryonale fænotyper i mørket.

Skønt et lavt strømblåt lys er tilstrækkeligt til at stimulere associeringen af ​​CRY2- og CIBN-fusionsproteiner, begrænser den dårlige penetrationsdybde af blåt lys dets anvendelse i dybvævsstimulering. Selvom en sådan stimulering er opnået ved at levere lys via andre enheder ( fx fiberoptik), er tilgangene invasive 45 . Dette problem kan løses på to måder: ved at bruge et proteinpar, der reagerer på længere bølgelængde ( fx phytochrom-PIF6-proteinparet) eller ved anvendelse af to-foton-excitation. Begge tilgange kan give dybdeR penetration, men de kunne lide af andre begrænsninger. For eksempel kræver PhyB-PIF6-paret en syntetisk cofaktor at fungere, og to-foton mikroskopi kræver dyr instrumentation. Manglen på afstemning i CRY2-CIBN-interaktionen er en anden begrænsning at overveje. Vildtype CRY2 dissocierer spontant fra CIBN med en halveringstid på 5,5 min i mørket 34 . Afhængig af kinetikken af ​​målsignalvejen kan en forkortet eller langvarig dissociation halveringstid være foretrukket. Mutationer i CRY2 er blevet lavet, som enten kan forkorte dissociation halveringstid til 2,5 min (W349R) eller forlænge den til 24 min (L348F) 46 . Alternativt viser konstruerede fotoaktiverbare proteinpar baseret på svampeceptor Vivid (VVD) og p / nMagFast1 og 2 en dissociation halveringstid på 4,2 min og 25 s henholdsvis 47 . I denne protokol tændes vildtype CRY2-CIBN proteinparet på MAPK-banen inden for 5 min lysstiMulation, og aktiviteten falder tilbage til det basale niveau inden for 30 minutter i mammale celler 44 og 1-2 timer i Xenopus embryoner 35 . Til rumlig kontrol kan konfokalmikroskopi fokusere den blå laser på størrelsen af ​​et diffraktionsgrænsepunkt på ca. 200 nm i billedplanet. Ved at justere størrelsen af ​​feltdiagrammet i et epi-belysningsmikroskop udstyret med en ikke-sammenhængende lyskilde, er det muligt at begrænse belysningsstørrelsen til ca. 10 μm i diameter. Begge metoder skal kunne opnå subcellulær kontrol af optogenetisk stimulering i cellekulturer.

Optogenetikernes evne til reversibelt at forhøre signaltransduktion med høj rumlig og tidsmæssig opløsning giver en helt ny mulighed for at studere dynamisk intracellulær signalering i levende celler. Resultater fra denne protokol har vist, at Raf1-aktivering primært er ansvarlig for induktionen af ​​neuronal differentiering i PC12 celler 44 . Den samme vej skaber også dannelsen af ​​sekundære hale-lignende strukturer i udviklingen af Xenopus embryoner. Ved at styre timingen for Rafl-aktivering kan den hale-lignende struktur induceres efter dannelsen af ​​kimlagsdannelse 35 . Den nyligt beskrevne LOVTRAP-metode anvender to manipulerede proteiner, Zdark og LOV2, som selektivt binder til hinanden kun i mørket for at modulere den lysinducerede dissociation af et protein af interesse (POI) 48 . I modsætning til lysmedieret protein-protein association, som anvendes i denne tilgang, bruger LOVTRAP lys til at inducere protein dissociation. Denne nye modalitet er mere fleksibel ved modulerende proteinlokalisering og aktivitet i levende celler. Ved omhyggeligt at vælge aktiveringsfunktionen inden for en signaleringskaskade er det muligt at dissekere signaltransduktion på ukonventionelle måder. For eksempel er det muligt at aktivere receptor tyrosinkinaser uden lIgand-receptorbinding 49 eller til at inducere en delmængde af ligand-fremkaldte signaleringskaskader 44 . Den her rapporterede strategi kan generaliseres til at kontrollere andre kinaser, såsom Akt 39 og GTPaser ( fx Rho GTPase), hvis aktiveringstilstande også kan tændes ved proteintranslokation. Optogenetik vil fortsat blive anvendt til levende multicellulære organismer, som demonstreret af nyere værker, der viser den optogenetiske kontrol af proteinlokalisering og signalering i Drosophila 50 , zebrafish 51 , 52 , 53 , 54 og Xenopus embryoner 35 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af University of Illinois i Urbana-Champaign (UIUC) og National Institutes of Health (NIGMS R01GM111816).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslip  VWR 48393 230 Substrate for live cell imaging
Coverslip holder  Newcomer Supply 6817B Holder for coverslips
Detergent  ThermoFisher 16 000 104 For cleaning coverslips
Boric acid  Sigma-Aldrich B6768-500G For making PLL buffer
Disodium tetraborate Sigma-Aldrich 71996-250G For making  PLL buffer
Plastic beaker Nalgene 1201-1000 For cleaning coverslips
Sodium hydroxide  Sigma-Aldrich 221465-2.5KG For adjust pH
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1274-500MG For coating coverslip
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water ThermoFisher Scientific 750024 For DNA preparation
Cover Glass Forceps Ted Pella 5645 Cover glass handling
Tissue cutlure dish Thermofisher 12565321 Cell culture dish
Sterile centrifuge tubes ThermoFisher 12-565-271 Buffer storage
Transfection Reagent ThermoFisher R0534 Transfection
CO2-independent medium ThermoFisher 18045088 For live cell imaging
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Form make cell chamber
Plasmid Maxiprep kit Qiagen 12965 Plasmid preparation
DMEM medium ThermoFisher 11965-084 Cell culturing medium component
F12K medium ThermoFisher 21127022 Cell culturing medium component
Horse serum ThermoFisher 16050122 Cell culturing medium component
Fetal Bovine Serum Signa-Aldrich 12303C-500 mL Cell culturing medium component
Penicillin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016 Cell culturing medium component
Trypsin (0.25%), phenol red ThermoFisher Scientific 15050065  For mammalian cell dissociation
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 For DNA preparation
Ficoll PM400 GE Heathcare Life Sciences 17-5442-02 For embryo buffer
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich 1.02839.0025 Oocyte preparation
ApaI ThermoFisher FD1414 For linearization of plasmids
Dnase I ThermoFisher AM2222 For removing DNA template in the in vitro transcription assay
Index-match materials (immersion oil) Thorlabs MOIL-20LN For matching the index between sample substrate and objective
Blue LED Adafruit 301 Light source for optogenetic stimulation
Resistor kit Amazon EPC-103 current-limiting resistor
Aluminum boxes BUD Industries AC-401 light box 
BreadBoard Jekewin 837654333686 For making LED array
Hook up Wire Electronix Express 27WK22SLD25 For making LED array
Relay Module Jbtek SRD-05VDC-SL-C For intermittent light control
DC Power Supply  TMS DCPowerSupply-LW-(PS-305D) Power supply for LED
Silicon Power Head Thorlabs S121C For light intensity measurement
Power meter Thorlabs PM100D  For light intensity measurement
Microscope Leica Biosystems DMI8 For live cell imaging
BioSafety Cabinet ThermoFisher 1300 Series A2 For mammalian cell handling
CO2 incubator ThermoFisher Isotemp For mammalian cell culturing
Stereo microscope Leica M60 For embryo micro-manipulation
Microinjector Narishige IM300 For embryo microinjection
Micropipette puller Sutter Instruments P87 Needle puller
in vitro transcription kit ThermoFisher AM1340 For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA  Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column  
RNA purfication kit Qiagen 74104 Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA 
Convection oven MTI corporation  EQ-DHG-9015 PDMS curing
Centrifugal mixer and teflon container THINKY AR310 For mixing PDMS
Silicon wafer UniversityWafer 452 Base for making PDMS  devices
Blade Techni Edge 01-801 For cutting PDMS
Capillary glass Sutter Instruments BF100-58-10 For fabrication of injecting needles. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
  2. Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
  3. Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
  4. Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
  5. Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
  6. Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  7. Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
  8. Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
  10. Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
  11. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  12. Hunter, T. Signaling--2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
  13. Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
  14. Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
  15. Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
  16. Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
  17. Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
  18. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
  19. Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
  22. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  23. Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
  24. Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
  25. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  26. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  27. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  28. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
  29. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
  30. Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
  31. Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
  32. Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
  33. Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochemistry. 50 (1), 4-16 (2011).
  34. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  35. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  36. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  37. Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
  38. Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
  39. Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
  40. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  41. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  42. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
  43. Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
  44. Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
  45. Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
  46. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  47. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
  48. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  49. Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
  50. Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
  51. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738 (2012).
  52. Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
  53. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  54. Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).

Tags

Developmental Biology Optogenetics protein-protein interactions PC12 cell differentiation, Embryonisk udvikling kryptokrom CRY2-CIBN bicistronisk Raf / MEK / ERK kinase signaleringskaskade
Lysmedieret reversibel modulering af den mitogenaktiverede proteinkinasevej under celledifferentiering og<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonudvikling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Krishnamurthy, V. V., Turgeon, A.… More

Krishnamurthy, V. V., Turgeon, A. J., Khamo, J. S., Mondal, P., Sharum, S. R., Mei, W., Yang, J., Zhang, K. Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development. J. Vis. Exp. (124), e55823, doi:10.3791/55823 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter