Summary
Detta protokoll beskriver en optogenetisk strategi för att modulera mitogenaktiverad proteinkinas (MAPK) aktivitet under celldifferentiering och Xenopus embryonal utveckling. Denna metod möjliggör reversibel aktivering av MAPK-signalvägen i däggdjurscellkulturen och i multicellulära levande organismer, som Xenopus- embryon, med hög rumlig och tidsmässig upplösning.
Abstract
Kinasaktivitet är avgörande för en uppsjö av cellulära funktioner, inklusive cellproliferation, differentiering, migration och apoptos. Under tidig embryonal utveckling är kinasaktiviteten mycket dynamisk och utbredd över embryot. Farmakologiska och genetiska metoder används ofta för att sanna kinasaktivitet. Tyvärr är det utmanande att uppnå överlägsen rumslig och tidsmässig upplösning med hjälp av dessa strategier. Vidare är det inte möjligt att kontrollera kinasaktiviteten på ett reversibelt sätt i levande celler och multicellulära organismer. En sådan begränsning förblir en flaskhals för att uppnå en kvantitativ förståelse av kinasaktivitet under utveckling och differentiering. Detta arbete presenterar en optogenetisk strategi som utnyttjar ett bicistroniskt system som innehåller fotoaktiverbara proteiner Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) och den N-terminala domänen för Cryptochrome-interagerande Basic-Helix-loop-Helix (CIBN). ReversiBle-aktivering av den mitogenaktiverade proteinkinas (MAPK) signaleringsvägen uppnås genom lättmedierad protein-translokation i levande celler. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på däggdjurscellkulturer och levande vertebratembryon. Detta bicistroniska system kan generaliseras för att kontrollera aktiviteten hos andra kinaser med liknande aktiveringsmekanismer och kan appliceras på andra modellsystem.
Introduction
Tillväxtfaktorer är involverade i ett brett spektrum av cellfunktioner, inklusive proliferation, differentiering, migration och apoptos och spelar nyckelroller i många biologiska händelser, inklusive embryonal utveckling, åldrande och reglering av mental status 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Många tillväxtfaktorer signalerar genom komplexa intracellulära signalkaskader. Dessa signaleringshändelser drivs ofta av reversibel proteinfosforylering på ett exakt reglerat sätt 6 , 7 . Sålunda är en förståelse för signaleringsresultaten av proteinkinaser, vilka är ansvariga för proteinfosforylering, grundläggande viktiga.
Olika tillväxtfaktorer verkar genom ett ganska vanligt intracellulärt signalnätverk, trots att de stimulerar distInktcellsvar 5 , 9 . Vanliga intracellulära mediatorer av receptortyrosinkinaser innefattar Ras, Raf, extracellulärt signalreglerat kinas (ERK), mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK) / ERK-kinas (MEK), fosfonositid-3-kinas (PI3K), Akt och fosfolipas C gamma (PLCy) 10 , 11 . Ackumulerande bevis tyder på att signaleringens mångfald och specificitet beror på den rumsliga och temporala reglering av signalaktivitet 12 . Till exempel aktiverar stimulering av epidermal tillväxtfaktor (EGF) i råttfenokromocytomceller (PC12), som resulterar i cellproliferation, transienten av ERK-vägen 9 . Å andra sidan aktiverar stimulering med nervtillväxtfaktor (NGF), som leder till celldifferentiering, aktiveringen av ERK-vägen på ett hållbart sätt 9 , 13 . I odlad rVid hippocampala nervceller främjar transient signalering med hjärnavledad neurotrofisk faktor (BDNF) primär neuritutväxt, medan upprepad signalering leder till ökad neuritgrenning 14 . Under tidig embryonal utveckling är fosforylerad ERK-aktivitet temporärt dynamisk och är utbredd över embryot 6 . En ny genetisk skärm under tidig Xenopus- embryogenes visade att ERK- och Akt-signalkaskader, två nedströms primära tillväxtfaktorvägar, visar scenspecifika aktiveringsprofiler 7 . Således kräver en förståelse av kinasignaleringsresultat verktyg som kan söka kinasaktivitetens rumliga och temporära egenskaper med tillräcklig upplösning.
Konventionella experimentella tillvägagångssätt för att sondra den dynamiska naturen av signaltransduktion under utveckling saknar den önskvärda rumsliga och tidsmässiga upplösningen. Till exempel använder farmakologiska metoder småkemiskaIcal eller biologiska molekyler för att stimulera eller undertrycka signaltransduktion i celler och vävnader. Den diffusiva naturen hos dessa små molekyler gör det svårt att begränsa deras verkan till en specifik region av intresse 15 . Genetiska metoder ( t.ex. transgenes, Cre-Lox-systemet eller mutagenes) leder ofta till irreversibel aktivering eller repression av målgenuttryck eller proteinaktivitet 16 , 17 , 18 . Tet-On / Tet-Off-systemet 19 erbjuder förbättrad tidskontroll av gentranskription men saknar strikt rumslig kontroll eftersom den är beroende av diffusion av tetracyklin. Den senaste utvecklingen i kemiskt inducerad proteindimerisering 20 eller fotokoagering 21 , 22 , 23 , 24 har avsevärt förbättringRedogör för den tidsmässiga kontrollen av signaleringsnät. Den rumsliga kontrollen är emellertid fortfarande utmanande på grund av den diffusiva naturen hos de burade kemikalierna.
Nyligen framväxande optogenetiska metoder, som utnyttjar ljusets kraft för att styra protein-protein-interaktioner, möjliggör modulering av signalvägar med hög spatiotemporal precision samt reversibilitet. Kort efter sin initiala framgång vid kontroll av neuronavbrott 25 , 26 , 27 har optogenetik utvidgats för att styra andra cellulära processer, såsom gentranskription, translation, cellmigration, differentiering och apoptos 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . En strategi som använder pHotoaktiverat proteinpar Arabidopsis thaliana- kryptokrom 2 (CRY2) -protein och den N-terminala domänen för kryptokrom-interaktion-bas-helix-loop-helix (CIBN) utvecklades nyligen för att kontrollera Rafl-kinasaktivitet i däggdjursceller och Xenopus- embryon 35 . CRY2 binder till CIBN vid blått ljusstimulering och CRY2 / CIBN-proteinkomplexet dissocierar spontant i mörkret 34 . Blått ljus exciterar CRY2-kofaktorn, flavin-adenindinukleotid (FAD), vilket leder till en konformationsförändring i CRY2 och dess efterföljande bindning till CIBN. Konstitutivt aktiva (W374A) och flavin-deficenta (D387A) -mutanter av CRY2 kan framställas genom mutationer i FAD-bindningsfickan: CRY2 W374A- mutanten binder till CIBN oberoende av ljus, medan CRY2 D387A- mutanten inte binder till CIBN under blå -ljusstimulering 36 , 37 . Det optogenetiska systemet som beskrivs iN det här protokollet använder vildtyp CRY2 och CIBN för att inducera proteinkonverteringsmedierad Raf1-aktivering i levande celler. Det är känt att membranrekryteringen av Raf1 ökar sin aktivitet 38 . I detta system förankras en tandem CIBN-modul till plasmamembranet och CRY2-mCherry fusioneras till N-terminalen hos Raf1 35 . I frånvaro av blått ljus förblir CRY2-mCherry-Raf1 i cytoplasman och Raf1 är inaktiv. Blåljusstimulering inducerar CRY2-CIBN-bindning och rekryterar Raf1 till plasmamembranet, där Raf1 aktiveras. Rafaktivering stimulerar en Raf / MEK / ERK signalkaskad. Både CRY2- och CIBN-fusionsproteiner kodas i ett bicistroniskt genetiskt system. Denna strategi kan generaliseras för att styra andra kinaser, såsom Akt, vars aktiveringstillstånd kan också sättas på genom proteintranslokation i celler 39 . Detta arbete presenterar detaljerade protokoll för genomförande av denna optogenetiska strategi i däggdjurscellkultuRes och multicellulära organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurforskning genomfördes i enlighet med riktlinjer som fastställdes av Illinois Institutionella djurvård och användningskommitté (IACUC) och University of Illinois Department of Animal Resources (DAR).
1. Optogenetisk induktion av proteinkoncentration i BHK21-mammalcellkultur
OBS! Steg 1.1-1.3 ger en metod att montera en cellodlingskammare för bildbehandling med högförstoringsmål ( t.ex. 63X eller 100X), som vanligen har korta arbetsavstånd. Dessa mål kräver en tunn glasöverdragslip ( t ex # 1,5, 170 μm tjocklek) som bildningsunderlag. Alternativt kan en glas-bottencellodlingskål / -glid användas. I så fall kan steg 1.1-1.3 hoppas över.
- Rengöring av glasskyddsglas
- Placera 30 glasöverdrag i en täckglashållare.
- Lägg i en 600 ml plastbägare 20 g tvättmedel och 400 ml varmt kranvatten. PlacE bägaren på en magnetomrörare och rör om tills allt tvättmedel är upplöst. Ta bort skummet med hjälp av tissuepapper.
- Använd botten av en 100 mm x 15 mm petriskål som distans från omrörningsstången och som yta för täckglashållaren. För att bibehålla tillräckligt flöde under rengöringsprocessen, gör 3-4 tömningshål i petriskålen.
- För att göra dräneringshålen, värma upp ett lödstryk och bränn genom plasten i en ventilerad huva.
VARNING: Rör inte det uppvärmda lödstånget med bara händer. - Placera täckglashållaren på petriskålen i bägaren. Rör om i 2 h till över natten vid rumstemperatur.
- Tvätta tre gånger med 500 ml DI vatten i en 1000 ml bägare. Diskmedellösningen kan återanvändas.
- Plocka upp enskilda täckglas med tangor. Fördjupa täckglasen i 190-bevis (95%) etanol i 1 min.
- Torka täckglasen i en steril huva. Förvara täckglasen i en steril plastbehållare tills användning.
- Göra poly-L-lysin (PLL) -belagda täckglas
- Gör 0,1 M boratbuffert genom att lösa 1,24 g borsyra och 1,9 g dinatriumtetraborat i 400 ml vatten. Justera pH till 8,5 med 10 M NaOH.
- Lös upp PLL i boratbufferten till en slutlig koncentration av 1 mg / ml. Aliquot PLL-lösningen i 50 ml sterila centrifugrör.
- Tillsätt 50 ml PLL-beläggningslösning till en 10 cm vävnadskulturskål. Placera disken i en 37 ° C inkubator för att värma upp PLL-lösningen.
- Öppna täckglasbehållaren (steg 1.1.8) i en steril huva.
- Sänk de rengjorda täckglasen en efter en i den förvärmda PLL-lösningen i vävnadsodlingsskålen. Undvik bubbelbildning för att fördunka alla ytor.
- Placera disken med täckglaset i en 37 ° C CO 2 inkubator över natten. Ta ut varje täckglas och placera den i en steril skyddsglashållare. Skölj tre gånger med autoklaverat ultralätt vatten (18,2 MΩ & #183; cm resistivitet) i en 1000 ml bägare i en steril huva.
- Torka täckglasen i täckglashållaren i den sterila huven. Förvara täckglasen i en steril plastbehållare tills användning.
- Montering av polydimetylsiloxan (PDMS) cellodlingskammare
- I en plastbehållare, väger 40 g PDMS-bas och tillsätt 4 g härdningsmedel för att uppnå ett 10: 1 vikt / viktförhållande PDMS och härdningsmedel. Blanda PDMS / härdningsmedlet genom omröring med en pipettspets under 2 minuter. Alternativt använd en centrifugalblandare.
- Använd en bägare med en 4 tums diameter som en mall för att göra en hållare med en bit aluminiumfolie. Placera aluminiumfoliehållaren i en 15 cm petriskål. Placera en 4 tums kiselplatta i denna aluminiumfoliehållare.
- Häll den blandade PDMS-lösningen i hållaren. Använd en tunn glasstång för att försiktigt röra kanten på skivan. Ta bort eventuella luftbubblor som fastnar under skivan.
- Sätt in 15 cm petriskålen i ett vakuumkambeR att degas PDMS-lösningen. Fortsätt avgasning i ca 20 minuter tills inga bubblor genereras. Under tiden förvärmas en konvektionsugn till 65 ° C.
- Placera 15 cm petriskålen försiktigt i ugnen. Inkubera i 2 timmar.
- Ta bort plattan från ugnen. Använd en glasstång för att försiktigt röra vid PDMS kant och säkerställa fullständig tvärbindning. Om inte, inkubera längre tills PDMS är fast och klibbig.
- Ta bort aluminiumfolien från plattan och avlägsna den av kiselplattan. Börja från kanten, skölj försiktigt den härdade PDMS av kiselplattan.
VARNING: Undvik att applicera för mycket kraft, eftersom det kan bryta skivan. - Trim PDMS i 20 mm x 30 mm rektangulära bitar för att passa 24 mm x 40 mm täckglas med ett rakblad.
- Använd ett mejselformat blad för att skära en rektangulär öppning på 10 mm x 20 mm från mitten av varje PDMS-bit.
- Rengör PDMS-kamrarna med hjälp av detergentprotokollet som beskrivs i steg 1.1.
- Torka PDMS-kamrarna i en ren huva. Placera de torra kamrarna i en autoklaverbar behållare täckt med aluminiumfolie.
- Autoklavera behållaren med användning av gravitationen (121 ° C, 15 psi) under 30 minuter och förvara behållaren vid rumstemperatur.
- BHK21-cellodling och transfektion
- Gör 500 ml medium för BHK21-cellodling genom att blanda 445 ml DMEM med 50 ml FBS och 5 ml 100 × Penn-Strep-Glutamin (10 000 U / ml penicillin, 10 mg / ml streptomycin och 29,2 mg / ml L -glutamin). Se till att den slutliga koncentrationen av FBS är 10%.
- Aliquot 10 ml icke-HEPES CO 2 -oberoende medium för levande cellbildning.
OBS: CO 2 -oberoende medium stöder celltillväxt utan en CO 2- inkubator och är idealisk för bildbehandling av celler under atmosfäriska förhållanden. Se materiallistan för detaljerad information. Förutom BHK21 celllinjen bör andra typer av däggdjursceller också geLiknande resultat. - Montera en cellodlingsanordning genom att placera en autoklaverad, steril PDMS-kammare (steg 1.3) på en steril PLL-belagd täckglas (steg 1.2) i en steril huva.
- Placera varje enhet i en steril 60 mm petriskål.
- Använd 0,5 ml 0,25% trypsin för att lossa cellerna från en brunn i en 12-brunns vävnadsodlingsplatta. Räkna cellens densitet med en hemocytometer. Platta 20 000 BHK21 celler i kammaren (ca 10 000 celler / cm 2 ) med 200 | il cellodlingsmedium.
- Bered DNA-plasmid med ett plasmidpreparationspaket (se materiallistan).
OBS! Konstruktionen och funktionaliteten för CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX visas i Figur 1A - 1B . - Tjugofyra (24) h efter cellplätering transfekterar cellerna med 50-100 ng CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX-plasmid, enligt tillverkarens protokoll.
- Tre (3) timmar efter transfektion, byt mEdium till 200 | j, l färskt odlingsmedium (steg 1.4.1) och låta cellerna återvinna över natten genom att inkubera odlingen i en 37 ° C, 5% CO2-inkubator.
- Fluorescens levande cellbilder
- Slå på en dator, ljuskälla, mikroskop och kamera. Använd ett konfokal fluorescensmikroskop (utrustad med ett 100X oljedämpningsmål) för resten av protokollet.
OBS: Ett inverterat epifluorescensmikroskop kan också användas. - Ersätt cellodlingsmediet med 200 | il CO2-oberoende medium.
- Ställ in datainsamlingsprotokollet innan du placerar cellerna på mikroskopet. Använd 488 nm excitation FITC-kanal för optogenisk stimulering. Använd 561 nm excitations TRITC-kanal för att lokalisera transfekterade celler och spåra den cellulära lokaliseringen av mCherry-märkt protein.
- Ställ in förstärkningen av FITC- och TRITC-kanalerna som 120 respektive 200. Använd en pixel-boendetid på 2,21; s och en storlek på 512 x 512 pixlar.
- Mät kraften i 488 nm-ljuset genom att placera en effektmätare nära objektfönstret. En total effekt på 2 μW (ca 10 000 W / cm 2 vid fokus) är tillräcklig för att inducera CIBN-CRY2PHR-association.
- Ställ in ett tidsstämpelförvärv med ett 5 s intervall och en sammanlagd förvärvstid på 2 min.
- Applicera lämpligt indexmatchningsmaterial (nedsänkning av olja) i objektfönstret. Använd faskontrastläget för att fokusera på cellerna på täckglasytan.
- Leta upp en transfekterad cell under 561 nm ljus genom att flytta mikroskopsteget.
VARNING: Undvik att använda blått ljus under detta steg, eftersom det aktiverar associeringen mellan fotoaktiverbara proteiner. - När en transfekterad cell är lokaliserad, starta datainsamling.
OBS: Transfekterade celler ska framgångsrikt visa fluorescens i både FITC (från 2CIBN-GFP-CaaX) och TRITC (från CRY2-mCherry-Raf1) kanaler ( Figur 1C-D - Spela in en serie tidsstämplade bilder i både FITC- och TRITC-kanalerna ( Figur 1D ).
- För att sondra spontan dissociation av CRY2-CIBN-proteinkomplexet, registrera en annan tidstämpel med Txred-kanalen ensam i 20 minuter med ett 30 s intervall.
- Spara tidsstämplad bild för dataanalys.
- Slå på en dator, ljuskälla, mikroskop och kamera. Använd ett konfokal fluorescensmikroskop (utrustad med ett 100X oljedämpningsmål) för resten av protokollet.
- Bildanalys
- Öppna bilderna med en bildanalysprogramvara som kan extrahera intensiteten från en bild 40 .
- Välj två representativa ögonblicksbilder: en före blått ljus exponering och den andra exponeringen efter blått ljus.
- Rita en linje över cellen som spänner över bakgrunden, plasmamembranet och cytoplasman. Projicera intensiteten längs denna linje. Spara värdena och plotta ut dem för att jämföra skillnaden före och efter ljusexponering ( Figur 1D ).
- För att analysera proteinkoncentrationens kinetik selecT en representativ region av intresse (ROI) i plasmamembranet, ett ROI i cytoplasman och ett ROI i bakgrunden.
- Förvärva medelintensiteten hos plasmamembranet (I PM ), cytoplasman (I CYT ) och bakgrunden (I BKD ) för bildstapeln.
- Beräkna förhållandet mellan membran / cytosolisk intensitet för varje bild med hjälp av följande ekvation:
- Rita förhållandet mot tiden och bestäm bindning eller dissociationskinetiken för CRY2-CIBN ( Figur 1E- F ).
2. Konstruktion av en LED-uppsättning för långsiktig ljusstimulering i en CO 2- inkubator
OBS! Den övergripande schematiska för experimentuppställningen visas i figur 2A .
- Gör LED-arrayen genom att sätta in 12 blå LED-lampor i två brödboarDs och anslutande strömbegränsande motstånd.
OBS! Med en 30 V strömförsörjning kan fyra LED-lampor anslutas i serie, och deras ljusstyrka kan styras av ett strömbegränsande motstånd. - Lägg brödskivorna i en aluminiumlåda.
OBS! Aluminiumslådans höjd ska vara 2 tum. Den här höjden är optimal för att belysa en vävskulturplatta med 12 brunnar, eftersom storleken på den divergerande ljuspunkten är densamma som för en enkel brunn. - Använd två metalltrådar för att ansluta till strömförsörjningen. Kontrollera att ledningens längd är tillräcklig när ljusboxen placeras inuti en CO 2- inkubator.
- Använd en genomskinlig ljusdiffusor som locket på ljuslådan ( Figur 2C ).
- Kalibrera effekten på varje LED vid ett antal spänningsingångar. Använd en kraft på 0,2 mW / cm 2 för 24 h PC12-celldifferentieringsanalysen. Använd en kraft på 5 mW / cm 2 för levande Xenopus- embryon eller -explantatanalyser.
3. Optogenetisk induktion av PC12-celldifferentiering
- Cellodling och transfektion
- Gör 500 ml medium för cellkultur med råttfenokromocytom (PC12) genom att blanda 407,5 ml F12K med 75 ml hästserum + 12,5 ml FBS + 5 ml 100 × Penn-Strep-Glutamin (slutliga koncentrationer av hästserum och FBS : 15% respektive 2,5%). Gör lågt serummedium genom att blanda 1 volym fullmedium i 99 volymer F12K-medium.
- Plate PC12-celler i en 12-brunnsplatta vid en densitet av 300.000 celler / brunn eller 75.000 celler / cm2.
- Transfektera cellerna med CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX 24 h efter cellplätering (liknande steg 1.4.7). Använd 1,2 μg DNA för varje brunn. Låt cellerna återhämta sig över natten i odlingsmedium i en 37 ° C inkubator kompletterad med 5% CO2. Kontrollera transfektionseffektiviteten 16 h efter transfektion.
OBS: En 30-50% transfektion effEffektivitet bör uppnås för att säkerställa ett tillräckligt antal celler. - Byt medium till lågt serummedium 24 timmar efter transfektion. Använd 1 ml medium per brunn i en 12-brunnsplatta.
- Ljusinducerad PC12-celldifferentiering
- Placera LED-matrisen i en CO 2- inkubator. Anslut den till strömförsörjningen med hjälp av ett par ledningar. Ställ in LED-strömmen till 0,2 mW / cm 2 . Placera 12-brunnsplattan som innehåller transfekterade PC12-celler (steg 3.1.3) på LED-arrayens fönster. Applicera kontinuerlig ljusbelysning i 24 timmar i en 37 ° C inkubator kompletterad med 5% CO2.
- Fluorescens levande cellbilder
- Följ steg 1.5.1-1.5.4 för mikroskop och provberedning.
- Konfigurera en enda ögonblicksbildsinsamling. Använd 200 ms för både GFP och Txred-kanalen.
- Fånga bilder av de transfekterade cellerna i både GFP- och Txred-kanalerna. Spela in ungefär 200 cellerLs för varje tillstånd. Spara filerna för dataanalys.
- Bildanalys
- Räkna procentandelen av differentierade celler över det totala antalet transfekterade celler.
- Använd en cellräknande modul i bildanalysprogramvaran för att räkna cellerna.
- Räkna manuellt de differentierade cellerna.
OBS: Differentierade celler definieras som de där minst en neurit är märkbart längre än cellkroppen ( Figur 3A -3B ). - Upprepa steg 3.4.3 med odifferentierade celler.
- Beräkna differentieringsförhållandet med hjälp av följande ekvation:
4. Optogenetisk kontroll av kinasaktivitet i Xenopus- embryon
- Framställning av buffertar
- Förbered 1 liter av 1x Marcos Modified Ringer (MMR): 100 mMNaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 och 5 mM HEPES; PH 7,5.
- Framställning av mRNA
- Digestera CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX plasmid-DNA (2 μg) med 1 | il ApaI (50 enheter) vid 37 ° C i 2 timmar.
- Precipitera linjäriserat DNA i 60 | il 100% etanol. Snurra vid 12 000 x g under 5 min vid rumstemperatur för att pelletsera DNA. Ta noga av supernatanten och tvätta pelleten igen med 60 μl 70% etanol. Snurra vid 12 000 × g under ytterligare 5 min vid rumstemperatur. Avlägsna försiktigt supernatanten och resuspendera DNA-pelleten i 6 | il RNas-fri H20 .
- Utför in vitro- transkription genom att inkubera 1 | jg linjärt DNA med 2 | j, l av tillförd SP6-RNA-polymeras, en ribonukleotidblandning (10 mM ATP, CTP och UTP; 2 mM GTP och 8 mM capanalog) och 20 xl nukleas- Fritt vatten vid rumstemperatur i 1 timme.
- Ta bort DNA-mall genom DNase I-digestion vid 37 ° C under åtminstone 15 minuter och renar det syntetiserade RNA med användning av en silikamembran-spinnkolonn.
- Stopp reaktionen och fäll ut RNA genom att tillsätta 30 | j, l nukleasfritt vatten och 30 | il LiCl-utfällningslösning. Blanda noga och kyla i 30 minuter vid -20 ° C.
- Centrifugera vid 4 ° C i 15 min vid 12 000 x g för att pelletsera RNA.
- Ta försiktigt bort supernatanten. Tvätta RNA en gång med 1 ml 70% etanol och resuspendera i 40 | il nukleasfritt vatten.
- Ladda 40 μL RNA i en snurrkolonn. Centrifugera vid 4 ° C i 1 min vid 12 000 x g för att avlägsna de inkorporerade nukleotiderna och kapslarna.
- Harvest Xenopus embryon
- Följ protokollet som beskrivits av Sive et al. 41 för att erhålla Xenopus embryon.
- MRNA-mikroinjektion
- TillverkaNålarna för mikroinjektion genom att dra glaskapillärer med en kapillärdragare. Ställ dragprogrammet på: värme = 355, dra styrka = 80, hastighet = 50 och tid = 100.
- Ta bort jelly coat från embryon genom att behandla dem med 3% cystein (utspätt i 0,2x MMR).
- Överför embryon till 3% polysukros och 0,5x MMR-lösning för mikroinjektion. Injicera 500 pg till 1 ng CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA i varje embryo.
OBS: Injektion av en dos högre än 1 ng resulterar i blå, ljusoberoende aktivering av MAPK-signaleringen.
- Optogenetisk stimulering av kinasaktivitet
- Kulturmikroinjicerade embryon i 3% polysackaros, 0,5x MMR-lösning vid rumstemperatur tills de når mitten av gastrulasteget (steg 12). Därefter odlar embryon i 0,2x MMR-lösning.
- Överför embryon eller eksplantat till en 12-brunnsplatta. Placera 12-brunnsplattan på den inbyggda LED-matrisen (steg 2.5) för blåljusT (475 nm) behandling.
- Placera en spegel på toppen av 12-brunnsplattan för att säkerställa fullständig blått ljusbelysning av embryon eller eksplantat.
- Ställ in det blå ljusets ström till 5 mW / cm 2 .
OBS: Blåljusbehandling kan utföras vid vilken tidpunkt som helst, i antingen 3% polysackaros, 0,5x MMR-lösning eller 0,2x MMR-lösning. - Skörda embryon vid vilken som helst önskad tidpunkt. Använd dem för histologisk, Western-blot eller genuttrycksanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ratiometrisk uttryck av fotoaktiverbara proteinpar: Figur 1A visar konstruktionen av en bicistronisk optogenetisk konstruktion, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (refererad till som CRY2-2A-2CIBN), baserat på porcine teschovirum- 1 2A (P2A) -peptiden, vilken visar den högsta ribosomhoppningseffektiviteten bland däggdjurscellinjer 42 . I tidigare arbete har det fastställts att det optimala förhållandet för CIBN-GFP-CaaX: CRY2-mCherry-Raf1 är 2: 1 35 . Denna konfiguration möjliggör tillräcklig membranrekrytering och aktivering av CRY2-mCherry-Raf1 ( Figur 1B ). Celler som enkelt transfekterats med CRY2-2A-2CIBN visar tydlig fluorescens i både GFP och Txred fluorescerande kanaler, antingen under epi-belysning ( Figur 1C ) eller konfokalmikroskopi ( Figur 1D ). Blå lättmedierad membranNe rekrytering av CRY2-mCherry-Raf1 ( Figur 1D ) kan tydligt detekteras i konfokal mikroskopi. Föreningen sker inom sekunder efter blått ljusexponering ( Figur 1E ) och CRY2-CIBN-proteinkomplexet dissocierar med en halveringstid på ca 5,5 min ( Figur 1F ).
Ljusstyrd PC12-celldifferentiering i avsaknad av nervtillväxtfaktor: En spännande observation i tillväxtfaktorsignaleringen är att vanliga nedströms signalvägar ( t.ex. ERK, PI3K-Akt och PLCy) framkallar mångfald och specificitet i signalresponser. En bättre förståelse av tillväxtfaktormedierad signalering kan uppnås genom att möjliggöra teknik som möjliggör exakt spatiotemporal reglering av enskilda kaskader. Det optogenetiska tillvägagångssättet som införs i detta protokoll visar en sådan teknik som tillåter den specifika aktivatioN av Raf / MEK / ERK signalvägen med hög temporal upplösning. Eftersom detta tillvägagångssätt överskrider processen med NGF-bindning till dess membranreceptorer, beror signalkokinetiken inte längre på de endogena receptorerna. Istället kan en exakt kinetisk kontroll uppnås genom att modulera det stimulerande ljusets tidsmässiga profil ( Figur 2A ). Således öppnar detta tillvägagångssätt nya möjligheter att studera signalkinetiken för kinasaktivitet. Dessutom ger denna experimentella uppställning ett extremt enkelt och ekonomiskt sätt att integrera det optogenetiska tillvägagångssättet i studier av intracellulär signaltransduktion ( Figur 2B -2D ). För PC12-celldifferentieringsanalysen är en 24-h kontinuerlig ljusstimulering vid 0,2 mW / cm2 tillräcklig för att inducera signifikant neuritutväxt ( Figur 3A ). Negativa kontroller, inklusive transfekterade celler utan ljus ( Figur 3B) och icke transfekterade celler med eller utan ljus ( Figur 3C -3D ), visar inte signifikant neuritutväxt. Vid denna kraft genomgår celler transfekterade med en konstitutivt aktiv Raf1 (CA-Raf1) normal differentiering ( Figur 3E ). I synnerhet producerar celler transfekterade med den bicistroniska optogenetiska konstruktionen ett signifikant högre differentieringsförhållande än celler samtransfekterade med två konstruktioner och når värdet inducerat av CA-Raf1 ( Figur 3F ). Differentieringsförhållandet beräknas genom att dividera antalet differentierade celler med antalet transfekterade celler som styrs av GFP-fluorescens. Differentierade celler definieras som de med minst en neurit längre än cellkroppens 35 storlek . Denna förbättring i differentieringsförhållandet härrör från: 1) en bättre leverans av fotoaktiverbara proteiner med det bicistroniska systemet och 2) en opTidsbegränsad expressionsförhållande mellan CIBN och CRY2 35 .
Den reversibla optogenetiska stimulansen av Raf / MEK / ERK-signalvägen i levande Xenopus laevis- embryon: X. laevis är en väletablerad modellorganisme för att studera gentranskription, signaltransduktion och embryonisk utveckling. Tidigare arbete upptäckte att aktiveringen av Raf / MEK / ERK-vägen leder till en förändring av cellförlust, vilket resulterar i bildandet av en ektopisk svansliknande struktur vid framsprångssteget 43 . Som en potent mesoderminducerare kan överuttryckt Raf1 inducera ektopisk mesoderm under bakterielagsspecifikationen, vilket uppträder under blastula och tidiga gastrulasteg, och resulterar i bildandet av ektopiska svansliknande strukturer senare. Alternativt kan överuttryckt Raf1 utlösa en epithelial-mesenkymal övergång (EMT) -liknande händelse efter det att bakterielagsspecifikationen har slutfört och kan direktOmvandla ectoderm till neurala och mesoderma linjer. Detta följs av proliferationen och förlängningen av dessa strukturer 43 . I dessa experiment injicerades RNA som kodar MET-receptor, Ras och Rafl i embryon i tvåcellssteget. Kort efter att RNA injicerades i embryot, började den överuttryckta MET / Ras / Rafl att konstitutivt aktivera nedströms signalkaskader. Därför var det tekniskt utmanande att kringgå tidiga utvecklingsstadier och aktivera Raf1 specifikt efter bakterielagsspecifikation. Det var omöjligt att använda en sådan strategi för att bestämma om aktivering av Raf / MEK / ERK-signaleringen efter bakterielagsspecifikation skulle inducera cellförändring, vilket leder till bildandet av den ektopiska svansliknande strukturen.
Optogenetics tillhandahåller en mekanism för att styra tidpunkten för Raf1-aktiviteten. När RNA av CRY2-2A-2CIBN injicerades i embryon vid tidigt utvecklingsstadiumS, Raf1 förblev inaktiv tills blått ljus levererades. Animal cap testet användes lämpligen för att karakterisera signaleringsresultatet, eftersom den basala ERK-aktiviteten är låg i djurkapslar. Den lättmedierade aktiveringen av Raf / MEK / ERK-signalkaskaden inducerade en signifikant uppreglering av xbra, en mesodermal markör, bestämd genom RT-PCR ( Figur 4A ) eller helmonterad in situ- hybridisering ( Figur 4B ). Dynamiska förändringar i fosforyleringen av ERK som svar på blått ljus detekterades också genom Western-blot-analys ( Figur 4C ). I hela embryon injicerades en blandning av CRY2-2A-2CIBN och n-p-gal-RNA i 8-cellsteget i ett av de dorsala djurblastomererna, vilka senare ger upphov till dorsal främre vävnad. Jämfört med obehandlade embryon ( Figur 4D -4E ) injicerades de som injicerades med CRY2-2A-2CIBN och behandlades med blått ljus förMed ektopiska svansliknande strukturer ( Figur 4F -4G ). Injicerade embryon i mörkret ( Figur 4H ) eller oinjicerad under blått ljusbelysning ( Figur 4I ) bildade inte svansliknande struktur. Blåljusbelysning efter bakterielagsspecifikation inducerade signifikanta svansliknande strukturer ( Figur 4J ).
Figur 1: Mekanismen för ljusinducerad proteinlokalisering och aktivering av kinasignalvägen. ( A ) Design av en bicistronisk konstruktion med ett optimerat CIBN-till-CRY2-förhållande (2 CIBN: 1 CRY2) som möjliggör den ljusinducerade aktiveringen av Raf / MEK / ERK-kinas-signalvägen. Vid ribosomhoppning genererar ett mRNA-transkript två proteiner: CRY2-mCherry-Raf1-N2A (slutandeMed aminosyror NPG) och prolin-2CIBN-GFP-CaaX. ( B ) Ljusinducerad bindning mellan CIBN och CRY2 leder till membranrekrytering av CRY2-mCherry-Raf1, vilket aktiverar Raf / MEK / ERK-signalvägen. ( C ) Fluorescensbilder av BHK21-celler transfekterade med CRY2-2A-2CIBN under epi-belysning. Skalbalk: 20 μm. ( D ) Konfokal fluorescensavbildning av celler transfekterade med CRY2-2A-2CIBN. Den vänstra panelen visar klyvad 2CIBN-GFP-CaaX lokaliserad på plasmamembranet; Mittpanelen visar en stillbild av CRY2-mCherry-Raf1 före blått ljusstimulering; Den högra panelen visar en ögonblicksbild av CRY2-mCherry-Raf1 efter 10 pulser med blått ljusstimulering. Bottenpanelen visar normaliserade intensitetsprofiler längs en gul streckad linje över cellen före och efter ljusstimulering. Skala bar = 20 μm. ( E - F ) Kinetik för lättinducerad CRY2-CIBN-förening ( E ) och spontan dissociatioN ( F ) av CRY2-CIBN-proteinkomplexet i mörkret. Figur 1A- B var anpassad från referens 35 , reproducerad med tillstånd av Company of Biologists. Figur 1E- F var anpassad från referens 44 under Creative Commons Attribution (CC BY) -licensen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Design och kalibrering av den inbyggda LED-matrisen. ( A ) Schematisk av experimentell inställning för den ljusstyrda kinasaktiviteten i levande celler. ( B ) Kretskort för den inbyggda LED-matrisen. ( C ) En ligHt box som kan användas för långsiktig ljusstimulering i en CO 2 inkubator. Aluminiumslådans höjd är 2 tum. ( D ) Typisk LED-utgångseffekt jämfört med spänning. Värderar ljuskraft per LED i en krets där ett strömbegränsande motstånd och fyra lysdioder är anslutna i serie. Figur 2A var anpassad från referens 35 , reproducerad med tillstånd av Company of Biologists. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Optogenetisk induktion av PC12-celldifferentiering. ( A ) Flerkanaliga ögonblicksbilder av PC12-celler transfekterade med CRY2-2A-2CIBN efter 24 timmars blåstimulering (0,2 mW / cm 2 ). En cIrcle markerar en differentierad cell. En kvadrat markerar en odifferentierad cell. ( B ) Samma som ( A ), förutom att ingen blått ljusstimulering användes. ( C - D ) Icke-transfekterade PC12-celler under 24 timmar av blått ljusstimulering (0,2 mW / cm2) ( C ) eller mörk inkubation ( D ). ( E ) Representativa bilder av celler transfekterade med Raf1-GFP-CaaX (CA-Raf1). Cirkeln och rektangeln markerar differentierade respektive odifferentierade celler. ( F ) Differentieringsförhållandena för PC12-celler transfekterade med CA-Raf1, samtransfekterade med CRY2-mCherry-Rafl och CIBN-GFP-CaaX och transfekterades enkelt med CRY2-2A-2CIBN. 24 h efter transfektion exponerades celler antingen för ljus eller inkuberades i mörker under ytterligare 24 h. Värdena representerar medelvärdet ± SD från fyra oberoende dataset. Endast celler utsatta för blått ljus visade signifikant differentiering. Figur 3FAnpassades från referens 35 , reproducerad med tillstånd av bolagets bolag. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Optogenetisk induktion av kinasaktivitet i levande Xenopus- embryon. ( A ) RT-PCR-resultaten visade att exponering för blått ljus inducerade uttrycket av xbra, en pan-mesodermal markör, i CRY2-2A-2CIBN-injicerade djurkapslar vid tidigt gastrulastadium. ( B ) Helmonterad in situ hybridisering av xbra i embryon. Ljusinducerad aktivering av MAPK-aktivitet modulerar den rumsliga fördelningen av xbra (röda pilar i den nedre högra panelen). Svarta pilar markerar atom β-gaLaktosidas som linjespårare. AP: djurpol. VP: vegetabilisk pol. ( C ) Western-blot-analys som visade att, i en djurhattanalys, inducerade CRY2-2A-2CIBN blåljusberoende, reversibel fosforylering av ERK. ( D ) Bilder som visar morfologin hos normala embryon, utan mRNA-injektion och utan ljusbehandlingar. ( E ) En inzoomad bild av ett enda embryo. ( F - G ) Inzoomade och helfältbilder för embryon injicerade med CRY2-2A-2CIBN mRNA och utsatt för blått ljusstimulering. Aktivering av Rafl genom att behandla CRY2-2A-2CIBN-injicerade embryon med blått ljus inducerar ektopiska svansliknande strukturer i huvudområdet. ( H - I ) Negativa kontroller, inklusive embryon injicerade med CRY2-2A-2CIBN men under mörk inkubation ( H ) och oinjicerade embryon under ljusstimulering ( I ). Alla ljusstimuleringsexperiment utfördes med en effekt av 5 mW / cm <Sup> 2. ( J ) Statistisk analys av procentandelen embryon som visar ektopisk svansliknande struktur under varje tillstånd. Skalbalk = ( D ) och ( G ): 1 mm; ( E - F ) och ( H - I ) 0,5 mm. Figur 4A , C , E - F och H - J anpassades från referens 35 , reproducerad med tillstånd av Company of Biologists. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vid uppbyggnad av ljuslådan bör effekten hos enskilda lysdioder mätas. Baserat på tidigare erfarenheter kan effekten variera mellan enskilda lysdioder beroende på tillverkningsvariation. Välj en uppsättning lysdioder som har en effekt ute inom 10% av varandra. Antalet lysdioder, strömbegränsningsmotståndet och effektingången kan modifieras för olika typer av cellkulturbehållare ( t.ex. en 6-brunns- eller 24-brunnsplatta). En 24 h ljusbelysning med en effekt av 0,2 mW / cm2 inducerar inte detekterbar fototoxicitet 44 . Om en högre effekt används, överväg att använda intermittent ljus för att minska värmeutveckling och fototoxicitet. Det optogenetiska systemet som införs i detta protokoll inducerar neuritutväxt i PC12-celler under intermittent ljusstimulering jämförbar med den för kontinuerlig ljusstimulering, med tanke på att det mörka intervallet mellan de två intilliggande ljuspulserna är mindre än 45 min 44 . På grund avTill inbördes skillnader i kinetiken för proteinförening och dissociation måste varaktigheten mellan ljuspulser avstämas för varje unikt proteinpar. Överuttryck av cytosolisk Raf1 orsakar inte cellcellsdifferentiering av PC12 utan blått ljusbelysning. Genom att kontrollera mängden mRNA injicerad i varje embryo observerades inga signifikanta embryoniska fenotyper i mörkret.
Fastän ett lågt effektblått ljus är tillräckligt för att stimulera föreningen av CRY2- och CIBN-fusionsproteiner, begränsar det dåliga penetrationsdjupet av blått ljus dess användning vid djupvävnadsstimulering. Även om sådan stimulering har uppnåtts genom att leverera ljus via andra enheter ( t.ex. fiberoptik), är tillvägagångssätten invasiva 45 . Denna fråga kan lösas på två sätt: genom att använda ett proteinpar som svarar mot längre våglängder ( t.ex. fytokrom-PIF6-proteinparet) eller genom att använda tvåfoton excitation. Båda metoderna kan ge djuptR penetration, men de kan drabbas av andra begränsningar. Exempelvis kräver PhyB-PIF6-paret en syntetisk kofaktor att fungera, och två-fotonmikroskopi kräver kostsam instrumentering. Bristen på avstämning i CRY2-CIBN-interaktionen är en annan begränsning att överväga. Vildtyp CRY2 dissocierar spontant från CIBN med en halveringstid på 5,5 min i mörkret 34 . Beroende på kinetiken hos målsignalvägen kan en förkortad eller förlängd dissociationshalveringstid vara att föredra. Mutationer i CRY2 har gjorts som antingen kan förkorta dissociationshalveringstiden till 2,5 min (W349R) eller förlänga den till 24 min (L348F) 46 . Alternativt visar konstruerade fotoaktiverbara proteinpar baserat på svampreceptor Vivid (VVD) och p / nMagFastl och 2 en dissociationshalveringstid på 4,2 min och 25 s respektive 47 . I detta protokoll sätter vildtyp CRY2-CIBN proteinpar på MAPK-vägen inom 5 minuter av ljusstegMulering och aktiviteten sönderfaller tillbaka till basal nivå inom 30 minuter i däggdjursceller 44 och 1-2 h i Xenopus- embryon 35 . För rumslig kontroll kan konfokalmikroskopi fokusera den blå lasern till storleken på en diffraktionsgränspunkt på cirka 200 nm i bildplanet. Genom att justera storleken på fältdiagrammet i ett epi-belysningsmikroskop utrustat med en icke-sammanhängande ljuskälla, är det möjligt att begränsa belysningsstorleken till omkring 10 pm i diameter. Båda metoderna bör kunna uppnå subcellulär kontroll av optogenetisk stimulering i cellkulturer.
Optogenetics förmåga att reversibelt fråge signaltransduktion med hög rumslig och tidsmässig upplösning ger ett helt nytt tillfälle att studera dynamisk intracellulär signalering i levande celler. Resultat från detta protokoll har visat att Raf1-aktivering är primärt ansvarig för induktionen av neuronal differentiering i PC12 celler 44 . Samma väg leder också till bildandet av sekundära svansliknande strukturer vid utveckling av Xenopus- embryon. Genom att styra tidpunkten för Rafl-aktivering kan den svansliknande strukturen induceras efter scenen av kimskiktbildning 35 . Den nyligen beskrivna LOVTRAP-metoden utnyttjar två konstruerade proteiner, Zdark och LOV2, vilka selektivt binder till varandra endast i mörkret för att modulera den ljusinducerade dissociationen av ett protein av intresse (POI) 48 . Till skillnad från lättmedierad protein-protein associering, som används i detta tillvägagångssätt, använder LOVTRAP ljus för att inducera proteindissociation. Denna nya modalitet är mer flexibel vid modulering av proteinlokalisering och aktivitet i levande celler. Genom att noggrant välja aktiveringsläget inom en signaleringskaskad är det möjligt att dissekera signaltransduktion på okonventionella sätt. Det är exempelvis möjligt att aktivera receptortyrosinkinaser utan lIgand-receptorbindning 49 eller att inducera en delmängd av ligand-framkallade signalkaskader 44 . Strategin som rapporteras här kan generaliseras för att kontrollera andra kinaser, såsom Akt 39 och GTPaser ( t.ex. Rho GTPas), vars aktiveringstillstånd också kan sättas på genom proteintranslokation. Optogenetik kommer fortsättningsvis att tillämpas på levande multicellulära organismer, vilket demonstreras av de senaste arbetena med den optogenetiska kontrollen av proteinlokalisering och signalering i Drosophila 50 , zebrafish 51 , 52 , 53 , 54 och Xenopus embryon 35 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av University of Illinois i Urbana-Champaign (UIUC) och National Institute of Health (NIGMS R01GM111816).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | VWR | 48393 230 | Substrate for live cell imaging |
| Coverslip holder | Newcomer Supply | 6817B | Holder for coverslips |
| Detergent | ThermoFisher | 16 000 104 | For cleaning coverslips |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | For making PLL buffer |
| Disodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 71996-250G | For making PLL buffer |
| Plastic beaker | Nalgene | 1201-1000 | For cleaning coverslips |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465-2.5KG | For adjust pH |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1274-500MG | For coating coverslip |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water | ThermoFisher Scientific | 750024 | For DNA preparation |
| Cover Glass Forceps | Ted Pella | 5645 | Cover glass handling |
| Tissue cutlure dish | Thermofisher | 12565321 | Cell culture dish |
| Sterile centrifuge tubes | ThermoFisher | 12-565-271 | Buffer storage |
| Transfection Reagent | ThermoFisher | R0534 | Transfection |
| CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045088 | For live cell imaging |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Form make cell chamber |
| Plasmid Maxiprep kit | Qiagen | 12965 | Plasmid preparation |
| DMEM medium | ThermoFisher | 11965-084 | Cell culturing medium component |
| F12K medium | ThermoFisher | 21127022 | Cell culturing medium component |
| Horse serum | ThermoFisher | 16050122 | Cell culturing medium component |
| Fetal Bovine Serum | Signa-Aldrich | 12303C-500 mL | Cell culturing medium component |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | Cell culturing medium component |
| Trypsin (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 15050065 | For mammalian cell dissociation |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | For DNA preparation |
| Ficoll PM400 | GE Heathcare Life Sciences | 17-5442-02 | For embryo buffer |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 1.02839.0025 | Oocyte preparation |
| ApaI | ThermoFisher | FD1414 | For linearization of plasmids |
| Dnase I | ThermoFisher | AM2222 | For removing DNA template in the in vitro transcription assay |
| Index-match materials (immersion oil) | Thorlabs | MOIL-20LN | For matching the index between sample substrate and objective |
| Blue LED | Adafruit | 301 | Light source for optogenetic stimulation |
| Resistor kit | Amazon | EPC-103 | current-limiting resistor |
| Aluminum boxes | BUD Industries | AC-401 | light box |
| BreadBoard | Jekewin | 837654333686 | For making LED array |
| Hook up Wire | Electronix Express | 27WK22SLD25 | For making LED array |
| Relay Module | Jbtek | SRD-05VDC-SL-C | For intermittent light control |
| DC Power Supply | TMS | DCPowerSupply-LW-(PS-305D) | Power supply for LED |
| Silicon Power Head | Thorlabs | S121C | For light intensity measurement |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | For light intensity measurement |
| Microscope | Leica Biosystems | DMI8 | For live cell imaging |
| BioSafety Cabinet | ThermoFisher | 1300 Series A2 | For mammalian cell handling |
| CO2 incubator | ThermoFisher | Isotemp | For mammalian cell culturing |
| Stereo microscope | Leica | M60 | For embryo micro-manipulation |
| Microinjector | Narishige | IM300 | For embryo microinjection |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P87 | Needle puller |
| in vitro transcription kit | ThermoFisher | AM1340 | For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column |
| RNA purfication kit | Qiagen | 74104 | Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA |
| Convection oven | MTI corporation | EQ-DHG-9015 | PDMS curing |
| Centrifugal mixer and teflon container | THINKY | AR310 | For mixing PDMS |
| Silicon wafer | UniversityWafer | 452 | Base for making PDMS devices |
| Blade | Techni Edge | 01-801 | For cutting PDMS |
| Capillary glass | Sutter Instruments | BF100-58-10 | For fabrication of injecting needles. |
References
- Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
- Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
- Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
- Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
- Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
- Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
- Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
- Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
- Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Hunter, T. Signaling--2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
- Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
- Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
- Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
- Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
- Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
- Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
- Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
- Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
- Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
- Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
- Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
- Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochemistry. 50 (1), 4-16 (2011).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
- Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
- Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
- Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
- Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
- Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
- Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V.
- Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
- Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
- Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
- Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C.
- Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).
