Summary
Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.
Abstract
Kinaz aktivitesi, hücre proliferasyonu, farklılaşma, göç ve apoptoz dahil olmak üzere bir dizi hücresel işlev için çok önemlidir. Erken embriyonik gelişim sırasında, kinaz aktivitesi son derece dinamik ve embriyo boyunca yaygındır. Farmakolojik ve genetik yaklaşımlar, kinaz aktivitelerini saptamak için sıklıkla kullanılır. Ne yazık ki, bu stratejileri kullanarak üstün uzaysal ve zamansal çözünürlüğü elde etmek zor. Dahası, canlı hücreler ve çok hücreli organizmalarda kinaz aktivitesini tersine çevrilebilir bir tarzda kontrol etmek uygun değildir. Böyle bir sınırlama, gelişme ve farklılaşma sırasında kinaz aktivitesinin niceliksel bir şekilde anlaşılabilmesi için bir tıkanıklık olarak kalmaktadır. Bu çalışma, Fotactevatable protein Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) ve kriptokrom etkileşimli bazik-helis-loop-helezon (CIBN) 'nin N-terminal alanını içeren bir bisistronik sistemden yararlanan bir optogenetik strateji sunmaktadır. ReversiAktif protein kinaz (MAPK) sinyal yolağının etkinliği, canlı hücrelerdeki ışık aracılı protein translokasyonu yoluyla sağlanır. Bu yaklaşım, memeli hücre kültürlerine ve canlı omurgalı embriyolarına uygulanabilir. Bu bisistronik sistem benzer aktivasyon mekanizmaları ile diğer kinazların aktivitesini kontrol etmek üzere genelleştirilebilir ve diğer model sistemlerine uygulanabilir.
Introduction
Büyüme faktörleri, çoğalma, farklılaşma, göç ve apoptoz gibi geniş bir hücre fonksiyonları yelpazesinde yer alır ve embriyonik gelişme, yaşlanma ve mental durumun düzenlenmesi dahil olmak üzere birçok biyolojik olayda önemli roller oynamaktadır 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Birçok büyüme faktörü, karmaşık hücreiçi sinyalleme kaskadları aracılığıyla sinyal verir. Bu sinyal olayları sıklıkla, tersine çevrilebilir protein fosforilasyonu ile tam olarak düzenlenmiş bir şekilde çalıştırılır ( 6 , 7) . Bu nedenle, protein fosforilasyonundan sorumlu olan protein kinazların sinyal verme sonuçlarının anlaşılması temel olarak önemlidir.
Farklı büyüme faktörleri, oldukça yaygın bir hücre içi sinyal ağı vasıtasıyla etkinken distInt hücresel tepkiler 8 , 9 . Reseptör tirozin kinazların yaygın intraselüler mediatörler arasında Ras, Raf, hücre dışı sinyalle düzenlenmiş kinaz (ERK), mitojen ile aktive olan protein kinaz (MAPK) / ERK kinaz (MEK), fosfoinositid 3-kinaz (PI3K), Akt ve fosfolipaz C gama (PLCγ) 10 , 11 . Biriken kanıtlar, sinyal çeşitliliği ve özgünlüğün, sinyal faaliyetinin mekânsal ve zamansal düzenlenişine bağlı olduğunu gösterir 12 . Örneğin, fare feokromasitoma hücrelerinde (PC12), hücre proliferasyonuyla sonuçlanan epidermal büyüme faktörü (EGF) uyarımı, geçici olarak ERK yolunu 9 harekete geçirir. Öte yandan, hücre farklılaşmasına yol açan sinir büyüme faktörü (NGF) ile uyarılması, sürekli bir şekilde ERK yolunu aktive eder 9,13. Kültürlü rHipokampal nöronlarda, beyin türevi nörotrofik faktör (BDNF) ile geçici sinyalizasyon primer nevrit büyümesini arttırırken, sürekli sinyalizasyon da artmış nevrit dallanmasına yol açar 14 . Erken embriyonik gelişim sırasında fosforile ERK aktivitesi geçici olarak dinamiktir ve embriyo 6 boyunca yaygındır. Erken Xenopus embriyogenezisindeki yeni bir genetik ekran, iki alt başlıca büyüme faktörü yolağı olan ERK ve Akt sinyalleme kaskadlarının, aşamaya özgü aktivasyon profilleri 7'yi gösterdiğini ortaya koymuştur. Dolayısıyla, kinaz sinyalleme sonuçlarının anlaşılması, yeterli özünürlükle kinaz aktivitesinin mekansal ve zamansal özelliklerini inceleyebilen araçlar için çağrıda bulunur.
Gelişim sırasında sinyal iletiminin dinamik doğasını araştırmaya yönelik geleneksel deneysel yaklaşımlar arzu edilen uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip değildir. Örneğin, farmakolojik yaklaşımlar küçük kimyasal kullanırHücrelerdeki ve dokulardaki sinyal transdüksiyonunu uyarmak veya bastırmak için biyolojik veya moleküler moleküller. Bu küçük moleküllerin dağınık doğası, eylemlerini belirli bir ilgi alanı 15 ile sınırlandırmayı zorlaştırıyor. Genetik yaklaşımlar ( örn., Transgenez, Cre-Lox sistemi veya mutagenez) hedef gen ekspresyonunun veya protein aktivitesinin 16 , 17 , 18'in geri döndürülemez aktivasyonu veya baskılamasına neden olur. Tet-On / Tet-Off sistemi 19 , gen transkripsiyonunun zamana göre daha iyi kontrolünü sağlar, ancak tetrasiklinin difüzyonuna dayandığı için sıkı uzamsal kontrollerden yoksundur. Kimyasal olarak indüklenen protein dimerizasyonu 20 veya foto-kovaj 21 , 22 , 23 , 24'teki son gelişmeler ,Sinyalizasyon ağlarının zamansal kontrolü. Bununla birlikte, mekansal kontrol, kafesli kimyasalların dağılışı nedeniyle zorlayıcı olmaya devam etmektedir.
Protein-protein etkileşimlerini kontrol etmek için ışığın gücünden yararlanan son ortaya çıkan optogenetik yaklaşımlar, yüksek zaman-zamanlı hassaslığın yanısıra reversibilite ile sinyal yollarının modülasyonuna izin verir. Nöronal ateşlemeyi kontrol etme konusundaki ilk başarısının kısa bir süre sonra 25 , 26 , 27 , optogenetics gen transkripsiyonu, translasyon, hücre göçü, farklılaşma ve apoptoz gibi diğer hücresel işlemleri kontrol etmek için genişletildi. 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . P kullanan bir stratejiHitoaktivatüre protein çifti Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) proteini ve kriptokrom etkileşen bazik-helezon-döngüsel helezon (CIBN) 'nin N-terminal bölgesi, yakın zamanda memeli hücrelerinde ve Xenopus embriyolarında Raf1 kinaz aktivitesini kontrol etmek için geliştirildi. CRY2, mavi ışık uyarıldığında CIBN'ye bağlanır ve CRY2 / CIBN protein kompleksi, karanlıkta kendiliğinden ayrılır 34 . Mavi ışık, CRY2 kofaktörü, flavin adenin dinükleotidi (FAD) uyandırır ve CRY2'de konformasyonel değişikliğe ve ardından CIBN'ye bağlanmasına yol açar. CRY2'nin yapısal olarak aktif (W374A) ve flavin eksikliği olan (D387A) mutantları, FAD bağlayıcı cebindeki mutasyonlar yoluyla üretilebilir: CRY2 W374A mutantı ışıktan bağımsız olarak CIBN'ye bağlanırken CRY2 D387A mutantı, mavi altında CIBN'ye bağlanmaz Işık uyarımı 36 , 37 . I tanımlanan optogenetik sistemBu protokol canlı hücrelerde protein translokasyon aracılı Rafl aktivasyonunu başlatmak için vahşi tip CRY2 ve CIBN kullanır. Rafl'in zar alımının etkinliğini arttırdığı bilinmektedir 38 . Bu sistemde, tandem bir CIBN modülü plazma zarına bağlanır ve CRY2-mCherry, Rafl 35'in N-terminaline kaynaştırılır. Mavi ışığın yokluğunda, CRY2-mCherry-Raf1, sitoplazmada kalır ve Raf1 inaktiftir. Mavi ışık uyarımı, CRY2-CIBN bağlanmaya neden olur ve Raf1'in aktive edildiği plazma membranına Rafl'i işe alır. Raf aktivasyonu, bir Raf / MEK / ERK sinyalleme kaskadını uyarır. Hem CRY2 hem de CIBN füzyon proteinleri, bir bisistronik genetik sistemde kodlanır. Bu strateji, aktivasyon durumu aynı zamanda hücrelerdeki protein translokasyonu ile de etkinleştirilebilen Akt gibi diğer kinazları kontrol etmek üzere genelleştirilebilir 39 . Bu çalışma memeli hücre kültüründe bu optogenetik stratejinin uygulanması için ayrıntılı protokoller sunmaktadırRes ve çok hücreli organizmalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan araştırmaları, Illinois Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Illinois Üniversitesi Hayvan Kaynakları Departmanı (DAR) tarafından belirlenen kurallara uygun olarak yürütülmüştür.
1. BHK21 Memeli Hücre Kültüründe Protein Lokalizasyonunun Optogenetik İndüksiyonu
NOT: Adım 1.1-1.3, tipik olarak kısa çalışma mesafelerine sahip yüksek büyütme hedeflerine ( örneğin, 63X veya 100X) sahip görüntüleme için bir hücre kültürü haznesi oluşturmak için bir yöntem sağlar. Bu hedefler, görüntüleme altlığı olarak ince bir cam lamelini ( örn., # 1.5, 170 μm kalınlık) gerektirir. Alternatif olarak, cam altı bir hücre kültürü çanağı / slayt kullanılabilir. Böyle bir durumda adım 1.1-1.3 atlanabilir.
- Cam lamelleri temizleme
- Bir lamel tutucu 30 cam lamelleri yerleştirin.
- 600 mL'lik bir plastik beherde 20 gr deterjan ve 400 mL ılık musluk suyu ilave edin. PlacE bir manyetik karıştırıcıda behergre ve bütün deterjanlar çözünene kadar karıştırın. Doku kağıdı kullanarak köpüğü çıkarın.
- 100 mm x 15 mm'lik bir Petri tablasının tabanını karıştırma çubuğundan bir aralayıcı olarak kullanın ve lamel tutucu için bir yüzey olarak kullanın. Temizleme işlemi sırasında yeterli akış sağlamak için Petri kabında 3-4 boşaltma deliği yapın.
- Delikleri boşaltmak için lehim havasını ısıtın ve havalandırılmış bir kaputun içindeki plastikten tutun.
DİKKAT: Isınan lehim demirine çıplak elle dokunmayın. - Lamel tutacağı, beherdeki Petri kabına yerleştirin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca gece boyunca karıştırın.
- 1.000 mL'lik bir beher içinde üç kez 500 mL DI su ile yıkayın. Deterjan çözeltisi yeniden kullanılabilir.
- Forseps kullanarak bireysel lamelleri Pick up. Lamelleri 1 dakika boyunca 190 geçirgen (% 95) etanol içine daldırın.
- Lamelleri steril bir kaputun içinde kurutun. Kullanıma kadar lamelleri steril bir plastik kapta saklayın.
- Poli-L-lisin (PLL) kaplamalı lamelleri yapma
- 1.24 g borik asit ve 1.9 g disodyum tetraboratın 400 mL su içinde çözülmesi ile 0.1 M borat tamponu yapın. 10 M NaOH ile pH'ı 8.5'e ayarlayın.
- PLL'yi 1 mg / mL nihai konsantrasyona kadar borat tamponunda eritin. 50 mL steril santrifüj tüpleri içinde PLL solüsyonu alın.
- 10 cm'lik doku kültürü çanağına 50 mL PLL kaplama çözeltisi ekleyin. PLL solüsyonunu ısıtmak için çanağı 37 ° C inkübatöre yerleştirin.
- Lamel kabını (adım 1.1.8) steril bir kaputun içinde açın.
- Temizlenmiş lamelleri doku kültürü çanağında önceden ısıtılmış PLL solüsyonuna birer birer sokun. Tüm yüzeyleri batırmak için kabarcık oluşumundan kaçının.
- 37 ° C CO 2 inkübatör gece boyunca lamel ile çanak koyun. Her lamelü alın ve steril bir lamel tutucu yerleştirin. Üç kere otoklavlanmış ultra saf su (18.2 MΩ & #183 cm direnç) steril bir davlumbaz içinde 1000 mL'lik bir beherglastır.
- Steril kaputun içindeki lamel dolabının içindeki lamelleri kurutun. Kullanıma kadar lamelleri steril bir plastik kapta saklayın.
- Polidimetilsiloksan (PDMS) hücre kültürü odalarını bir araya getirme
- Plastik bir kapta, 40 g PDMS tabanı tartılır ve 10: 1 w / w oranındaki PDMS ve sertleştirme ajanı elde etmek için 4 g sertleştirici madde ilave edilir. 2 dakika pipet ucu ile karıştırarak PDMS / kür ajanı karıştırın. Alternatif olarak, bir santrifüj karıştırıcı kullanın.
- Alüminyum folyo parçasıyla bir tutucu yapmak için şablon olarak 4 inç çaplı bir beher kullanın. Alüminyum folyo tutacağı 15 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Bu alüminyum folyo tutucuya 4 inçlik bir silikon gofret koyun.
- Karışık PDMS çözeltisini tutucuya boşaltın. Hafifçe gofret kenarına dokunmak için ince bir cam çubuk kullanın. Gofretin altına sıkışmış hava kabarcıklarını çıkarın.
- 15 cm'lik Petri kabını bir vakum kabına yerleştirinR PDMS çözüm degasın. Kabarcık oluşmadan 20 dakika boyunca gazdan arındırmaya devam edin. Bu arada, konveksiyon fırını 65 ° C'ye kadar önceden ısıtın.
- 15 cm'lik Petri kabını dikkatlice fırına yerleştirin. 2 saat inkübe edin.
- Plakayı fırından çıkarın. PDMS kenarına hafifçe dokunmak için cam çubuk kullanın ve çapraz bağlantının tam olduğundan emin olun. Aksi takdirde, PDMS katı ve yapışkan olmadan daha uzun süre inkübe edin.
- Alüminyum folyoyu plakadan çıkarın ve silikon gofretten soyun. Kenardan başlayarak, sertleştirilmiş PDMS'yi dikkatle silikon gofretin dışına alın.
DİKKAT: Gofreti kırması için çok fazla kuvvet uygulamayın. - Tıraş bıçağı ile 24 mm x 40 mm lamel sığdırmak için PDMS'yi 20 mm x 30 mm'lik dikdörtgen parçalara bölün.
- Her bir PDMS parçasının merkezinden 10 mm x 20 mm'lik dikdörtgen bir açıklığı kesmek için keski şeklinde bir bıçağı kullanın.
- Adım 1.1'de açıklanan deterjan protokolünü kullanarak PDMS haznelerini temizleyin.
- PDMS haznelerini temiz bir kaputta kurutun. Kuru hazneleri alüminyum folyo ile kaplanmış otoklavlanabilir bir kaba yerleştirin.
- Konteyner yerçekimini (121 ° C, 15 psi) 30 dakika boyunca otoklavda tutun ve kabı oda sıcaklığında saklayın.
- BHK21 hücre kültürü ve transfeksiyonu
- 445 mL DMEM 50 mL FBS ve 5 mL 100 x Penn-Strep-Glutamin (10,000 U / mL penisilin, 10 mg / mL streptomisin ve 29,2 mg / mL L ile karıştırılarak BHK21 hücre kültürü için 500 mL ortam hazırlayın -glutamin). FBS'nin nihai konsantrasyonunun% 10 olduğundan emin olun.
- HEPES olmayan CO 2 ile 10 mL canlı hücre görüntüleme için bağımsız ortam.
NOT: CO2'den bağımsız ortam, CO2 inkübatörü olmaksızın hücre büyümesini destekler ve atmosferik koşullar altında hücrelerin görüntülenmesi için idealdir. Ayrıntılı bilgi için Malzeme Listesi'ne bakın. BHK21 hücre hattına ek olarak, diğer memeli hücreleri türleri de vermelidirBenzer sonuçlar. - Steril bir başlıkta steril bir PLL kaplı lamel (adım 1.2) üzerine bir otoklavlanmış, steril PDMS odası (adım 1.3) yerleştirerek bir hücre kültürü cihazı monte edin.
- Her cihazı steril bir 60 mm'lik Petri kabına yerleştirin.
- 12-iyi doku kültürü plakasının bir kuyudan hücreleri ayırmak için 0.5 mL% 0.25 tripsin kullanın. Hemocytometer ile hücre yoğunluğunu sayın. 200 uL hücre kültürü ortamı ile bölmedeki 20.000 BHK21 hücresi (yaklaşık 10.000 hücre / cm2).
- DNA plazmiti bir plazmid hazırlama kiti ile hazırlayın (Malzeme Listesine bakın).
NOT: CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX'ın tasarımı ve işlevselliği Şekil 1A - 1B'de gösterilmektedir. - Hücre kaplamasından yirmi dört (24) saat sonra hücreleri üreticinin protokolüne göre 50-100 ng CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX plasmidle transfekte edin.
- Transfeksiyondan sonra üç (3) saat sonra m200 μL taze kültür ortamına (basamak 1.4.1) yerleştirin ve kültürlerin 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde inkübe edilerek gece boyunca iyileşmesine izin verin.
- Flüoresan canlı hücre görüntüleme
- Bir bilgisayarı, ışık kaynağını, mikroskopu ve kamerayı açın. Protokolün geri kalanı için bir konfokal floresan mikroskopu (100X yağ ile daldırma objektifle donatılmış) kullanın.
NOT: Ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskop da kullanılabilir. - Hücre kültürü ortamını, 200 μL CO 2'ye bağlı olmayan ortam ile değiştirin.
- Hücreleri mikroskop üzerine yerleştirmeden önce veri toplama protokolünü kurun. Optogenetik uyarılma için 488-nm uyarılma FITC kanalı kullanın. Transfekte edilmiş hücreleri bulmak ve mCherry etiketli proteinin hücresel lokalizasyonunu izlemek için 561 nm uyarılma TRITC kanalı kullanın.
- Sırasıyla 120 ve 200 olarak FITC ve TRITC kanallarının kazançlarını ayarlayın. 2,2 piksel süren bir süre kullanın1; s ve boyutu 512 x 512 piksel.
- Nesne penceresine bir güç ölçer koyarak 488 nm ışığın gücünü ölçün. CIBN-CRY2PHR ilişkisini indüklemek için toplam 2 μW'lık bir güç (odağında yaklaşık 10,000 W / cm2) yeterlidir.
- 5 sn aralıkla ve toplam edinme süresi 2 dakikalık bir zaman damgası alımı oluşturun.
- Nesnel pencerede uygun indeks eşleştirme malzemesini (daldırma yağı) uygulayın. Fazla kontrast modunu lamel yüzeyi üzerindeki hücrelere odaklanmak için kullanın.
- Mikroskop sahne hareket ettirerek 561 nm ışık altında transfekte bir hücre bulun.
DİKKAT: Bu aşamada mavi ışık kullanmayın; bu, fotoaktif hale getirilebilir proteinler arasındaki ilişkiyi etkinleştirir. - Transfekte edilmiş bir hücre bulunca veri toplama işlemini başlatın.
NOT: Başarıyla transfekte edilmiş hücreler, hem FITC (2CIBN-GFP-CaaX'den) hem de TRITC (CRY2-mCherry-Rafl'den) kanallarında floresan göstermelidir ( Şekil 1C-D - FITC ve TRITC kanallarına zaman damgalı görüntü dizisi kaydedin ( Şekil 1D ).
- CRY2-CIBN protein kompleksinin spontan ayrışmasını saptamak için, 30 saniyelik bir aralıkla tek başına Txred kanalıyla 20 dakika süreyle başka bir zaman damgası kaydedin.
- Veri analizi için zaman damgalı görüntüyü kaydedin.
- Bir bilgisayarı, ışık kaynağını, mikroskopu ve kamerayı açın. Protokolün geri kalanı için bir konfokal floresan mikroskopu (100X yağ ile daldırma objektifle donatılmış) kullanın.
- Görüntü analizi
- Görüntüleri bir görüntüdeki yoğunluğu çıkarabilen bir görüntü analiz yazılımı ile açın 40 .
- İki temsilci enstantane seçin: biri mavi ışığa maruz kalmadan önce ve diğer mavi ışık sonrası maruz kalmadan önce.
- Arka planı, plazma zarını ve sitoplazmayı kapsayan bir hücre çizgisi çizin. Bu çizgi boyunca yoğunluğu projelendirin. Işık öncesi ve sonrası farkı karşılaştırmak için değerleri kaydedin ve çizin ( Şekil 1D ).
- Protein birleşmesinin kinetiğini analiz etmek için, selekPlazma membranında bir temsilci ilgi bölgesi (ROI), sitoplazmada bir ROI ve arka planda bir ROI.
- Görüntü yığını için plazma membranının (I PM ), sitoplazmanın (I CYT ) ve arka planın (I BKD ) ortalama yoğunluklarını elde edin.
- Aşağıdaki denklemi kullanarak her görüntü için membran / sitozolik yoğunluğun oranını hesaplayın:
- Oranı zamana göre çizin ve CRY2-CIBN'nin bağlanma veya ayrılma kinetiğini belirleyin ( Şekil 1E -F ).
2. Bir CO 2 İnkübatöründe Uzun Süreli Işık Uyarımı için bir LED Arrayinin Yapımı
NOT: Deneysel kurulumun genel şeması Şekil 2A'da gösterilmiştir.
- 12 mavi LED'i iki ekmek kabına yerleştirerek LED dizisini yapınDs ve bağlantılı akım sınırlayıcı dirençler.
NOT: 30 V'luk bir güç kaynağı ile dört LED seri bağlanabilir ve parlaklıkları bir akım sınırlayıcı direnç ile kontrol edilebilir. - Ekmek tahtalarını bir alüminyum kutuya yerleştirin.
NOT: Alüminyum kutunun yüksekliği 2 inç olmalıdır. Bu yükseklik, 12 kuyucuklu bir doku kültürü plakasını aydınlatmak için idealdir, çünkü ışınlanan spotun boyutu tek bir kuyu ile aynıdır. - Güç kaynağına bağlanmak için iki metal tel kullanın. Işık kutusu bir CO2 inkübatörüne yerleştirildiğinde telin uzunluğunun yeterli olduğundan emin olun.
- Işık kutusunun kapağı olarak şeffaf bir ışık difüzörü kullanın ( Şekil 2C ).
- Her bir LED'in güç çıkışını çeşitli voltaj girişlerinde kalibre edin. 24 saat PC12 hücre farklılaşma tahlili için 0,2 mW / cm2'lik bir güç kullanın. Canlı Xenopus embriyoları veya eksplantları için 5 mW / cm2'lik bir güç kullanıntahliller.
3. PC12 Hücre Farklılaşmasının Optogenetik İndüksiyonu
- Hücre kültürleme ve transfeksiyon
- 407.5 mL F12K'yı 75 mL at serumu + 12.5 mL FBS + 5 mL 100 x Penn-Strep-Glutamin (at serumu ve FBS'nin nihai konsantrasyonları) ile karıştırarak bir sıçanın feokromasitoma (PC12) hücre kültürü için 500 mL ortam oluşturun : Sırasıyla% 15 ve% 2.5). 99 hacim F12K ortamında 1 hacim dolu ortamı karıştırarak düşük serum medyumu yapın.
- Plaka PC12 hücrelerini, 12 delikli bir plakada 300,000 hücre / kuyu veya 75,000 hücre / cm2'lik bir yoğunluğa yerleştirin.
- Hücre kaplamasından 24 saat sonra hücreleri CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX ile transeke edin (adım 1.4.7'ye benzer şekilde). Her göz için 1.2 μg DNA kullanın. Hücrelerin,% 5 CO2 ile takviye edilmiş 37 ° C inkübatörde gece boyunca kültür ortamında iyileşmesine izin verin. Transfeksiyondan 16 saat sonra transfeksiyon verimliliğini kontrol edin.
NOT:% 30-50 bir transfeksiyon efesiYeterli hücre sayısını sağlamak için yeterlilik sağlanmalıdır. - Transfeksiyondan 24 saat sonra ortamı düşük serum ortamına değiştirin. 12 oyuklu bir plakanın her oyunda 1 mL ortam orta kullanın.
- Işık kaynaklı PC12 hücre farklılaşması
- LED dizisini CO 2 inkübatörüne yerleştirin. Bir çift kablo kullanarak güç kaynağına bağlayın. LED'in gücünü 0.2 mW / cm 2 olarak ayarlayın. Dedektörün penceresine transfekte edilmiş PC12 hücrelerini içeren 12 oyuklu plakayı yerleştirin (adım 3.1.3). % 5 CO2 ile takviye edilmiş 37 ° C inkübatörde 24 saat kesintisiz ışık aydınlatması uygulayın.
- Flüoresan canlı hücre görüntüleme
- Mikroskop ve numune hazırlama için 1.5.1-1.5.4 adımlarını izleyin.
- Tekli anlık veri toplama kurun. Hem GFP hem de Txred kanalı için 200 ms kullanın.
- Hem GFP hem de Txred kanallarında transfekte edilmiş hücrelerin görüntülerini yakalayın. Yaklaşık 200 cel kaydetHer durum için. Veri analizleri için dosyaları kaydedin.
- Görüntü analizi
- Transfekte edilmiş hücrelerin toplam sayısı üzerinden farklılaşmış hücrelerin yüzdesini sayın.
- Hücreleri saymak için görüntü analiz yazılımındaki herhangi bir hücre sayım modülünü kullanın.
- Farklılaşmış hücreleri manuel olarak sayın.
NOT: Farklılaşmış hücreler, en az bir nevritin hücre gövdesinden daha belirgin şekilde uzandığı tanımlanır ( Şekil 3A -3B ). - Kademesiz hücreler ile adım 3.4.3'ü tekrarlayın.
- Aşağıdaki denklemi kullanarak farklılaşma oranını hesaplayın:
4. Xenopus Embriyolarında Kinaz Aktivitesinin Optogenetik Kontrolü
- Tamponların hazırlanması
- 1 L 1x Marc Kullanıcı Modifiyeli Zil (MMR) hazırlayın: 100 mMNaCl, 2 mM KC1, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 ve 5 mM HEPES; PH 7.5.
- MRNA'nın hazırlanması
- 37 ° C'de 2 saat boyunca CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX plazmid DNA'sını (2 μg) 1 μL ApaI (50 ünite) ile özümleyin.
- Doğrusallaştırılmış DNA'yı 60 μL% 100 etanol içerisinde çöktürün. DNA peletlemek için oda sıcaklığında 5 dakika 12,000 x g'de döndürün. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve pelet% 60 etanol ile tekrar 60 μL yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika daha 12,000 x g'de döndürün. Dikkatle süpernatantı alın ve DNA pelletini 6 uL RNaz içermeyen H 2 O içinde tekrar süspansiyon haline getirin.
- Sağlanan SP6 RNA polimeraz, bir ribonükleotid karışımı (10 mM ATP, CTP ve UTP, 2 mM GTP ve 8 mM kap analogu) ile 2 μL doğrusallaştırılmış DNA'yı 1 μg inkübe ederek in vitro transkripsiyon gerçekleştirin ve 20 μL nükleaz- Oda sıcaklığında 1 saat serbest su.
- D'yi kaldırNA şablonu 37 ° C'de DNase I sindirimi ile en az 15 dakika soğutulur ve sentezlenen RNA'yı bir silis-membran spin kolonu kullanarak arındırır.
- Reaksiyonu durdurun ve 30 μL nükleaz içermeyen su ve 30 μL LiCl çöktürme çözeltisi ilave ederek RNA'yı çöktürün. Iyice karıştırın ve -20 ° C'de 30 dakika kadar soğutun.
- RNA peletlemek için 12.000 × g'de 15 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin.
- Yüzey maddeyi dikkatlice çıkarın. RNA'yı bir kez% 70 etanolün 1 mL'si ile yıkayın ve 40 μL'lik nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin.
- Bir spin sütununa 40 μL RNA yükleyin. Birleştirilmemiş nükleotidleri ve kapakları çıkarmak için 4 ° C'de 1 dakika 12.000 x g'de santrifüjleyin.
- Xenopus embriyolarını hasat edin
- Sive ve ark. Tarafından açıklanan protokolü takip edin . 41 , Xenopus embriyolarını elde etmek için.
- MRNA mikroenjeksiyonu
- üretmekCam kılcalları bir kılcal çekici ile çekerek mikroenjeksiyon için iğneler. Çekme programını şu şekilde ayarlayın: ısı = 355, çekme kuvveti = 80, hız = 50 ve zaman = 100.
- % 3 sistein (0.2x MMR'de seyreltilmiş) ile muamele ederek embriyolardan jöle kaplamasını çıkarın.
- Embriyoları, mikroenjeksiyon için% 3 polisükroz ve 0.5x MMR çözeltisine aktarın. Her embriyoya 500 ng CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA'yı enjekte edin.
NOT: 1 ng'ın üstünde bir dozun enjeksiyonu, MAPK sinyalizasyonunun maviden bağımsız olarak aktivasyonuyla sonuçlanır.
- Kinaz aktivitesinin optogenetik uyarımı
- Kültür, mid-gastrula evresine ulaşana kadar embriyoları oda sıcaklığında% 3 polisükroz, 0.5x MMR çözeltisi içinde mikroenjeksiyon yaptı (evre 12). Ardından embriyoları 0.2x MMR çözeltisinde kültürleyin.
- Embriyoları veya eksplantları 12 oyuklu bir tablaya aktarın. Mavi ışık için ev yapımı LED dizisine 12-yuvalı plakayı yerleştirin (adım 2.5)T (475 nm) tedavisi.
- Embriyoların veya eksplantların tam mavi ışıklandırılmasını sağlamak için 12 bölmeli plakanın tepesine bir ayna yerleştirin.
- Mavi ışığın gücünü 5 mW / cm 2'ye ayarlayın.
NOT: Mavi ışıklı işlem, herhangi bir zamanda,% 3 polisükroz, 0.5x MMR çözeltisi veya 0.2x MMR çözeltisi ile gerçekleştirilebilir. - Embriyoları herhangi bir zamanda hasat edin. Bunları histolojik, batı leke veya gen ekspresyonu analizi için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fotoaktive edilebilir protein çiftlerinin rasimetrik ekspresyonu: Şekil 1A , domuz teshovirum-protein çiftlerine dayanan bir bisistronik optogenetik yapı CRY2-mCherry-Rafl-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (CRY2-2A-2CIBN olarak anılacaktır) 1 2A (P2A) peptidi, memeli hücre hatları 42 arasında en yüksek ribozom atlama verimliliğini gösterir. Daha önceki çalışmalarda, CIBN-GFP-CaaX: CRY2-mCherry-Raf1 için optimal oranın 2: 1 35 olduğu belirlenmiştir. Bu konfigürasyon yeterli membran alımı ve CRY2-mCherry-Raf1'in aktivasyonuna izin verir ( Şekil 1B ). Tek başına CRY2-2A-2CIBN ile transfekte edilen hücreler, hem epi- aydınlatma ( Şekil 1C ) hem de konfokal mikroskopi ( Şekil 1D ) altında hem GFP hem de Txred floresan kanallarında berrak floresan gösterirler. Mavi ışık aracılı membraCRY2-mCherry-Rafl'in ( Şekil 1D ) işe alımı konfokal mikroskobunda açıkça tespit edilebilir. Dernek, mavi ışığa maruz kaldıktan sonra saniye içinde ortaya çıkar ( Şekil 1E ) ve CRY2-CIBN protein kompleksi, yaklaşık olarak 5.5 dakika yarı ömrüyle ayrışır ( Şekil 1F ).
Sinir büyüme faktörünün yokluğunda ışık kontrollü PC12 hücre farklılaşması: Büyüme faktörü sinyallemesinde ilgi çekici bir gözlem, ortak akış aşağı sinyalleme yolaklarının ( örn., ERK, PI3K-Akt ve PLCγ) sinyal verme yanıtlarında çeşitlilik ve özgünlüğü ortaya çıkarmasıdır. Büyüme faktörü aracılı sinyalizasyon hakkında daha iyi bir anlayış, bireysel basamakların spesifik zamansal regülasyonunu sağlayan teknoloji sağlayarak başarılabilir. Bu protokolde tanıtılan optogenetik yaklaşım, belirli bir aktivasyona izin veren böyle bir teknolojiyi göstermektedirN Raf / MEK / ERK sinyal yolağının yüksek zamansal çözünürlüğü ile. Bu yaklaşım, membran reseptörlerine NGF bağlanması sürecini atladığından, sinyalleme kinetiği artık endojen reseptörlere bağlı değildir. Bunun yerine, hassas kinetik kontrol uyarıcı ışığın zamansal profilini modüle ederek elde edilebilir ( Şekil 2A ). Böylece, bu yaklaşım, kinaz aktivitesinin sinyal kinetik çalışması için yeni olanaklar açar. Ayrıca, bu deneysel kurulum, hücre içi sinyal iletimi çalışmalarına optogenetik yaklaşımı entegre etmek için son derece basit ve ekonomik bir yol sağlar ( Şekil 2B -2D ). PC12 hücre farklılaşma tahlili için, 0,2 mW / cm2'de 24 saat sürekli ışık uyarısı, önemli nevrit büyümesini indüklemek için yeterlidir ( Şekil 3A ). Negatif kontroller, ışıksız transfekte hücreler dahil ( Şekil 3B) ve ışıklı veya ışıksız transfekte edilmemiş hücreler ( Şekil 3C -3D ) belirgin nevrit büyüme göstermez. Bu güce, yapısal olarak aktif bir Rafl (CA-Rafl) ile transfekte edilen hücreler normal farklılaşma geçirir ( Şekil 3E ). Özellikle, bisistronik optogenetik yapı ile transfekte edilen hücreler, CA-Rafl'in indüklediği değere ulaşan iki yapı ile birlikte transfekte edilen hücrelere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir farklılaşma oranı üretmektedir ( Şekil 3F ). Farklılaşma oranı, farklılaşmış hücrelerin sayısını GFP flüoresan tarafından yönlendirilen transfekte hücrelerin sayısına bölmek suretiyle hesaplanır. Farklılaşmış hücreler, hücre gövdesinin 35 boyutundan daha uzun olan en az bir nevrite sahip hücreler olarak tanımlanır. Farklılaşma oranındaki bu gelişme: 1) bisistronik sistem ile fotoaktif hale getirilebilir proteinlerin daha iyi bir şekilde iletilmesi ve 2)CIBN ve CRY2 arasındaki zamanlı ifade oranı 35 .
Canlı Xenopus laevis embriyolarında Raf / MEK / ERK sinyal yolağının tersinir optogenetik uyarımı: X. laevis , gen transkripsiyonu, sinyal iletimi ve embriyonik gelişimi incelemek için iyi kurulmuş bir model organizmadır. Önceki çalışma, Raf / MEK / ERK yolağının aktivasyonunun bir hücre kaderi değişikliğine yol açtığını ve bunun tailbud aşamasında 43 ektopik kuyruk benzeri bir yapının oluşumunu sağladığını keşfetti. Güçlü bir mezoderm uyarıcısı olarak aşırı ifade edilen Raf1, blastula ve erken gastrulasyon evrelerinde ortaya çıkan ve daha sonra ektopik kuyruk benzeri yapıların oluşmasına neden olan mikrop tabaka spesifikasyonu sırasında ektopik mesodermi indükleyebilir. Alternatif olarak aşırı ifade edilen Raf1, mikrop katmanı spesifikasyonunun tamamlanmasından sonra epitelial mezenkimal geçişe (EMT) benzer bir olay tetikleyebilir ve doğrudanEktodermi sinir ve mezoderm soylarına dönüştürür. Bunu, bu yapıların çoğalması ve uzatılması izlemektedir 43 . Bu deneylerde, MET reseptörünü, Ras'yı ve Rafl'i kodlayan RNA'lar, iki hücreli evredeki embriyolar içine enjekte edildi. RNA, embriyoya enjekte edildikten kısa bir süre sonra aşırı eksprese edilen MET / Ras / Rafl, aşağı akış sinyalleme basamaklarını yapılandırıcı olarak aktive etmeye başladı. Bu nedenle, erken gelişim aşamalarını atlamak ve mikrop katmanı spesifikasyonundan sonra Raf1'i etkinleştirmek teknik açıdan zordu. Germe tabakası spesifikasyonundan sonra Raf / MEK / ERK sinyallemesinin aktivasyonunun bir hücre kaderi değişikliğine neden olup olmadığını belirlemek için böyle bir strateji kullanmak imkansızdı, bu da ektopik kuyruk benzeri yapının oluşumuna yol açtı.
Optogenetics Raf1 aktivitesinin zamanlamasını kontrol etmek için bir mekanizma sağlar. CRY2-2A-2CIBN'nin RNA'sı embriyoların erken gelişim aşamasındaki enjekte edildiğindeS, Raf1, mavi ışık verilene kadar aktif değildi. Hayvan kapak testi, sinyal verme sonucunu karakterize etmek için uygun bir şekilde kullanılmıştır, zira temel başlıktaki ERK aktivitesi düşüktür. Raf / MEK / ERK sinyalleme kaskadının hafif aracılı aktivasyonu , bir RT-PCR ( Şekil 4A ) veya tam montajlı in situ hibridizasyon ( Şekil 4B ) ile belirlendiği üzere, bir mezodermik markör olan xbra'nın önemli bir upregülasyonuna neden oldu. Mavi ışığa yanıt olarak ERK'nin fosforilasyonundaki dinamik değişiklikler de Western-leke analizi ( Şekil 4C ) ile tespit edildi. Tüm embriyoda CRY2-2A-2CIBN ve n-β-gal RNA'ların bir karışımı 8 hücreli evrede dorsal hayvan blastomerlerinden birine enjekte edildi ve daha sonra dorsal anterior doku oluştu. Tedavi edilmeyen embriyolarla ( Şekil 4D- 4E ) karşılaştırıldığında , CRY2-2A-2CIBN enjekte edilenler ve mavi ışık ile muamele edilenlerMed ektopik kuyruk benzeri yapılar ( Şekil 4F -4G ). Karanlıkta ( Şekil 4H ) veya mavi ışıklı aydınlatmanın altında enjekte edilen embriyolar ( Şekil 4I ) kuyruk benzeri yapı oluşturmadı. Germe tabakası spesifikasyonundan sonra mavi ışıkla aydınlatma, önemli kuyruk benzeri yapılar uyandırdı ( Şekil 4J ).
Şekil 1: Işık kaynaklı protein lokalizasyonu mekanizması ve kinaz sinyal yolağının aktivasyonu. ( A ) Raf / MEK / ERK kinaz sinyal yolağının ışık kaynaklı aktivasyonuna izin veren, optimize edilmiş bir CIBN-CRY2 oranına (2 CIBN: 1 CRY2) sahip bir bisistronik yapı tasarımı. Ribozom atlamanın ardından, bir mRNA transkripti iki protein üretir: CRY2-mCherry-Rafl-N2A (bitenAmino asitler NPG ile) ve prolin-2CIBN-GFP-CaaX ile. ( B ) CIBN ve CRY2 arasındaki ışık ile indüklenen bağlanma, Raf / MEK / ERK sinyal yolunu aktive eden CRY2-mCherry-Rafl'in membran alımı yol açar. ( C ) epi-aydınlatma altında CRY2-2A-2CIBN ile transfekte BHK21 hücrelerinin floresan görüntüleri. Ölçek çubuğu: 20 μm. ( D ) CRY2-2A-2CIBN ile transfekte edilen hücrelerin konfokal flöresan görüntülemesi. Sol panel plazma membranında lokalize bölünmüş 2CIBN-GFP-CaaX gösterir; Orta panel, mavi ışık uyarımı öncesinde CRY2-mCherry-Raf1'in bir fotoğrafını gösterir; Sağ panel, mavi ışık uyarısının 10 atımından sonra CRY2-mCherry-Raf1'in bir fotoğrafını gösterir. Alt panel, ışık uyarımı öncesi ve sonrasında hücre boyunca sarı bir noktalı çizgiyle normalleştirilmiş yoğunluk profillerini göstermektedir. Ölçek çubuğu = 20 μm. ( E - F ) Işık ile indüklenen CRY2-CIBN birleşmesi için kinetik ( E ) ve spontan dissociatiN ( F ) karanlıkta CRY2-CIBN protein kompleksinin. Şekil 1A -B , Biyologlar Şirketinin izniyle yeniden üretilen 35 referansından uyarlanmıştır. Şekil 1E -F , Creative Commons Attribution (CC BY) lisansı uyarınca referans 44'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Ev yapımı LED dizisinin tasarımı ve kalibrasyonu. ( A ) Canlı hücrelerdeki ışık kontrollü kinaz aktivitesi için deney düzeneğinin şeması. ( B ) Ev yapımı LED dizisi için devre kartı. ( C ) Bir ligCO2 kuluçka cihazında uzun süreli ışık uyarımı için kullanılabilen bir ht kutusu. Alüminyum kutunun yüksekliği 2 inçtir. ( D ) Tipik bir LED çıkış gücü ve voltaj. Bir akım sınırlayıcı direncin ve dört LED'in seri bağlandığı bir devrede LED başına ışık gücü değerlerir. Şekil 2A , Referans 35'den uyarlanmıştır ve Biyologlar'ın izniyle yeniden üretilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: PC12 hücre farklılaşmasının optogenetik indüksiyonu. ( A ) 24 saatlik mavi ışık uyarımından sonra (0.2 mW / cm2) CRY2-2A-2CIBN ile transfekte edilmiş PC12 hücrelerinin çok kanallı görüntüleri. ACIrcle farklılaşmış bir hücreyi işaretler. Bir kare, ayrışmamış bir hücre işaret eder. ( B ) ( A ) ile aynıdır, ancak mavi ışık uyarısı yapılmamıştır. ( C - D ) 24 saatlik mavi ışık uyarımı (0.2 mW / cm2) ( C ) veya koyu inkübasyon ( D ) altında transfekte edilmemiş PC12 hücreleri. ( E ) Raf1-GFP-CaaX (CA-Raf1) ile transfekte edilen hücrelerin temsili görüntüleri. Çember ve dikdörtgen sırasıyla farklılaşmış ve farklılaşmamış hücrelere işaret eder. ( F ) CRY2-mCherry-Raf1 ve CIBN-GFP-CaaX ile birlikte transfekte edilmiş ve tek tek CRY2-2A-2CIBN ile transfekte edilmiş CA-Rafl ile transfekte edilmiş PC12 hücrelerinin farklılaşma oranları. Transfeksiyondan 24 saat sonra hücreler ya ışığa maruz bırakıldı ya da karanlıkta 24 saat daha inkübe edildi. Değerler, dört bağımsız veri grubundan ortalama ± SD'yi temsil etmektedir. Sadece mavi ışığa maruz kalan hücreler belirgin farklılık gösterdi. Şekil 3FReferans 35'ten uyarlandı, Biyologlar'ın izniyle tekrar edildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Canlı Xenopus embriyolarında kinaz aktivitesinin optogenetik indüksiyonu. ( A ) Mavi ışığa maruz kalmanın CRY2-2A-2CIBN enjekte edilen hayvan kapaklarında erken gastrulada bir pan-mezoderm markör olan xbra'nın ekspresyonunu indüklediğini gösteren RT-PCR sonuçları. ( B ) Embriyolarda xbra'nın bütünüyle yerinde hibridizasyonu. Işık tarafından başlatılan MAPK aktivitesinin aktivasyonu xbra'nın mekansal dağılımını modüle eder (sağ alt paneldeki kırmızı oklar). Siyah oklar, nükleer β-ga işaretiSoy izleyici olarak laktosidaz. AP: hayvan kutbu. VP: bitkisel direk. ( C ) bir hayvan kapası tahlilinde CRY2-2A-2CIBN'nin ERK'nın mavi ışığa bağımlı, tersinir fosforilasyonunu indüklediğini gösteren batı leke analizi. ( D ) Normal embriyoların morfolojisini gösteren resimler, mRNA enjeksiyonu olmadan ve hafif tedaviler olmadan. ( E ) Tek bir embriyonun yakınlaştırılmış bir görüntüsü. ( F - G ) CRY2-2A - 2CIBN mRNA ile enjekte edilen ve mavi ışık uyarısına tabi tutulan embriyolar için yakınlaştırılmış ve tam alan görüntüleri. Rafl'in CRY2-2A-2CIBN enjekte edilmiş embriyolarını mavi ışık ile harekete geçirerek aktivasyonu, baş bölgesindeki ektopik kuyruk benzeri yapıları indükler. ( H - I ) Negatif kontroller, CRY2-2A - 2CIBN enjekte edilen ancak karanlık inkübasyon ( H ) ve ışık uyarımı altında enjekte edilmemiş embriyolar ( I ) ile embriyolar dahil. Tüm ışık uyarı deneyleri, 5 mW / cm2'lik bir güçle gerçekleştirildiSup> 2. ( J ) Her koşulda ektopik kuyruk benzeri yapı gösteren embriyoların yüzdesinin istatistiksel analizi. Ölçek çubuğu = ( D ) ve ( G ): 1 mm; ( E - F ) ve ( H - I ) 0.5 mm. Şekil 4A , C , E - F ve H - J , Biyologlar Şirketinin izniyle yeniden üretilen 35 referansından uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Işık kutusunu oluştururken, tek tek LED'lerin gücü ölçülmelidir. Daha önceki tecrübelere dayanarak, güç çıkışı, üretim varyansına bağlı olarak tek tek LED'ler arasında değişiklik gösterebilir. Birbirinden% 10'luk bir güç çıkışı olan bir dizi LED seçin. LED'lerin sayısı, akım sınırlayıcı direnç ve güç girişi, farklı hücre kültürü kapları tipleri ( örn., 6 kuyucuklu veya 24 kuyulu bir plaka) için değiştirilebilir. 0,2 mW / cm2'lik bir güce 24 saat boyunca ışık uygulanması, tespit edilebilir fototoksisiteye neden olmaz 44 . Daha yüksek bir güç kullanılırsa, ısı oluşumunu ve fototoksisiteyi azaltmak için aralıklı ışık kullanmayı düşünün. Bu protokolde tanıtılan optogenetik sistem, kesintisiz ışık uyarımı altında PC12 hücrelerinde nötit büyümesini uyarıp, iki bitişik ışık palsı arasındaki karanlık aralığın 45 dakikadan 44 dakikadan az olduğu göz önüne alındığında, sürekli ışık uyarımıyla karşılaştırılabilir. DueProtein birleşmesinin ve ayrışmanın kinetikteki içsel farklılıklara göre, ışık pulsları arasındaki süre eşsiz her protein çifti için ayarlanmalıdır. Sitozolik Rafl'in aşırı ekspresyonu, mavi ışıklı aydınlatma olmadan PC12 hücre farklılaşmasına neden olmaz. Her embriyoya enjekte edilen mRNA miktarını kontrol ederek, karanlıkta önemli embriyonik fenotip gözlemlenmedi.
Düşük güç mavi ışık, CRY2- ve CIBN-füzyon proteinlerinin birleşmesini teşvik etmek için yeterli olmasına rağmen, mavi ışığın zayıf penetrasyon derinliği, derin doku uyarımında kullanımını sınırlar. Böyle bir uyarılma, diğer cihazlar ( örneğin fiber optik) yoluyla ışık iletmekle sağlansa da, yaklaşımlar invazivdir45. Bu konu iki şekilde ele alınabilir: daha uzun dalga boyuna tepki gösteren bir protein çiftinin kullanılması ( örneğin, fitokrom-PIF6 protein çifti) veya iki foton uyarımının kullanılması. Her iki yaklaşım derinleştirebilirR penetrasyon, ancak diğer kısıtlamalardan zarar görebilirler. Örneğin, PhyB-PIF6 çifti, işlev için sentetik bir kofaktör gerektirir ve iki fotonlu mikroskopi pahalı enstrümantasyon gerektirir. CRY2-CIBN etkileşiminde ayarlanamamasının bir başka kısıtlaması da dikkate alınmasıdır. Vahşi tip CRY2 karanlıkta CIBN'den spontan olarak ayrışır ve yarı ömrü 5.5 dakika olur 34 . Hedef sinyal yolağının kinetiğine bağlı olarak, kısaltılmış veya uzatılmış bir çözülme yarı ömrü tercih edilebilir. Çözünme yarılanma ömrünü 2.5 dakikaya (W349R) kısaltabilir veya 24 dakikaya (L348F) uzatabilir CRY2'deki mutasyonlar yapılmıştır 46 . Alternatif olarak, fungal reseptör Vivid (VVD) ve p / nMagFast1 ve 2'ye dayanan mühendislikten üretilmiş fotoaktif hale getirilebilir protein çiftleri sırasıyla 4.2 dakika ve 25 saniye ayrışma yarılanma ömrü gösterir 47 . Bu protokolde, vahşi tip CRY2-CIBN protein çifti, ışık sti'sinin 5 dakika içinde MAPK yolağını açarMulation ve aktivite, memeli hücrelerinde 30 dakika içinde bazal seviyeye geri dönüyor Xenopus embriyolarında 44 ve 1-2 saat 35 . Uzaysal kontrol için, konfokal mikroskopi mavi lazeri, görüntü düzleminde yaklaşık 200 nm'lik bir kırılma-limit noktasının boyutuna odaklayabilir. Tutarlı olmayan bir ışık kaynağı ile donatılmış bir epi-aydınlatma mikroskopunda alan diyagramının boyutunu ayarlayarak, aydınlatma boyutunu çap olarak yaklaşık 10 μm ile sınırlamak mümkündür. Her iki yöntem de hücre kültürlerinde optogenetik stimülasyonun subselüler kontrolünü sağlayabilmelidir.
Optogenetics'in sinyal iletimini yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükle geri döndürerek sorgulama kabiliyeti, canlı hücrelerde dinamik hücre içi sinyallemeyi incelemek için tamamen yeni bir fırsat sunmaktadır. Bu protokolün sonuçları, Rafl aktivasyonunun PC'de nöronal farklılaşmanın indüklenmesinden sorumlu olduğunu ortaya koymuştur12 hücre 44 . Aynı yol, Xenopus embriyolarının gelişmesinde sekonder kuyruk benzeri yapıların oluşumuna da neden olur. Raf1 aktivasyonunun zamanlamasını kontrol ederek kuyruk benzeri yapı, germ tabakası oluşumu 35 aşamasından sonra indüklenebilir. Yakın zamanda tanımlanan LOVTRAP yöntemi, ilgilenilen bir proteinin (POI) 48'in ışığa bağlı dissosiyasyonunu modüle etmek için karanlıkta birbirlerine seçici olarak bağlanan iki mühendislik ürünü olan Zdark ve LOV2'yi kullanır. Bu yaklaşımda kullanılan hafif aracılı protein-protein birleşmesinin aksine, LOVTRAP protein ayrışmasını başlatmak için ışığı kullanır. Bu yeni yöntem canlı hücrelerde protein lokalizasyonu ve aktivitesini modüle etmede daha esnektir. Sinyalizasyon kaskadındaki aktivasyon modunu dikkatle seçerek, sinyal iletimini alışılmadık şekillerde incelemek mümkündür. Örneğin, reseptör tirozin kinazları lLigand-reseptör bağlanmasına 49 veya ligandın uyandırdığı sinyal dizileri 44'ün bir alt kümesini indüklemeye yöneliktir. Burada bildirilen strateji Akt 39 ve GTPazlar ( örn., Rho GTPase) gibi diğer kinazları kontrol etmek üzere genelleştirilebilir ve aktivasyon durumları protein translokasyonu ile de açılabilir. Optogenetics, Drosophila 50 , zebrafish 51 , 52 , 53 , 54 ve Xenopus embriyolarında protein lokalizasyonu ve sinyalizasyonunun optogenetik kontrolü ile ilgili son çalışmalarla gösterildiği gibi canlı çok hücreli organizmalara uygulanmaya devam edecektir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Urbana-Champaign'deki Illinois Üniversitesi (UIUC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIGMS R01GM111816) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | VWR | 48393 230 | Substrate for live cell imaging |
| Coverslip holder | Newcomer Supply | 6817B | Holder for coverslips |
| Detergent | ThermoFisher | 16 000 104 | For cleaning coverslips |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | For making PLL buffer |
| Disodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 71996-250G | For making PLL buffer |
| Plastic beaker | Nalgene | 1201-1000 | For cleaning coverslips |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465-2.5KG | For adjust pH |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1274-500MG | For coating coverslip |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water | ThermoFisher Scientific | 750024 | For DNA preparation |
| Cover Glass Forceps | Ted Pella | 5645 | Cover glass handling |
| Tissue cutlure dish | Thermofisher | 12565321 | Cell culture dish |
| Sterile centrifuge tubes | ThermoFisher | 12-565-271 | Buffer storage |
| Transfection Reagent | ThermoFisher | R0534 | Transfection |
| CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045088 | For live cell imaging |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Form make cell chamber |
| Plasmid Maxiprep kit | Qiagen | 12965 | Plasmid preparation |
| DMEM medium | ThermoFisher | 11965-084 | Cell culturing medium component |
| F12K medium | ThermoFisher | 21127022 | Cell culturing medium component |
| Horse serum | ThermoFisher | 16050122 | Cell culturing medium component |
| Fetal Bovine Serum | Signa-Aldrich | 12303C-500 mL | Cell culturing medium component |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | Cell culturing medium component |
| Trypsin (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 15050065 | For mammalian cell dissociation |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | For DNA preparation |
| Ficoll PM400 | GE Heathcare Life Sciences | 17-5442-02 | For embryo buffer |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 1.02839.0025 | Oocyte preparation |
| ApaI | ThermoFisher | FD1414 | For linearization of plasmids |
| Dnase I | ThermoFisher | AM2222 | For removing DNA template in the in vitro transcription assay |
| Index-match materials (immersion oil) | Thorlabs | MOIL-20LN | For matching the index between sample substrate and objective |
| Blue LED | Adafruit | 301 | Light source for optogenetic stimulation |
| Resistor kit | Amazon | EPC-103 | current-limiting resistor |
| Aluminum boxes | BUD Industries | AC-401 | light box |
| BreadBoard | Jekewin | 837654333686 | For making LED array |
| Hook up Wire | Electronix Express | 27WK22SLD25 | For making LED array |
| Relay Module | Jbtek | SRD-05VDC-SL-C | For intermittent light control |
| DC Power Supply | TMS | DCPowerSupply-LW-(PS-305D) | Power supply for LED |
| Silicon Power Head | Thorlabs | S121C | For light intensity measurement |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | For light intensity measurement |
| Microscope | Leica Biosystems | DMI8 | For live cell imaging |
| BioSafety Cabinet | ThermoFisher | 1300 Series A2 | For mammalian cell handling |
| CO2 incubator | ThermoFisher | Isotemp | For mammalian cell culturing |
| Stereo microscope | Leica | M60 | For embryo micro-manipulation |
| Microinjector | Narishige | IM300 | For embryo microinjection |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P87 | Needle puller |
| in vitro transcription kit | ThermoFisher | AM1340 | For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column |
| RNA purfication kit | Qiagen | 74104 | Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA |
| Convection oven | MTI corporation | EQ-DHG-9015 | PDMS curing |
| Centrifugal mixer and teflon container | THINKY | AR310 | For mixing PDMS |
| Silicon wafer | UniversityWafer | 452 | Base for making PDMS devices |
| Blade | Techni Edge | 01-801 | For cutting PDMS |
| Capillary glass | Sutter Instruments | BF100-58-10 | For fabrication of injecting needles. |
References
- Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
- Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
- Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
- Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
- Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
- Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
- Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
- Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
- Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Hunter, T. Signaling--2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
- Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
- Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
- Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
- Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
- Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
- Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
- Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
- Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
- Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
- Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
- Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
- Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochemistry. 50 (1), 4-16 (2011).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
- Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
- Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
- Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
- Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
- Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
- Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V.
- Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
- Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
- Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
- Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C.
- Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).
