Summary
Questo protocollo descrive una strategia optogenetica per modulare l'attivazione della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK) durante la differenziazione cellulare e lo sviluppo embrionale di Xenopus . Questo metodo consente l'attivazione reversibile del percorso di segnalazione MAPK nella coltura di cellule di mammiferi e negli organismi vivi multicellulari, come gli embrioni di Xenopus , con elevata risoluzione spaziale e temporale.
Abstract
L'attività cinasi è fondamentale per una pletora di funzioni cellulari, tra cui la proliferazione cellulare, la differenziazione, la migrazione e l'apoptosi. Durante il primo sviluppo embrionale, l'attività della chinasi è altamente dinamica e diffusa nell'embrione. Gli approcci farmacologici e genetici sono comunemente usati per sondare le attività di chinasi. Purtroppo, è difficile raggiungere una risoluzione spaziale e temporale superiore utilizzando queste strategie. Inoltre, non è possibile controllare l'attività cinasi in modo reversibile in cellule vive e organismi multicellulari. Tale limitazione rimane un collo di bottiglia per ottenere una comprensione quantitativa dell'attività cinasi durante lo sviluppo e la differenziazione. Questo lavoro presenta una strategia optogenetica che sfrutta un sistema bicistronic contenente proteine fotoattivatabili Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) e il dominio N-terminale di citochrome-interazione di base elica-loop-elica (CIBN). ReversiL'attivazione del percorso di segnalazione della proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK) è ottenuta attraverso la traslocazione proteica mediata dalla luce in cellule vive. Questo approccio può essere applicato alle colture di cellule di mammiferi e agli embrioni di vertebrati vivi. Questo sistema bicistronic può essere generalizzato per controllare l'attività di altre chinasi con meccanismi di attivazione similari e può essere applicata ad altri sistemi di modello.
Introduction
I fattori di crescita sono coinvolti in un ampio spettro di funzioni cellulari, tra cui la proliferazione, la differenziazione, la migrazione e l'apoptosi e svolgono ruoli chiave in molti eventi biologici, inclusi lo sviluppo embrionale, l'invecchiamento e la regolazione dello stato mentale 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Molti fattori di crescita segnano attraverso complesse cascate intracellulari di segnalazione. Questi eventi di segnalazione sono spesso gestiti da fosforilazione proteica reversibile in modo preciso regolato 6 , 7 . Pertanto, una comprensione dei risultati di segnalazione delle proteine chinasi, che sono responsabili della fosforilazione proteica, è fondamentalmente importante.
Diversi fattori di crescita agiscono attraverso una rete di segnalazione intracellulare piuttosto comune, anche se stimolano distRisposte cellulari inct 8 , 9 . I mediatori intracellulari comuni delle chinasi di tirosinici del recettore includono Ras, Raf, chinasi extracellulare-regolata (ERK), proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK) / ERK chinasi (MEK), fosfoinositide 3-chinasi (PI3K), Akt e gamma fosfolipasi C (PLCγ) 10 , 11 . L'accumulo di prove suggerisce che la diversità di segnalazione e la specificità dipendono dalla regolazione spaziale e temporale dell'attività di segnalazione 12 . Ad esempio, nelle cellule di phaocromocytoma di ratto (PC12), la stimolazione del fattore di crescita epidermico (EGF), che provoca la proliferazione cellulare, attiva temporaneamente il percorso ERK 9 . D'altra parte, la stimolazione con il fattore di crescita del nervo (NGF), che porta alla differenziazione cellulare, attiva il percorso ERK in modo sostenibile 9 , 13 . In colture rNei neuroni ippocampali, la segnalazione transitoria da un fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) favorisce la crescita primaria del neurite, mentre la segnalazione sostenuta porta ad una maggiore ramificazione del neurite 14 . Durante il primo sviluppo embrionale, l'attività ERK fosforilata è temporaneamente dinamica e diffusa nell'embrione 6 . Una recente schermata genetica durante l'embriogenesi iniziale di Xenopus ha mostrato che le cascate di segnalazione ERK e Akt, due percorsi di fattore di crescita primario a valle, mostrano i profili di attivazione specifici di fase 7 . Così, una comprensione dei risultati di segnalazione di chinasi richiede strumenti che possono sondare le caratteristiche spaziali e temporali dell'attività cinasi con una risoluzione sufficiente.
Approcci sperimentali convenzionali per sondare la natura dinamica della trasduzione del segnale durante lo sviluppo non hanno la desiderabile risoluzione spaziale e temporale. Ad esempio, gli approcci farmacologici utilizzano la piccola chemMolecole ical o biologiche per stimolare o sopprimere la trasduzione del segnale nelle cellule e nei tessuti. La natura diffusa di queste piccole molecole rende difficile limitare la loro azione ad una regione specifica di interesse. Gli approcci genetici ( ad esempio, transgenesi, il sistema Cre-Lox o mutagenesi) spesso portano all'attivazione o alla repressione irreversibili dell'espressione genica o dell'attività proteica 16 , 17 , 18 . Il sistema Tet-On / Tet-Off 19 offre un controllo temporale migliorato della trascrizione del gene, ma manca di un controllo spaziale rigoroso perché si basa sulla diffusione della tetraciclina. I recenti sviluppi nella dimerizzazione delle proteine chimicamente indotti dalla chimica 20 o nella foto-scoperta 21 , 22 , 23 , 24 hanno notevolmente miglioramentiEd il controllo temporale delle reti di segnalazione. Il controllo spaziale, tuttavia, rimane impegnativo a causa della diffusione dei prodotti chimici in gabbia.
Recenti approcci optogenetici emergenti, che sfruttano il potere di luce per controllare le interazioni proteine-proteine, consentono la modulazione di percorsi di segnalazione con elevata precisione spatiotemporale e reversibilità. Poco dopo il suo successo iniziale nel controllo del cervello neuronale 25 , 26 , 27 , l'ottogenetica è stata estesa per controllare altri processi cellulari, come la trascrizione di geni, la traduzione, la migrazione cellulare, la differenziazione e l'apoptosi 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Una strategia che utilizza il pProteina hotoattivatabile La proteina cripto- cromica 2 (CRY2) di Arabidopsis thaliana e il dominio N-terminale dell'elica a base di elicoidale (CIBN) che interagiscono con citochrome è stato recentemente sviluppato per controllare l'attività di Raf1-chinasi nelle cellule di mammiferi e negli embrioni Xenopus 35 . CRY2 si lega a CIBN su stimolazione azzurra-luce e il complesso proteico CRY2 / CIBN dissociata spontaneamente nel buio 34 . La luce blu eccita il cofattore CRY2, il dinucleotide di flavin adenina (FAD), che porta ad un cambiamento conformazionale in CRY2 e successivamente legato a CIBN. I mutanti costituenti attivamente attivi (W374A) e flavin-deficienti (D387A) di CRY2 possono essere prodotti attraverso mutazioni nella tasca di legame FAD: il mutante CRY2 W374A si lega a CIBN indipendente dalla luce, mentre il mutante CRY2 D387A non si lega a CIBN sotto l'azzurro Stimolazione luminosa 36 , 37 . Il sistema ottogenetico descritto iN questo protocollo utilizza il tipo di wild-type CRY2 e CIBN per indurre l'attivazione Raf1 mediata dalla traslocazione proteica in cellule vive. È noto che il reclutamento della membrana di Raf1 aumenta la sua attività 38 . In questo sistema, un modulo CIBN tandem è ancorato alla membrana plasmatica e CRY2-mCherry è fuso al terminale N di Raf1 35 . In assenza di luce blu, CRY2-mCherry-Raf1 rimane nel citoplasma, e Raf1 è inattivo. La stimolazione della luce blu induce il legame CRY2-CIBN e recluta Raf1 alla membrana plasmatica, in cui viene attivata Raf1. L'attivazione Raf stimola una cascata di segnalazione Raf / MEK / ERK. Entrambe le proteine di fusione CRY2 e CIBN sono codificate in un sistema genetico bicistronico. Questa strategia può essere generalizzata per controllare altre chinasi, come Akt, il cui stato di attivazione può essere attivato anche dalla traslocazione proteica nelle cellule 39 . Questo lavoro presenta protocolli dettagliati per l'implementazione di questa strategia optogenetica in cultu cellule di mammiferiRes e organismi multicellulari.
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Protocol
La ricerca sugli animali è stata condotta in conformità con le linee guida stabilite dall'Istituto per l'Assicurazione e l'Utilizzazione degli Animali Istituzionali (IACUC) e dall'Università dell'Illinois Dipartimento di Risorse Animali (DAR).
1. Induzione ottogenetica della localizzazione della proteina nella cultura cellulare delle cellule BHK21
NOTA: i passaggi 1.1-1.3 forniscono un metodo per assemblare una camera di coltura cellulare per l'imaging con obiettivi di ingrandimento elevato ( ad es., 63X o 100X), che presentano tipicamente brevi distanze di lavoro. Questi obiettivi richiedono una copertura in vetro sottile ( ad esempio, spessore 1,5 mm, 170 μm) come substrato di imaging. In alternativa, può essere utilizzato un piatto / diapositiva di coltura a cellule in vetro. In questo caso, i passi 1.1-1.3 possono essere ignorati.
- Pulizia dei vetri in vetro
- Posizionare 30 coperchio di vetro in un supporto per copertina.
- In un bicchiere di plastica da 600 ml, aggiungere 20 g di detersivo e 400 ml di acqua calda del rubinetto. PlacIl bicchiere su un agitatore magnetico e mescolare fino a quando tutto il detergente è sciolto. Rimuovere la schiuma usando carta tissue.
- Utilizzare il fondo di un piatto di Petri di 100 mm x 15 mm come distanziatore dalla barra di stirata e come superficie per il supporto del coperchio. Per mantenere un adeguato flusso durante il processo di pulizia, fare 3-4 fori di drenaggio nel piatto Petri.
- Per fare i fori di drenaggio, scaldare un ferro saldato e bruciare la plastica in un cappuccio ventilato.
ATTENZIONE: non toccare il ferro saldato riscaldato con le mani nude. - Posizionare il portacoperta sul piatto Petri nel bicchiere. Mescolare per 2 ore fino a notte a temperatura ambiente.
- Lavare tre volte con 500 ml di acqua DI in un becher da 1.000 ml. La soluzione detergente può essere riutilizzata.
- Raccogli le copertine individuali usando le pinze. Immergere le copertine in etanolo a prova di 190% (95%) per 1 minuto.
- Asciugare le copertine all'interno di un cappuccio sterile. Conservare le copertine in un contenitore di plastica sterile fino all'uso.
- Realizzazione di coperchi rivestiti in poli-L-lisina (PLL)
- Creare un tampone di borato di 0,1 M sciogliendo 1,24 g di acido borico e 1,9 g di tetraborato di sodio in 400 ml di acqua. Regolare il pH a 8,5 con 10 M NaOH.
- Sciogliere PLL nel tampone di borato fino ad una concentrazione finale di 1 mg / mL. Aliquot la soluzione PLL in tubi sterilizzatori sterili da 50 ml.
- Aggiungere 50 ml di soluzione di rivestimento PLL a un piatto da 10 cm di coltura tissutale. Posizionare il piatto in un incubatore a 37 ° C per riscaldare la soluzione PLL.
- Aprire il contenitore del coperchio (passo 1.1.8) in un cappuccio sterile.
- Immersione dei coperchi puliti uno alla volta nella soluzione PLL pre-riscaldata nel piatto di coltura tissutale. Evitare la formazione di bolle per immergere tutte le superfici.
- Posizionare il piatto con la copertura in un incubatore di CO 2 a 37 ° C durante la notte. Togliere ogni coperchio e collocarlo in un portacandele sterile. Sciacquare tre volte con acqua ultrapure autoclavata (18,2 MΩ & #183; cm resistivity) in un becher da 1000 ml in un cappuccio sterile.
- Asciugare le copertine nel supporto del coperchio nel cappuccio sterile. Conservare le copertine in un contenitore di plastica sterile fino all'uso.
- Assemblaggio di camere di coltura cellulare polidimetilsilossano (PDMS)
- In un contenitore di plastica, pesare 40 g di base di PDMS e aggiungere 4 g di agente di tintura per ottenere un rapporto 10: 1 w / w di PDMS e agente di tintura. Mescolare l'agente PDMS / agente mescolando con una punta pipetta per 2 min. In alternativa, utilizzare un miscelatore centrifugo.
- Utilizzare un bicchiere con un diametro di 4 pollici come modello per realizzare un supporto con un foglio di alluminio. Posizionare il supporto di alluminio in un piatto di Petri da 15 cm. Posizionare un wafer di silicio da 4 pollici all'interno di questo portafoto in alluminio.
- Versare la soluzione mista PDMS nel supporto. Utilizzare una barra di vetro sottile per toccare delicatamente il bordo della wafer. Rimuovere tutte le bolle d'aria intrappolate sotto il wafer.
- Inserire il piatto di Petri da 15 cm in un camino a vuotoR per degas la soluzione PDMS. Continuare a degassare per circa 20 minuti, finché non si generano bolle. Nel frattempo, preriscaldare un forno a convezione a 65 ° C.
- Posizionare con cura il piatto di Petri da 15 cm nel forno. Incubare per 2 ore.
- Rimuovere la piastra dal forno. Utilizzare una barra di vetro per toccare delicatamente il bordo del PDMS e assicurare un collegamento reticolato completo. In caso contrario, incubare più a lungo, finché il PDMS non è solido e non appiccicoso.
- Rimuovere il foglio di alluminio dalla piastra e scollegarlo dal wafer di silicio. A partire dal bordo, scorri attentamente il PDMS curato dal wafer di silicio.
ATTENZIONE: Evitare di applicare troppa forza, in quanto può rompere il wafer. - Tagliare il PDMS in pezzi rettangolari da 20 mm x 30 mm per montare il coperchio da 24 mm x 40 mm con una lama di rasoio.
- Utilizzare una lama a scalpello per tagliare un'apertura rettangolare di 10 mm x 20 mm dal centro di ogni pezzo PDMS.
- Pulire le camere PDMS utilizzando il protocollo detergente descritto nel punto 1.1.
- Asciugare le camere PDMS in un cappuccio pulito. Posizionare le camere asciutte in un contenitore autoclavabile ricoperto di foglio di alluminio.
- Autoclave il contenitore con gravità (121 ° C, 15 psi) per 30 minuti e conservare il contenitore a temperatura ambiente.
- Coltura e transfezione di cellule BHK21
- Preparare 500 mL di terreno per la coltura di cellule BHK21 mescolando 445 mL di DMEM con 50 mL di FBS e 5 mL di 100x Penn-Strep-Glutamine (10.000 U / mL penicillina, 10 mg / mL streptomicina e 29.2 mg / mL L -Glutammina). Assicurarsi che la concentrazione finale di FBS sia del 10%.
- Aliquot 10 ml di mezzo indipendente di CO 2 non HEPES per l'imaging a cellule vive.
NOTA: il supporto indipendente di CO 2 supporta la crescita cellulare senza un incubatore di CO 2 ed è ideale per le cellule di imaging in condizioni atmosferiche. Per informazioni dettagliate, fare riferimento all'elenco Materiali. Oltre alla linea cellulare BHK21, anche altri tipi di cellule di mammiferi dovrebbero dareRisultati simili. - Assemblare un dispositivo di coltura di cellule posizionando una camera di PDMS sterilizzata autoclavata (punto 1.3) su una copertura di copertura sterile PLL (fase 1.2) in un cappuccio sterile.
- Posizionare ogni dispositivo in un piatto di Petri sterile da 60 mm.
- Utilizzare 0,5 mL di 0,25% di trypsina per staccare le cellule da un pozzetto di una piastra di coltura di tessuti a 12 pozzetti. Conta la densità cellulare con un emocitometro. Piastra 20.000 cellule BHK21 nella camera (circa 10.000 cellule / cm 2 ) con 200 μL di terreno di coltura cellulare.
- Preparare il plasmide DNA con un kit di preparazione del plasmide (vedere l'elenco dei materiali).
NOTA: Il disegno e la funzionalità del CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX sono mostrati nella Figura 1A - 1B . - Ventiquattro (24) h dopo la placcatura cellulare, trasfettano le cellule con 50-100 ng di plasmide CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX, secondo il protocollo del produttore.
- Tre (3) ore dopo la trasfezione, cambiare la mFino a 200 μl di mezzo di coltura fresco (punto 1.4.1) e consentire alle cellule di recuperare durante la notte incubando la coltura in un incubatore di CO 2 a 37 ° C.
- Imaging a cellule vive a fluorescenza
- Accendere un computer, una sorgente luminosa, un microscopio e una fotocamera. Utilizzare un microscopio confocale a fluorescenza (dotato di un obiettivo di immersione a olio 100X) per il resto del protocollo.
NOTA: può anche essere utilizzato un microscopio in epifluorescenza invertito. - Sostituire il mezzo di coltura cellulare con 200 μL di mezzo indipendente dal CO 2 .
- Impostare il protocollo di acquisizione dati prima di posizionare le celle sul microscopio. Usare un canale FITC di eccitazione 488 nm per la stimolazione ottogenetica. Utilizzare il canale TRITC di eccitazione di 561 nm per individuare le cellule trasfettate e monitorare la localizzazione cellulare della proteina con etichetta mCherry.
- Impostare il guadagno dei canali FITC e TRITC rispettivamente come 120 e 200. Utilizzare un tempo di dimensione pixel di 2,21 e la dimensione di 512 x 512 pixel.
- Misurare la potenza della luce di 488 nm mettendo un misuratore di potenza vicino alla finestra obiettivo. Un potere totale di 2 μW (circa 10.000 W / cm 2 al fuoco) è sufficiente per indurre l'associazione CIBN-CRY2PHR.
- Impostare un'acquisizione timestamp con un intervallo di 5 s e un tempo totale di acquisizione di 2 min.
- Applicare il materiale corrispondente dell'indice (olio di immersione) sulla finestra obiettiva. Utilizzare la modalità di contrasto di fase per concentrarsi sulle celle sulla superficie del coperchio.
- Individuare una cella trasfettata sotto la luce di 561 nm spostando lo stadio del microscopio.
ATTENZIONE: Evitare di utilizzare la luce blu durante questo passaggio poiché attiverà l'associazione tra le proteine fotoattivatabili. - Una volta localizzata una cella trasfettata, avviare l'acquisizione di dati.
NOTA: Le cellule trasfettate con successo devono mostrare fluorescenza in entrambi i canali FITC (da 2CIBN-GFP-CaaX) e TRITC (da CRY2-mCherry-Raf1) ( Figura 1C-D - Registrare una serie di immagini timbrate in entrambi i canali FITC e TRITC ( Figura 1D ).
- Per sondare la disintegrazione spontanea del complesso proteico CRY2-CIBN, registrare un altro timestamp con il canale Txred da solo per 20 minuti, con un intervallo di 30 s.
- Salvare l'immagine stampata in tempo per l'analisi dei dati.
- Accendere un computer, una sorgente luminosa, un microscopio e una fotocamera. Utilizzare un microscopio confocale a fluorescenza (dotato di un obiettivo di immersione a olio 100X) per il resto del protocollo.
- Analisi delle immagini
- Aprire le immagini con un software di analisi delle immagini che può estrarre l'intensità da un'immagine 40 .
- Selezionare due istantanee rappresentative: una prima dell'esposizione azzurra e l'altra esposizione post-blu-luce.
- Disegnare una linea attraverso la cella che attraversa lo sfondo, la membrana plasmatica e il citoplasma. Proietta l'intensità lungo questa linea. Salvare i valori e tracciarli per confrontare la differenza prima e dopo l'esposizione alla luce ( Figura 1D ).
- Per analizzare la cinetica dell'associazione proteica, selecUna regione rappresentativa di interesse (ROI) nella membrana plasmatica, un ROI nel citoplasma e un ROI in background.
- Acquisisci le intensità medie della membrana plasmatica (I PM ), il citoplasma (I CYT ) e lo sfondo (I BKD ) per lo stack di immagini.
- Calcolare il rapporto di intensità membrana / citosolica per ogni immagine utilizzando la seguente equazione:
- Trama il rapporto rispetto al tempo e determina la cinetica di legame o dissociazione di CRY2-CIBN ( Figura 1E- F ).
2. Costruzione di un array LED per la stimolazione luminosa a lungo termine in un incubatore di CO 2
NOTA: Lo schema generale della configurazione sperimentale è mostrato in Figura 2A .
- Effettuare l'array LED inserendo 12 LED blu in due barriereDs e resistenze limitanti di corrente di collegamento.
NOTA: con un alimentatore a 30 V, quattro LED possono essere collegati in serie e la loro luminosità può essere controllata da una resistenza di limitazione di corrente. - Posizionare i pannelli in una scatola di alluminio.
NOTA: L'altezza della scatola di alluminio dovrebbe essere di 2 pollici. Questa altezza è ottimale per illuminare una piastra di coltura dei tessuti a 12 pozzetti, poiché la dimensione del punto di luce divergente è la stessa di quella di un singolo pozzetto. - Usare due fili metallici per collegarsi all'alimentatore. Assicurarsi che la lunghezza del filo sia sufficiente quando la scatola luminosa è posta all'interno di un incubatore di CO 2 .
- Utilizzare un diffusore di luce trasparente come coperchio della scatola luminosa ( figura 2C ).
- Calibrare l'uscita di potenza di ciascun LED ad una gamma di ingressi di tensione. Utilizzare un potere di 0,2 mW / cm 2 per il saggio di differenziazione delle cellule PC12 a 24 ore. Utilizzate un potere di 5 mW / cm 2 per embrioni o esplosioni Xenopus dal vivosaggi.
3. Induzione ottogenetica della differenziazione cellulare PC12
- Coltura e transfezione cellulare
- Preparare 500 ml di mezzo per una coltura di cellule di phaocromocytoma di ratto (PC12) mescolando 407,5 ml di F12K con 75 ml di siero di cavallo + 12,5 ml di FBS + 5 ml di 100 × Penn-Strep-Glutamine (concentrazioni finali del siero di cavallo e FBS : Rispettivamente del 15% e del 2,5%). Realizzare un substrato a basso tenore di sangue mescolando 1 volume di mezzo completo in 99 volumi di media F12K.
- Piastre PC12 in una piastra a 12 pozzetti ad una densità di 300.000 cellule / pozzetto o 75.000 cellule / cm 2 .
- Trasfettare le cellule con CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX 24 ore dopo la placcatura cellulare (simile al passaggio 1.4.7). Utilizzare 1,2 μg di DNA per ogni pozzetto. Lasciare le cellule recuperare durante la notte in terreno di coltura in un incubatore a 37 ° C completato con 5% di CO 2 . Controllare l'efficienza della trasfezione 16 h dopo la trasfezione.
NOTA: una trasfezione 30-50% effSi dovrebbe ottenere un'accurata necessità per garantire un numero sufficiente di cellule. - Cambiare il mezzo medio a basso contenuto di siero 24 h dopo la trasfezione. Utilizzare 1 ml di media per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
- Differenziazione delle cellule PC12 indotta dalla luce
- Posizionare l'array LED in un incubatore CO 2 . Collegarlo all'alimentatore utilizzando un paio di fili. Impostare la potenza del LED a 0,2 mW / cm 2 . Posizionare la lastra a 12 pozzetti contenenti le cellule PC12 trasfettate (fase 3.1.3) sulla finestra dell'array LED. Applicare l'illuminazione continua della luce per 24 h in un incubatore a 37 ° C completato con 5% di CO 2 .
- Imaging di cellule vive in fluorescenza
- Seguire i punti 1.5.1-1.5.4 per il microscopio e la preparazione del campione.
- Impostare l'acquisizione di dati singola snapshot. Utilizza 200 ms per il canale GFP e Txred.
- Cattura immagini delle cellule trasfuse in entrambi i canali GFP e Txred. Registra circa 200 celLs per ogni condizione. Salvare i file per l'analisi dei dati.
- Analisi delle immagini
- Contare la percentuale di cellule differenziate sul numero totale di cellule trasfettate.
- Utilizzare qualsiasi modulo di conteggio delle celle nel software di analisi delle immagini per contare le celle.
- Contare manualmente le celle differenziate.
NOTA: le cellule differenziate sono definite come quelle in cui almeno un neurite è discernibilmente più lungo del corpo cellulare ( Figura 3A - 3B ). - Ripetere il passaggio 3.4.3 con le cellule indifferenziate.
- Calcola il rapporto di differenziazione utilizzando la seguente equazione:
4. Controllo ottogenetico dell'attività kinasi negli embrioni Xenopus
- Preparazione dei tamponi
- Preparare 1 L di 1x Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mMNaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 e 5 mM HEPES; PH 7,5.
- Preparazione di mRNA
- Digestare il DNA plasmidico CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX (2 μg) con 1 μl di ApaI (50 unità) a 37 ° C per 2 ore.
- Precipitare il DNA linearizzato in 60 μl di etanolo al 100%. Spinare a 12.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per pelletare il DNA. Rimuovere con cautela il surnatante e lavare il pellet con 60 μl di etanolo al 70%. Spin a 12.000 × g per altri 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet di DNA in 6 μl di H 2 O senza RNasi.
- Eseguire la trascrizione in vitro mediante incubazione di 1 μg di DNA linearizzato con 2 μl di polimerasi SP6 RNA in dotazione, una miscela ribonucleotide (10 mM ATP, CTP e UTP, 2 mM GTP e 8 mM cap analogo) e 20 μL di nucleasi nucleasi- Libera acqua a temperatura ambiente per 1 h.
- Rimuovere il DNA mediante digestione di DNasi I a 37 ° C per almeno 15 minuti e purificare l'RNA sintetizzato usando una colonna di spin di membrana di silice.
- Arrestare la reazione e precipitare l'RNA aggiungendo 30 μL di acqua priva di nucleasi e 30 μL di soluzione di precipitazione LiCl. Mescolare bene e raffreddare per 30 minuti a -20 ° C.
- Centrifugare a 4 ° C per 15 minuti a 12.000 × g per far pelliccare l'RNA.
- Rimuovere con cautela il surnatante. Lavare l'RNA una volta con 1 ml di etanolo al 70% e risospendere in 40 μL di acqua priva di nucleasi.
- Caricare 40 μL di RNA in una colonna di rotazione. Centrifugare a 4 ° C per 1 min a 12.000 × g per rimuovere i nucleotidi e le protezioni non incorporati.
- Harvest Xenopus embrioni
- Seguire il protocollo descritto da Sive et al. 41 per ottenere gli embrioni Xenopus .
- Microinjection di mRNA
- FabbricareGli aghi per la microinezione tirando i capillari di vetro con un tirante capillare. Impostare il programma di tiro su: calore = 355, forza di trazione = 80, velocità = 50 e tempo = 100.
- Rimuovere il cappotto di gelatina dagli embrioni trattandoli con 3% di cisteina (diluito in 0.2x MMR).
- Trasferire gli embrioni a 3% di polisolfuro e 0.5x di soluzione MMR per la microinezione. Iniettare 500 pg a 1 ng di CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA in ogni embrione.
NOTA: L'iniezione di una dose superiore a 1 ng produce un'attivazione indipendente dalla luce blu della segnalazione MAPK.
- Stimolazione ottogenetica dell'attività di chinasi
- Coltivare embrioni microinjected in 3% polysucrose, 0,5x soluzione MMR a temperatura ambiente fino a raggiungere la metà gastrula fase (fase 12). Quindi, coltivate gli embrioni in soluzione MMR 0,2 x.
- Trasferite gli embrioni o gli esplanti a una piastra a 12 pozzetti. Posizionare la piastra a 12 pozzetti sulla matrice LED a casa (passo 2.5) per il colore bluT (475 nm).
- Posizionare uno specchio sulla parte superiore della piastra a 12 pozzetti per assicurare un'illuminazione a pieno azzurro degli embrioni o delle esplosioni.
- Regolare la potenza della luce blu a 5 mW / cm 2 .
NOTA: Il trattamento con luce blu può essere eseguito in qualsiasi momento desiderato, sia in polisolfuro al 3%, in soluzione MMR da 0.5x, o in soluzione 0.2x MMR. - Raccogli gli embrioni in qualsiasi momento desiderato. Usalo per un'analisi istologica, Western blot o di espressione genica.
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Representative Results
Espressione ratiometrica di coppie di proteine fotoattivatabili: la figura 1A mostra la progettazione di un costrutto ottogenetico bicistronico, CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (denominato CRY2-2A-2CIBN), basato sulla teschovirum- 1 2A (P2A), che mostra la più alta efficacia di riduzione dei ribosomi tra le linee cellulari mammiferi 42 . Nel lavoro precedente, è stato stabilito che il rapporto ottimale per CIBN-GFP-CaaX: CRY2-mCherry-Raf1 è 2: 1 35 . Questa configurazione consente un sufficiente reclutamento e attivazione di membrana di CRY2-mCherry-Raf1 ( Figura 1B ). Le cellule singolarmente trasfettate con CRY2-2A-2CIBN mostrano una chiara fluorescenza sia nei canali fluorescenti GFP che Txred, sia sotto l'epi-illumination ( Figura 1C ) o microscopia confocale ( Figura 1D ). Membra blu mediata dalla luceIl reclutamento di CRY2-mCherry-Raf1 ( Figura 1D ) può essere chiaramente rilevato in microscopia confocale. L'associazione si verifica in pochi secondi dopo l'esposizione a luce blu ( Figura 1E ) e il complesso proteico CRY2-CIBN si dissociata con una dimensione media di circa 5,5 minuti ( Figura 1F ).
Differenza di cellule PC12 controllata dalla luce in assenza di fattore di crescita del nervo: un'intrigante osservazione nella segnalazione del fattore di crescita è che i percorsi di segnalazione a valle comuni ( es., ERK, PI3K-Akt e PLCγ) suscitano diversità e specificità nelle risposte di segnalazione. Una migliore comprensione della segnalazione mediata dal fattore di crescita può essere raggiunta grazie alla tecnologia che consente la precisa regolazione spaziale e temporale delle singole cascate. L'approccio ottogenetico introdotto in questo protocollo dimostra una tale tecnologia che consente l'attivazione specificaN del percorso di segnalazione Raf / MEK / ERK con alta risoluzione temporale. Poiché questo approccio supera il processo di legame dei NGF ai suoi recettori di membrana, la cinetica di segnalazione non dipende più dai recettori endogeni. Al contrario, il controllo cinetico preciso può essere ottenuto modulando il profilo temporale della luce stimolante ( Figura 2A ). Quindi, questo approccio apre nuove possibilità per studiare la cinetica di segnalazione dell'attività di chinasi. Inoltre, questa configurazione sperimentale fornisce un modo estremamente semplice ed economico per integrare l'approccio ottogenetico in studi di trasduzione del segnale intracellulare ( Figura 2B -2D ). Per il saggio di differenziazione delle cellule PC12, una stimolazione a luce continua a 24 ore con 0,2 mW / cm 2 è sufficiente a indurre una significativa crescita di neurite ( Figura 3A ). Controlli negativi, incluse le cellule trasfettate senza luce ( Figura 3B) e le cellule non trasfettate con o senza luce ( Figura 3C -3D ), non mostrano una significativa crescita del neurite. A questo potere, le cellule trasfettate con un Raf1 costitutivamente attivo (CA-Raf1) subiscono una differenziazione normale ( Figura 3E ). In particolare, le cellule trasfettate con il costrutto ottogenetico bicistronic producono un rapporto di differenziazione significativamente maggiore rispetto alle cellule co-trasfettate con due costrutti, raggiungendo il valore indotto da CA-Raf1 ( Figura 3F ). Il rapporto di differenziazione è calcolato dividendo il numero di cellule differenziate per il numero di cellule trasfettate guidate dalla fluorescenza GFP. Le cellule differenziate sono definite come quelle con almeno un neurite più lungo della dimensione del corpo cellulare 35 . Questo aumento nel rapporto di differenziazione deriva da: 1) una migliore distribuzione di proteine attivabili con il sistema bicistronic e 2) un opRapporto di espressione temporizzata tra CIBN e CRY2 35 .
La stimolazione ottogenetica reversibile del percorso di segnalazione Raf / MEK / ERK negli embrioni Xenopus laevis vivi: X. laevis è un organismo modello ben consolidato per lo studio della trascrizione del gene, della trasduzione del segnale e dello sviluppo embrionale. Precedenti lavori hanno scoperto che l'attivazione del percorso Raf / MEK / ERK porta ad un cambiamento di fato cellulare, con conseguente formazione di una struttura a forma di coda ectopica nello stadio di tailbud 43 . Come un potente induttore di mesoderm, Raf1 sovraespresso può indurre mesodermia ectopica durante la specifica del germe-strato, che si verifica durante le fasi di blastula e gastrula precoce e provoca la formazione di strutture ectopiche simili alla coda in seguito. In alternativa, il Raf1 overexpressato può innescare un evento di transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) dopo che è stata completata la specifica del germe-strato e può essere direttamenteTrasformare l'ectoderm in linee neurali e mesodermiche. Ciò è seguito dalla proliferazione e dall'estensione di queste strutture 43 . In questi esperimenti, gli RNA che codificano il recettore MET, Ras e Raf1 sono stati iniettati in embrioni a livello di due cellule. Poco dopo l'iniezione dell'RNA nell'embrione, il MET / Ras / Raf1 sovraespresso ha cominciato a attivare costantemente le cascate di segnalazione a valle. Pertanto, è stato tecnicamente impegnativo per superare le fasi iniziali di sviluppo e attivare Raf1 specificatamente dopo la specifica dello strato germinario. Era impossibile utilizzare una tale strategia per determinare se l'attivazione del segnale Raf / MEK / ERK dopo la specificazione del germe-strato indurrebbe un cambiamento di fato cellulare, portando alla formazione della struttura a forma di coda ectopica.
L'ottogenetica fornisce un meccanismo per controllare il timing dell'attività di Raf1. Quando l'RNA di CRY2-2A-2CIBN è stato iniettato in embrioni in fase iniziale dello sviluppoS, Raf1 rimase inattivo fino alla fornitura della luce blu. Il dosaggio del cappuccio animale è stato convenientemente utilizzato per caratterizzare il risultato di segnalazione, perché l'attività basale di ERK è bassa in capsule di animali. L'attivazione mediata dalla luce della cascata di segnalazione Raf / MEK / ERK ha indotto una significativa upregulation di xbra, un marcatore mesodermico, come determinato da RT-PCR ( Figura 4A ) o in ibridizzazione in situ in Figura 4B . I cambiamenti dinamici nella fosforilazione di ERK in risposta alla luce blu sono stati rilevati anche mediante analisi Western blot ( Figura 4C ). In tutti gli embrioni, una miscela di CRY2-2A-2CIBN e n-β-gal RNA è stata iniettata allo stadio a 8 cellule in uno dei blastomeri animali dorsali, che in seguito danno luogo a tessuti anteriori dorsali. Rispetto agli embrioni non trattati ( Figura 4D -4E ), quelli iniettati con CRY2-2A-2CIBN e trattati con luce blu perMed strutture ectopiche simili a coda ( Figura 4F -4G ). Gli embrioni iniettati nell'oscurità ( Figura 4H ) o iniettati sotto l'illuminazione azzurra ( Figura 4I ) non formano struttura a coda. L'illuminazione a luce blu dopo la specifica del germe-strato ha indotto importanti strutture di coda ( Figura 4J ).
Figura 1: Il meccanismo della localizzazione proteica indotta dalla luce e l'attivazione del percorso di segnalazione di chinasi. ( A ) Progettazione di un costrutto bicistronic, con un rapporto ottimizzato CIBN-CRY2 (2 CIBN: 1 CRY2) che consente l'attivazione della luce del percorso di segnalazione Raf / MEK / ERK chinasi. Dopo un salto ribosomico, un trascritto mRNA genera due proteine: CRY2-mCherry-Raf1-N2A (terminandoCon aminoacidi NPG) e proline-2CIBN-GFP-CaaX. ( B ) La legame indotta dalla luce tra CIBN e CRY2 porta al reclutamento di membrana di CRY2-mCherry-Raf1, che attiva il percorso di segnalazione Raf / MEK / ERK. ( C ) Immagini fluorescenti delle cellule BHK21 trasfettate con CRY2-2A-2CIBN sotto epi-illuminazione. Barra di scala: 20 μm. ( D ) Imaging di fluorescenza confocale delle cellule trasfettate con CRY2-2A-2CIBN. Il pannello sinistro mostra la cava 2CIBN-GFP-CaaX localizzata sulla membrana plasmatica; Il pannello centrale mostra un'istantanea di CRY2-mCherry-Raf1 prima della stimolazione blu-luce; Il pannello a destra mostra uno snapshot di CRY2-mCherry-Raf1 dopo 10 impulsi di stimolazione azzurra-luce. Il pannello inferiore mostra profili di intensità normalizzati lungo una linea tratteggiata gialla attraverso la cella, prima e dopo la stimolazione luminosa. Barra di scala = 20 μm. ( E - F ) Kinetica per l'associazione CRY2-CIBN indotta dalla luce ( E ) e dissociazione spontaneaN ( F ) del complesso proteico CRY2-CIBN al buio. La Figura 1A- B è stata adattata dal riferimento 35 , riprodotto con l'autorizzazione della Società dei Biologi. La Figura 1E -F è stata adattata dal riferimento 44 sotto la licenza Creative Commons Attribution (CC BY). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Progettazione e calibrazione della matrice LED a casa. ( A ) Schema della configurazione sperimentale per l'attività chinasi controllata dalla luce in cellule vive. ( B ) Scheda circuitale per la matrice LED a casa. ( C ) A ligHt che può essere utilizzato per stimolare la luce a lungo termine in un incubatore di CO 2 . L'altezza della scatola di alluminio è di 2 pollici ( D ) Potenza di uscita tipica del LED contro tensione. Valori di potenza luminosa per LED in un circuito in cui viene collegata in serie una resistenza di limitazione di corrente e quattro LED. La Figura 2A è stata adattata dal riferimento 35 , riprodotto con l'autorizzazione della Società dei Biologi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Induzione ottogenetica della differenziazione delle cellule PC12. ( A ) Snapshot multicanale di cellule PC12 trasfettate con CRY2-2A-2CIBN dopo 24 ore di stimolazione blu-luce (0,2 mW / cm 2 ). ACL'irchio segna una cella differenziata. Un quadrato segna una cella indifferenziata. ( B ) Come ( A ), ad eccezione di nessuna stimolazione azzurra-luce. ( C - D ) Cellule PC12 non transfettate sotto 24 ore di stimolazione azzurra-luce (0,2 mW / cm 2 ) ( C ) o incubazione scura ( D ). ( E ) Immagini rappresentative delle cellule trasfettate con Raf1-GFP-CaaX (CA-Raf1). Il cerchio e il rettangolo segnano rispettivamente le cellule differenziate e indifferenziate. ( F ) Rapporti di differenziazione delle cellule PC12 trasfettate con CA-Raf1, co-trasfettate con CRY2-mCherry-Raf1 e CIBN-GFP-CaaX e singolarmente trasfettate con CRY2-2A-2CIBN. 24 h dopo la trasfezione, le cellule sono state esposte alla luce o incubate nel buio per altri 24 h. I valori rappresentano la media ± SD da quattro set di dati indipendenti. Solo le cellule esposte alla luce blu hanno mostrato una differenziazione significativa. Figura 3FÈ stato adattato dal riferimento 35 , riprodotto con l'autorizzazione della Società dei Biologi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Induzione ottogenetica dell'attività chinasi negli embrioni Xenopus vivi. ( A ) risultati RT-PCR che mostrano che l'esposizione alla luce blu ha indotto l'espressione di xbra, marcatore pan-mesodermico, nei cappelli animati iniettati CRY2-2A-2CIBN nella fase iniziale della gastrula. ( B ) L'ibridazione in situ di xbra in tutti gli embrioni. L'attivazione indotta dalla luce dell'attività MAPK modula la distribuzione spaziale di xbra (frecce rosse nel pannello inferiore destro). Le frecce nere segnano β-ga nucleareLactosidase come tracciante di lineage. AP: polo animale. VP: pole vegetali. ( C ) Analisi Western blot che dimostra che, in un test di protezione animale, CRY2-2A-2CIBN ha indotto la fosforilazione reversibile della luce ERK di luce blu. ( D ) Immagini che mostrano la morfologia di embrioni normali, senza iniezione mRNA e senza trattamenti leggeri. ( E ) un'immagine ingrandita di un singolo embrione. ( F - G ) Immagini ingrandite e intere per embrioni iniettati con mRNA CRY2-2A-2CIBN e sottoposti a stimolazione azzurra. L'attivazione di Raf1 trattando embrioni iniettati CRY2-2A-2CIBN con luce blu induce strutture ectopiche simili alla coda nella regione testa. ( H - I ) Controlli negativi, compresi gli embrioni iniettati con CRY2-2A-2CIBN ma sotto incubazione scura ( H ) e embrioni non iniettati sotto stimolazione luminosa ( I ). Tutti gli esperimenti di stimolazione della luce sono stati condotti con un potere di 5 mW / cm <Sup> 2. ( J ) Analisi statistica della percentuale di embrioni che mostrano struttura epossidica simile a ogni condizione. Barra di scala = ( D ) e ( G ): 1 mm; ( E - F ) e ( H - I ) 0,5 mm. La Figura 4A , C , E - F e H - J sono stati adattati dal riferimento 35 , riprodotto con l'autorizzazione della Società dei Biologi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Quando si costruisce la scatola luminosa, è necessario misurare la potenza dei singoli LED. Sulla base dell'esperienza precedente, l'uscita di potenza può variare tra i singoli LED a causa della varianza di produzione. Selezionare un gruppo di LED che hanno una potenza entro il 10% dell'altro. Il numero di LED, la resistenza di limitazione corrente e l'ingresso di potenza possono essere modificati per diversi tipi di contenitori per la coltura cellulare ( ad esempio, una piastra a 6 oa un pozzetto a 24 pozzetti). Una 24 ore di illuminazione leggera ad una potenza di 0,2 mW / cm 2 non induce fototossicità rilevabile 44 . Se si utilizza una potenza superiore, considerare la luce intermittente per ridurre la produzione di calore e la fototossicità. Il sistema ottogenetico introdotto in questo protocollo induce la crescita di neurite nelle cellule PC12 in stimolazione luminosa intermittente paragonabile a quella della stimolazione continua della luce, dato che l'intervallo scuro tra i due impulsi luminosi adiacenti è inferiore a 45 min 44 . DovutoAlle differenze intrinseche della cinetica dell'associazione e della dissociazione di proteine, la durata tra gli impulsi luminosi deve essere sintonizzata per ogni coppia di proteine univoche. L'overepressione di Raf1 citosolica non provoca differenziazione cellulare PC12 senza illuminazione azzurra. Controllando la quantità di mRNA iniettata in ogni embrione, non si sono osservati fenotipi embrionali significativi al buio.
Sebbene una luce blu abbastanza potente sia sufficiente a stimolare l'associazione di proteine di fusione CRY2 e CIBN, la scarsa profondità di penetrazione della luce blu limita il suo utilizzo nella stimolazione tissutale profonda. Anche se tale stimolazione è stata ottenuta fornendo luce attraverso altri dispositivi ( ad esempio, fibra ottica), gli approcci sono invasivi 45 . Questo problema può essere affrontato in due modi: utilizzando una coppia di proteine che risponde a lunghezze d'onda più lunghe ( ad esempio, la coppia di proteine fitochrome-PIF6) o utilizzando l'eccitazione a due fotoni. Entrambi gli approcci possono offrire il deepeR penetrazione, ma potrebbero subire altre limitazioni. Ad esempio, la coppia PhyB-PIF6 richiede un cofattore sintetico da funzionare e la microscopia a due fotoni richiede una strumentazione costosa. La mancanza di sintonia nell'interazione CRY2-CIBN è un'altra limitazione da considerare. Il wild-type CRY2 dissociata spontaneamente da CIBN con una metà di 5,5 minuti nel buio 34 . A seconda della cinetica del percorso di segnalazione bersaglio, può essere preferibile una riduzione o una prolungata emivita di dissociazione. Sono state fatte mutazioni in CRY2 che possono abbreviare l'emivita di dissociazione a 2,5 min (W349R) o prolungare fino a 24 min (L348F) 46 . In alternativa, le coppie proteine fotopolimerizzabili progettate basate sul recettore fungo Vivid (VVD) e p / nMagFast1 e 2 mostrano una durata di dissociazione di 4.2 min e 25 s rispettivamente 47 . In questo protocollo, la coppia di proteine CRY2-CIBN di tipo selvatico attiva il percorso MAPK entro 5 minuti di luce stiMulation, e l'attività decade di nuovo al livello basale entro 30 minuti nelle cellule di mammiferi 44 e 1-2 h negli embrioni di Xenopus 35 . Per il controllo spaziale, la microscopia confocale può mettere a fuoco il laser blu alla dimensione di un punto di diffrazione-limite di circa 200 nm nel piano di immagine. Regolando la dimensione dello schema a campo in un microscopio epi illuminato dotato di una sorgente luminosa non coerente, è possibile limitare la dimensione di illuminazione a circa 10 μm di diametro. Entrambi i metodi dovrebbero essere in grado di ottenere il controllo subcellulare della stimolazione ottogenetica nelle colture cellulari.
La capacità dell'ottogenetica di interrogare reversibilmente la trasduzione del segnale con elevata risoluzione spaziale e temporale offre un'opportunità completamente nuova per studiare la segnalazione intracellulare dinamica in cellule vive. I risultati di questo protocollo hanno rivelato che l'attivazione di Raf1 è principalmente responsabile dell'induzione della differenziazione neuronale nel PC12 cellule 44 . Lo stesso percorso provoca anche la formazione di strutture secondarie simili a coda nello sviluppo di embrioni di Xenopus . Controllando la temporizzazione dell'attivazione Raf1, la struttura a coda può essere indotta dopo la fase di formazione del germe-strato 35 . Il metodo LOVTRAP descritto di recente utilizza due proteine progettate, Zdark e LOV2, che si legano selettivamente l'un l'altro solo al buio per modulare la dissociazione indotta dalla luce di una proteina di interesse (POI) 48 . A differenza dell'associazione proteina-proteina mediata dalla luce, utilizzata in questo approccio, LOVTRAP utilizza la luce per indurre la dissociazione proteica. Questa nuova modalità è più flessibile nella modulazione della localizzazione proteica e dell'attività in cellule vive. Attentamente selezionando la modalità di attivazione all'interno di una cascata di segnalazione, è possibile disseccare la trasduzione del segnale in modi non convenzionali. Ad esempio, è possibile attivare le tirosin-chinasi recettori senza lIgand-receptor 49 o per indurre un sottoinsieme di cascate di segnalazione generate dal legame 44 . La strategia riportata qui può essere generalizzata per controllare altre chinasi, come Akt 39 e GTPases ( ad es., Rho GTPase), i cui stati di attivazione possono anche essere accesi mediante la traslocazione della proteina. L'ottogenetica continuerà ad essere applicata agli organismi multicellulari in tensione, come dimostrato dalle recenti opere che caratterizzano il controllo ottogenetico della localizzazione e della segnalazione proteica in Drosophila 50 , zebrafish 51 , 52 , 53 , 54 e Xenopus 35 .
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Università dell'Illinois a Urbana-Champaign (UIUC) e dagli Istituti Nazionali di Salute (NIGMS R01GM111816).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | VWR | 48393 230 | Substrate for live cell imaging |
| Coverslip holder | Newcomer Supply | 6817B | Holder for coverslips |
| Detergent | ThermoFisher | 16 000 104 | For cleaning coverslips |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | For making PLL buffer |
| Disodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 71996-250G | For making PLL buffer |
| Plastic beaker | Nalgene | 1201-1000 | For cleaning coverslips |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465-2.5KG | For adjust pH |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1274-500MG | For coating coverslip |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water | ThermoFisher Scientific | 750024 | For DNA preparation |
| Cover Glass Forceps | Ted Pella | 5645 | Cover glass handling |
| Tissue cutlure dish | Thermofisher | 12565321 | Cell culture dish |
| Sterile centrifuge tubes | ThermoFisher | 12-565-271 | Buffer storage |
| Transfection Reagent | ThermoFisher | R0534 | Transfection |
| CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045088 | For live cell imaging |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Form make cell chamber |
| Plasmid Maxiprep kit | Qiagen | 12965 | Plasmid preparation |
| DMEM medium | ThermoFisher | 11965-084 | Cell culturing medium component |
| F12K medium | ThermoFisher | 21127022 | Cell culturing medium component |
| Horse serum | ThermoFisher | 16050122 | Cell culturing medium component |
| Fetal Bovine Serum | Signa-Aldrich | 12303C-500 mL | Cell culturing medium component |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | Cell culturing medium component |
| Trypsin (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 15050065 | For mammalian cell dissociation |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | For DNA preparation |
| Ficoll PM400 | GE Heathcare Life Sciences | 17-5442-02 | For embryo buffer |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 1.02839.0025 | Oocyte preparation |
| ApaI | ThermoFisher | FD1414 | For linearization of plasmids |
| Dnase I | ThermoFisher | AM2222 | For removing DNA template in the in vitro transcription assay |
| Index-match materials (immersion oil) | Thorlabs | MOIL-20LN | For matching the index between sample substrate and objective |
| Blue LED | Adafruit | 301 | Light source for optogenetic stimulation |
| Resistor kit | Amazon | EPC-103 | current-limiting resistor |
| Aluminum boxes | BUD Industries | AC-401 | light box |
| BreadBoard | Jekewin | 837654333686 | For making LED array |
| Hook up Wire | Electronix Express | 27WK22SLD25 | For making LED array |
| Relay Module | Jbtek | SRD-05VDC-SL-C | For intermittent light control |
| DC Power Supply | TMS | DCPowerSupply-LW-(PS-305D) | Power supply for LED |
| Silicon Power Head | Thorlabs | S121C | For light intensity measurement |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | For light intensity measurement |
| Microscope | Leica Biosystems | DMI8 | For live cell imaging |
| BioSafety Cabinet | ThermoFisher | 1300 Series A2 | For mammalian cell handling |
| CO2 incubator | ThermoFisher | Isotemp | For mammalian cell culturing |
| Stereo microscope | Leica | M60 | For embryo micro-manipulation |
| Microinjector | Narishige | IM300 | For embryo microinjection |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P87 | Needle puller |
| in vitro transcription kit | ThermoFisher | AM1340 | For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column |
| RNA purfication kit | Qiagen | 74104 | Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA |
| Convection oven | MTI corporation | EQ-DHG-9015 | PDMS curing |
| Centrifugal mixer and teflon container | THINKY | AR310 | For mixing PDMS |
| Silicon wafer | UniversityWafer | 452 | Base for making PDMS devices |
| Blade | Techni Edge | 01-801 | For cutting PDMS |
| Capillary glass | Sutter Instruments | BF100-58-10 | For fabrication of injecting needles. |
References
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