Summary
우리는 끄 덕의 부분 hepatectomy (PHx) 및 비장을 통해 세포 이식 수행을 위한 프로토콜을 설명 했습니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 쥐. 이 프로토콜에서 절 개 노출 하 고 셀의 intrasplenic 이식에 대 한 또 다른 절 개에 의해 따라 간 좌 엽 resect 이루어집니다.
Abstract
부분 hepatectomy 간 재생 및 다양 한 병 적인 조건에서 세포 기반 치료제의 효과 공부 하는 다양 하 고 재현할 수 방법입니다. 또한 부분 hepatectomy에 간 쪽으로 가속 neovascularization 및 셀에 의해 증가 engraftment와 이식된 세포의 증식 촉진 한다. 여기, 우리 immunodeficient 끄 덕을 결합 하 여 비만 아닌 당뇨병/심한의 비장에 30 %hepatectomy 이식 세포의 수행에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 마우스.
이 절차에서는 두 개의 작은 절 개 만들어집니다. 첫 번째 절 개 노출 하 고, 간 좌 엽을 resect 하는 것입니다 그리고 또 다른 작은 절 개 비장 세포의 intrasplenic 이식에 대 한 폭로 이루어집니다. 이 절차는 어떤 전문된 외과 기술이 필요 하지 않습니다 그리고 그것은 5-7 분 더 적은 스트레스와 고통, 빠른 복구, 및 더 나은 생존에에서 완료 될 수 있다. 우리 마우스 (유전자 변형 C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), 뿐만 아니라 부분적으로 hepatectomized 끄 덕에에서 인간의 기원 (NeoHep)의 세포 처럼 hepatocyte 표현 녹색 형광 단백질 (GFP)에서 절연 hepatocytes의 이식 설명 했다. SCID 쥐입니다.
Introduction
현재, hepatocyte 이식 데 심한 간 장애 환자 치료에 대 한 전체 장기 이식의 대 안으로 제시 된다. 그것은 전체 장기 이식1환자 다리 수 믿 었 다. Allogenic hepatocytes2뿐만 아니라 xenogenic hepatocytes3 및 줄기 세포4 에서 파생 된 hepatocytes는 또한 되 고 조사 동물 모델에서. 이 컨텍스트, 추적 및 engraftment 받는 사람에서 이식된 세포의 잠재력 급성 간장 장애 (AHF)에 따라 셀 치료에 대 한 중요 한 기준입니다.
조사 hepatocytes 또는 hepatocyte 같은 셀5의 이식, AHF 수술6 또는 약리학7 절차, 뒤에 세포 이식 동물 모델에서 만들어집니다. 약리학 적인 시 약, 많은 hepatotoxins d galactosamine8, 아 세트 아미노 펜9, 사염화 탄소10, thioacetamide11, Concanavalin A12, lipopolysaccharide13 AHF 동물 모델을 , 등., 사용 되었습니다. 이 목록에서 모든 시 약 AHF, 독특한 기능 집합이 생성 하지만 불행히도 아무 단일 시 약 인간의 AHF 모방. 또한, hepatotoxins에 의해 유도 된 AHF는 시간이 오래 걸립니다, 만성 스트레스는 동물을 박 았, 그리고 재현성 결과 얻기 어렵다.
다른 한편으로, 부분 hepatectomy (PHx)의 수술은 기술 종속, 고 재현성 결과 필요한 능력 개발 후 얻을 쉽습니다. 혼자 외 과적으로 AHF을 유도, 간 70% 이상의 절제가 필요; 그러나, 70 %hepatectomy 여전히 engraftment의 확산을 공부 하 고 이용 될 수 있다 보다는 더 적은 셀 간 손상14동안 그들의 치료 용량을 분석 하기 위한 간 이식. Hepatocytes의 이식 복15, 꼬리 정 맥16,17간 정 맥 또는 비장18통해 수행된 게시물 hepatectomy 되었습니다. 현재, 간 정 맥 주입 및 hepatocytes의 intrasplenic 이식으로 재현 하기 쉬운 기본 절차입니다.
이 문서에 우리는 30% 부분 hepatectomy 끄 덕에 대 한 절차를 설명 했습니다. SCID (끄 덕 임. CB17-Prkdcscid/J) 마우스의 왼쪽된 엽 excised입니다. 그것은 이식의 0.2 백만 GFP 표현 마우스 (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) hepatocytes 인간의 기원 NeoHep19 비장에 옵니다. 이 절차에에서 이식된 세포의 engraftment 이끌어 낸다. 이 절차는 최소한 침략 적 및 최소한 고통 스러운 기술.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 프로토콜에서 제시 하는 절차는 면역학, 뉴델리의 국립 연구소의 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 승인의 직렬 참조 번호는 IAEC #319/13.
참고: 일반 외과 절차20 및 설치류 수술21에 대 한 특정 프로토콜에 우수한 자원 있습니다. 그는 처음으로 동물 수술을 하 고,이 좋습니다 광범위 하 게 연습을 인형에 수술 동물에 작동 하기 전에.
1입니다. 준비
- 실험, 계속 하기 전에 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 또는 염 분 준비.
- 가 위, 톱니 모양의 집게, 집게를 조직, 면, 면봉, 나일론 스레드, 그리고 다른 마이크로 바늘 홀더 수술 키트를 조립 한다. 압력솥 수술 키트입니다. 특별 한 주의 경우는 면역 손상 끄 덕 취해야 한다. SCID 마우스 프로토콜에 포함 됩니다.
- 수술의 끝에 준비에서 완전 한 실험 절차를 수행, 생물 안전에서 캐비닛 클래스 I.
- 무게는 끄 덕 임. 수술 하기 전에 오래 된 6-8 주간의 SCID 마우스. 14-18 g 사이 무게 쥐가이 연구에 사용 됩니다.
- 헤어 트리머 마우스의 상단 중앙과 증 복 부 영역을 면도. 머리 잘린된 머리카락을 완전히 제거 하려면 주걱으로 크림 지역에 걸쳐 균등 하 게 제거를 적용 합니다. 2-5 분 후 젖은 메 마른 목화의 조각의 도움으로 부드럽게 머리카락을 제거 합니다.
- Isoflurane 챔버에 마우스를 놓고 산소 실린더의 밸브를 잠금 해제 합니다. 4 L/min의 속도로 산소 흐름 및 마 취 유도를 4%에서 isoflurane 증발을 유지 합니다.
- 마우스는 부드러운 발가락 곤란 하 여 제대로 anesthetized 되었습니다 확인 하십시오.
- 장소는 biosafety 내부 수술 보드 장. 마우스의 복 부 부분 직면 하 고 마우스의 앞쪽 부분 isoflurane 및 산소 공급 장치에 연결 하는 코 콘 내부 배치는 그런 동물 수술 보드에 놓습니다.
- 2%, isoflurane 증발을 감소 하 고 수술을 통해 그것을 유지.
- 마우스의 피부를 소독 하 고 절 어 70% 에탄올 소독 면으로 닦아 하 여 소독.
2. 수술
-
부분 Hepatectomy
- 칼 과정을 바로 운영가 위의 도움으로는 흉 곽에 평행한 수직, 흉 골 바로 아래 피부에 약 1 ㎝의 가로 절 개를 확인 합니다.
- 부드럽게 집게 또는 피부와 복 부 근육 층 사이 구별을 무 균 moistened 면 팁 베인된 지역 주변 복 부 근육 층으로 연결 된 피부를 구분 합니다. 건조를 피하기 위해 메 마른 면 팁을 사용 하 여 PBS를 가진 피부 영역을 만끽해 보세요.
- 바로 아래에 칼 복 층 가로 절 개를 하 여 원활 하 게 왼쪽된 엽의 영역을 노출. 폭로 하 고 들어 간 좌 엽 두 moistened 면 팁을 사용 합니다.
- 컷의 복 부 측에 면화 팁 중 하나를 배치 하 고 격 막에 다른 면 팁을 배치. 부드럽게 팁, 횡 경 막 쪽으로 배치를 누르고 들어 간 좌 엽에 다른 팁으로 슬라이딩 밀어 줄.
- 슬립 해제 왼쪽된 엽 통해 루프와 나일론 스레드를 마이크로 포 셉 또는 면 팁의 도움으로 고 hilum 가까이 왼쪽된 엽의 기지를 향해 루프. 부드럽게 왼쪽된 엽의 기지에 나일론 스레드 루프 아래로 밀어.
- 미세 바늘 홀더 및 마이크로 집게를 사용 하 여 왼쪽된 엽 위에 나일론 스레드의 두 끝을 묶어. 다른 쪽에 두 개의 추가 노트를 확인 합니다.
- 가 위의 도움으로 묶인된 엽 개 해 부. 스레드 가까이 매우 잘라 하지 마십시오. 경우에 절차는 5 분 이상 지속, 계속 복 막 구멍 및 장기 액체 손실로 인해 건조를 피하기 위해 무 균 PBS와 촉촉한.
- 연속 봉합을 사용 하 여 4-0 다 봉합 복을 바느질. 그 후, 최대한 빨리 불연속 봉합 하 여 피부를 닫습니다.
-
세포 이식
참고: GFP 표현 hepatocytes 유전자 변형 GFP 마우스에서 고립 되었다 (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J),이 외에 의해 설명 된 절차에 따라. 22 와 쉔 외. 23 hepatocyte 같은 셀 (NeoHep) 인간의 기원 monocytes24 에서 분화의 이식도 사용 되었다. 그러나, 다른 소스에서 파생 된 세포 프로토콜에도 사용할 수 있습니다.- 약 50 µ L의 Iscove의 수정 Dulbecco의 매체 (IMDM), 0.2 백만 가능한 셀을 일시 중단 하 고 1 mL 인슐린 주사기 30 G 바늘 출장에서 발음. 얼음에 그것을 배치 하 여 주사기 차가운 유지.
- 왼쪽된 측면 부분에 수술을 수행 하는 사람을 향해 직면 하는 방식으로 마우스를 놓습니다. 비장 영역을 식별 하 고 transversely 노출 비장을 복 층을 통해 짧은 절 개 뒤 증 지역 근처 피부를 해 부.
- 부드럽게 비장 들어올린 두 PBS의 도움으로 구멍 밖에 서 면 팁을 습 하 게 잡고.
- 한 손에 두 면 팁으로 신중 하 게 비장을 누른 주사기의 바늘을 비장에 정확 하 게 수직 배치 합니다. 부드럽게 비장을 관통 하 고 바늘을 밀어 안으로 매우 느리게; 바늘 2 m m 보다 더 받아야 하지.
- 비장 세포를 주입 하 천천히 주사기의 피스톤을 아래로 밀어. 이식 후 주사기의 바늘을 안정적으로 유지 하 고 천천히 출혈 방지 하려면 비장 또는 셀의 손실에서 그것을 제거 합니다.
- 면 팁으로 복 막 구멍으로 비장을 배치 후 연속 4-0 다 봉합으로 봉합 하 여 복 층을 닫습니다. 바느질 같은 봉합으로 불연속으로 피부. 닫는 피부;에 대 한 상처 클립을 사용 하지 마십시오 대신, 4-0 봉합 하 여 그것을 닫습니다. 상처 클립 마우스의 자연 스러운 움직임을 제한 하 고 종종 클립 느슨하게 되 고 신속 하 게 밖으로 나와.
3. 수술 치료
- 피부를 닫은 후 주변을 요오드 솔루션 (betadine) 살 균 면 팁을 사용 하 여 두 봉합 사이트 닦아냅니다.
- 600 mg/kg 몸 무게 (일반적으로 염 분/마우스의 100 µ L에서 12 mg cefotaxime) intraperitoneally cefotaxime 항생제의 복용량을 주사 1 mL 주사기를 사용 하 여.
- 진통 Meloxicam의 매일 복용량으로 줄 1 mg/kg 몸 무게 (일반적으로 12 µ g Meloxicam의 식 염 수/마우스 100 µ L에서) 동물에 intraperitoneally, 수술 후 최대 3 일 동안.
- 수술의 완료 후 isoflurane 가스의 흐름을 중지 하 고 개별적으로 통풍이 장에 다시 마우스를 놓습니다.
4. euthanization 및 Characterizations
- 실험적인 종점 (1 일 및 10 일 후 수술) 후 기관 동물 윤리 지침에 따라 마우스를 안락사.
- 말기 출혈 눈 터미널 총 puncturing 동물에 의해 혈액을 수집 합니다.
- 혈액에서 혈 청을 분리.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
30% 부분 hepatectomy 후 hepatocyte 확산: 간 30 %hepatectomy 후 남은 hepatocytes의 확산 immunohistochemical (IHC) 세포 확산 표식 기-67에 대 한 얼룩에 의해 시험 되었다. 하루 게시물 hepatectomy 쥐 했다 안락사, 나머지 간 엽 excised 했다, 및 파라핀 섹션 가져온. 섹션은 뒤에 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 활용 된 이차 항 체와 라벨 기-67 항 체와 스테인드 했다. 디 아미노 Benzidine (한 덩어리)으로 사용 되었다 기판 HRP에 대 한 갈색 색상의 개발에 대 한 스테인드 셀을 식별 하기 위해. 핵 카운터 되며 물과 20 X 객관적인 현미경 아래에서 본 했다. 그림 1 간 섹션의 대표적인 IHC 이미지를 보여준다. 약 13% 셀 (13.66 ± 0.317, N = 3)의 기-67 했다 30 %hepatectomy 마우스 간에서 hepatocytes의 확산을 용이 하 게 확인 확실.
해부학 연구: 끄 덕 간의 대표 이미지. SCID 마우스, 10 일 게시물 hepatectomy 그림 2에 표시 됩니다. 이 이미지 확인 나머지 간 아무 표시 이상으로 건강 했다.
수술의 첫 번째 시간 동안 이식된 세포의 존재: 이식된 세포의 유도 이식 후 2 시간 GFP 긍정적인 hepatocytes의 존재를 검사 하 여 흐름 cytometric 분석으로 확인 됐다.
단일 셀 서 스 펜 션 삭제 조직의 효소 소화 게시 GFP hepatocytes 이식의 2 시간 후 비장 및 호스트 마우스의 간에서 얻은 했다. 이식된 GFP 긍정적인 세포의 백분율 교류 cytometer를 사용 하 여 추정 되었다. 분산형 게이트 파편과 더블 릿 셀을 제거 하려면 해당 FSC SSC 점 줄거리에서 선정 되었다. 작의의 사분면 게이트 비장 및 간 셀 이식 했다 컨트롤 마우스에서 얻은 세포 정지의 배경 형광 색소 강도 의해 만들어졌습니다. 약 1.7 %GFP 긍정적인 hepatocytes, 비장에 발견 했다 하 고 아무 GFP hepatocytes에서에서 찾아냈다 간 이식 후 2 시간. 대표적인 데이터는 그림 3에 나와 있습니다.
Immunohistochemistry: 수술 10 일 후, 오른쪽 측면 엽, 오른쪽 중간 엽 및 간 왼쪽된 중간 엽 excised 했다 그리고 5 µ m 섹션을 수행한 곳을 알아내는 단면 쥐 했다 안락사. 이 섹션 다음 추적 및 이식된 세포의 engraftment 위해 시험 되었다. 그림 4 는 표현 (패널 A, B및 C); 쥐 hepatocytes GFP를 식별 하기 위해 안티-GFP (빨간색)에 대 한 얼룩 immunohistochemical (IHC)의 대표 이미지 (빨간색), 안티-인간의 알 부 민으로 안티 인간 connexin 32 (녹색), hepatocyte 모양의 셀 (NeoHep) 인간의 원산지를 식별 하 고 ( D, E, F및 G패널). 핵과 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 블루)는 두 경우 모두 counterstained 했다. 이러한 이미지 패널에 몇 가지 engrafted GFP hepatocytes (패널 A, B및 C)와 NeoHep ( D, E, F및 G패널) 명확 하 게 볼 수 있습니다.
생화학 분석 간 효소를 분 비: 수술 후 간 기능을 확인 하기 위해 다른 간 분 비 효소의 생 화 확 적인 분석은 수행 되었다. 그림 5 에서 막대 그래프 aspartate aminotransferase (AST), 알라닌 aminotransferase (ALT)의 평균 값을 나타냅니다 그리고 건강 한 끄 덕의 혈 청에 있는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (해 봐-포스). SCID 마우스, 그리고 부분적으로 hepatectomized 쥐의 다른 그룹. 그 hepatectomy의 1 일 후 AST, ALT, 그리고 포스가 효소의 수준을 크게 증가, 건강 한 쥐와 비교 하는 그래프에서 분명 하다.
가 포스 수준 높은 게시 비 이식 생쥐에서 10 일 수술 하는 동안 ALT 및 AST 효소 수준 정상으로 복원 되었습니다. 그러나, 모든 3 효소의 수준을 10 일 후 이식된 생쥐에서 정상으로 떨어졌다.
간 조직학 연구: Hepatectomized 및 이식된 생쥐의 간 샘플 추가 수술 후 해부학 적 변화를 공부 하는 조직학 분석에 대 한 처리 되었습니다. 그림 6 스테인드, 수술 없이 건강 한 쥐의 간 섹션 1 일 hematoxylin과 오신 (H와 E)의 이미지 부분 hepatectomy 게시물과 10 일 게시 부분 hepatectomy 및 NeoHep 이식 대표적인 밝은 필드를 보여 줍니다. 이 이미지에서 가벼운 요정 담 즙 증 또는 결합 조직 확산으로 인 한 간 손상 부분 hepatectomy의 1 일 후 관찰 되었다 하 고 아무 이상 10 일 수술 후 관찰 했다.
그림 1 : 기-67 끄 덕의 얼룩의 대표 이미지. SCID 간 섹션 1 일 후 30 %hepatectomy. 절 기-67 항 체와 스테인드 했다, 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 활용 된 이차 항 체, 그리고 소량 (브라운) HRP 기판으로 사용 되었다 핵 되며 (청색)에 의해 counterstained 했다. 나타내는 화살촉은 기-67 긍정적인 (갈색) 세포의 일부 지적 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 끄 덕의 간 엽을 생성. 수술 10 일 후 SCID 마우스. A: 꼬리가 엽 (꼬리가 과정), b: 오른쪽 측면 엽, 중간 엽, d: 왼쪽 중간 엽, e: 심장, f: 남은 c: 오른쪽 hepatectomy, 후 왼쪽된 측면 엽과 g: 꼬리가 엽 (젖꼭지 과정)의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 비장에는 끄 덕의 간 GFP 긍정적인 마우스 heptatocytes의 비율. SCID 마우스. 상위 패널 셀 이식 했다 나이 일치 컨트롤 마우스의 셀 프로 파일을 보여줍니다. 낮은 패널 hepatectomized 마우스에 GFP hepatocyte 이식의 2 시간 후 셀 프로 파일을 보여줍니다. 음모의 y 축 로그 스케일에 임의의 단위로 측정 GFP (FITC 채널)의 형광 강도 나타냅니다 하 고 x 축 선형 눈금에 임의의 단위로 앞으로 분산형 (FSC)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 재생성 된 호스트 간에서 마우스 hepatocytes 및 NeoHep을 표현 하는 이식된 GFP의 귀환. 부분적으로 hepatectomized의 간 섹션의 대표 이미지를 끄 덕. SCID 마우스 GFP 긍정적인 마우스 hepatocytes (A-C)와 이식 세포 engraftment를 표시 하 고 귀환. 패널 a: 핵 (파란색: DAPI), 패널 b: 안티-GFP (레드: 알 렉 사 Fluor 594), 패널 c: 결합 된 이미지. 패널 (D-G) 부분적으로 hepatectomized 끄 덕의 간 섹션을 표시합니다. SCID 마우스는 NeoHep에서 이식 했다. 패널 d: 핵 (파란색: DAPI), 패널 e: 인간의 안티 Connexin 32 (녹색: 알 렉 사 Fluor 488), 패널 f: 인간의 안티 알 부 민 (레드: 알 렉 사 Fluor 594)와 패널 g: 결합 된 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 다른 간의 생 화 확 적인 분석 쥐 혈 청에서 효소를 분 비. 열 바 다른 효소 (AST/SGOT, ALT/SGPT가 포스)의 평균 값을 나타냅니다. 수술 후 연구의 시간 포인트는 X 축에 표시 됩니다. 컨트롤 그룹에서 나이 일치 끄 덕 했다. SCID 마우스 및 수술 수행 되었다. 평균, N = 3의 표준 오차를 의미 하는 오차 막대와 * p를 나타냅니다 < 0.05, NS p에 비 중요성을 나타냅니다 > 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 생쥐 간 조직 단면도의 histopathological 연구. 대표적인 밝은 분야 현미경 이미지 hematoxylin과 오신 (H와 E) 끄 덕의 간 조직 섹션 스테인드. 20 X 렌즈 아래 SCID 쥐입니다. 패널 A 건강 한 끄 덕 임에서 간 섹션을 보여 줍니다. 어떤 수술 없이 같은 나이의 SCID 마우스. 패널 B 간 섹션 1 일 게시물 부분 hepatectomy를 보여줍니다. 이 이미지에서 화살표 머리 온화한 peri billiary 섬유 증 또는 결합 조직 확산 영역을 나타냅니다. 패널 C는 간 섹션 10 일 게시물 부분 hepatectomy와 세포 이식을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
부분 hepatectomy 조사 간 재생에 대 한 설립된 기술 이며 과도 한 hepatectomy AHF 모델을 모방 하기 위해 보고. AHF의 동물 모델 중 특히 쥐, 설치류는 가장 연구 모델입니다. 최대 70 %hepatectomy 쥐에서 간 상해 모델을 얻기 위해 좋은 생존 율25,26보고 되었습니다. 그러나 누드 및 다른 immunodeficient 마우스, 70 %hepatectomy 치명적으로 알려졌다 고 동물2724 시간 안에 죽 었 다.
미첼과 Willenbring28 2/3 부분 hepatectomy 쥐에 대 한 재현 하 고 잘 용납 방법 설명 했다. 에 끄 덕 임. SCID 쥐는 우리는 hepatectomy 총 간 질량의 30%는 왼쪽된 간 엽 절제술까지 제한 되었다 때 100% 생존 율 얻을. 누드 마우스27에 관측에 따라 어떤 추가 hepatectomy 끄 덕에 비율에서 증가 관찰 합니다. SCID 마우스 생존 율의 극적인 저하 이끌어 낸다. 또한, 간 나머지 hepatocytes의 확산 돌출부 게시물 1 일 30% 부분 hepatectomy의 이식 및 engraftment 연구에이 절차의 유틸리티를 확인 했다.
최근 신문에, 아메드 수호 외. 29 intrahepatic 간세포 암 xenografts immunodeficient 마우스에 대 한 절차를 설명 했다. 그들은 다양 한 장기, 비장을 포함 한 고 hepatectomy intrahepatic engraftment를 촉진 하기 위하여 수행에 종양 세포의 식 위한 절차를 나타났습니다.
미첼28 와 아메드29보고 절차에 작은 절 개는 수술에서 선호 일반적으로 훨씬 더 작은 절 개를 함으로써 수정에 대 한 기회가입니다. 증거30 작은 길이 수술 절 개 스트레스 호르몬 코 티 솔과 카 테 콜 아민 등의 덜 분 비 하는 있다. 또한, 우리는 하나의 큰 절 개를 포함 하는 절차 능력의 높은 수준을 요구 하 고는 2 개의 작은 절 개는 데 절차에 비해 더 재현, 어렵다 발견.
이 종이에서 우리는 최소 절 개 하는 데 필요한 간 좌 엽을 노출 하는 절차를 설명 하 고 30 %hepatectomy 수행한 후 또 다른 작은 절 개 비장 세포 이식 했다 폭로 되었다. 이 절차는 전문된 수술 능력을 필요로 하지 않습니다 하 고 5-7 분에 완료 될 수 있다. 또한, 우리 조직학 연구에 의해 입증으로 나머지 간 질량에 어떤 형태 또는 해 부 이상은의 증거를 발견. 또한, 수술 6-8 주 동안 허 혈 이나 괴 사의 부재 했다-오래 된 면역 손상 쥐. 부분 hepatectomy 후 간 상해의 유도 간 효소 AST, ALT, 그리고가-PHOSin 쥐 혈 청의 높은 수준에 의해 확인 된다. Intrasplenic 경로 포털 정 맥 시스템은 다른 정 맥 시스템 보다 간 피 질에 더 높은 접근 가능성 때문에 다른 정 맥 경로 통한 세포 이식에 대 한 선정 되었습니다. 우리 유전자 변형 GFP 마우스에서 격리 hepatocytes의 이식 증명 하 고 NeoHep는 부분적으로 hepatectomized 끄 덕에에서 인간의 원산지 hepatocyte 같은 세포 분화. SCID 동물입니다. 절차는 이식에 사용 되는 세포의 종류를 제한 하지 않습니다.
그러나,이 절차 만들지 않습니다 AHF 상태는 마우스에만 30% 부분 hepatectomy 수행. 이 제한 된 hepatectomy hepatocytes에 나머지, 그로 인하여 engraftment를 이식된 hepatocytes에 대 한 추가적인 기회를 제공 하는 존재를 증식 가능성을 제공 합니다. 그것만 보여줍니다 마이그레이션 및 engraftment hepatocytes, 및 NeoHep의 비장에서 간, 그리고 추가 손상 간 이식 절차에 의해 이루어집니다.
모든 동안,이 절차는 간단 합니다, 그리고 연습 고 쉽게 재현 가능한 결과 얻으려면 마스터. 여러 소스의 세포 (줄기 세포 또는 hepatocyte 같은 셀) 간 부상, 또는 간 재생 연구의 맥락에서 재생 잠재력이 수술으로 쉽게 평가할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 학과 생명 공학, 면역학, 뉴델리의 국립 연구소에 인도 정부에서에서 받은 코어 그랜트에 의해 지원 되었다. 박사 Bhattacharjee의 현재 주소는 사단의 위장, 간장 학과 및 영양, 아동 병원 로스 앤젤레스.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase's analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure? Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , http://www.who.int/surgery/publications/s16383e.pdf (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
