Summary
תארנו פרוטוקול לביצוע חלקי hepatectomy (PHx), השתלת תא באמצעות הטחול ב במנוד ראש. SCID (הנהון. CB17-Prkdcscid/J) עכברים. ב פרוטוקול זה, חתך לחשוף ולאחר נכרות האונה השמאלית של הכבד, ואחריו עוד חתך השתלת intrasplenic של תאים.
Abstract
Hepatectomy חלקית היא שיטה לשחזור רב-תכליתי ללמוד התחדשות הכבד ואת השפעת התא מבוסס הרפוי בתנאים פתולוגיים שונים. Hepatectomy חלקית מקלה גם engraftment מוגבר של התפשטות התאים המושתלים על ידי מאיץ כורוידאלית ואת נדידת תאים לכיוון הכבד. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט עבור מבצע 30% hepatectomy והשתלת תאי הטחול של שאינו שמנים סוכרת/חמור בשילוב הנד immunodeficient. SCID (הנהון. CB17-Prkdcscid/J) העכבר.
בהליך זה, מתבצעים שני חתכים קטנים. החתך הראשוני היא לחשוף ולאחר נכרות האונה השמאלית של הכבד, והוא חתך קטן אחר עשוי לחשוף את הטחול כבר intrasplenic של תאים. הליך זה אינו דורש כל כישורים מיוחדים, ניתן להשלים אותו תוך 5-7 דקות עם פחות לחץ, כאב, התאוששות מהירה יותר של הישרדות טוב יותר. הראו את השתלת של hepatocytes מבודד של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המבטאת העכבר (הטרנסגניים C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), כמו גם hepatocyte כמו תאים ממקור אנושי (NeoHep) ב חלקית hepatectomized במנוד ראש. SCID עכברים.
Introduction
כיום, השתלת hepatocyte מוצע כחלופה השתלת איברים כל בטיפול בחולים לאחר הפרעות כבד קשות. הוא האמין כי זה יכול לגשר בין חולים השתלת איברים כל1. בנוסף allogenic hepatocytes2, xenogenic hepatocytes3 ו hepatocytes שמקורם בתאי גזע4 גם נחקר במודלים של בעלי חיים. בהקשר זה, יונת, engraftment הפוטנציאל של התאים המושתלים של הנמען הוא קריטריון חשוב עבור טיפול בתאי מבוסס על כשל של הכבד חריפה (AHF).
עבור חוקרים את השתלת hepatocytes או תאים דמויי hepatocyte5, AHF נוצרת במודל חיה כירורגי6 או תרופתי7 נהלים, ואחריו משתילים תאים. כדי להפוך מודל חיה AHF על ידי ריאגנטים תרופתי, hepatotoxins רבים כגון d-galactosamine8, פרצטמול9, פחמן tetrachloride10, thioacetamide11, Concanavalin A12, ליפופוליסכריד13 , ועוד., היו בשימוש. מתוך רשימה זו, כל ריאגנט יוצר קבוצת תכונות ייחודיות עבור AHF, אך למרבה הצער לא מגיב יחיד מחקה את AHF האנושית. יתר על כן, AHF שנגזרות hepatotoxins אורכת זמן רב, אשר מעמידה חיות תחת מתח כרוני, ויש תוצאות לשחזור קשה להשיג.
מצד שני, ההליך הכירורגי של חלקי hepatectomy (PHx) היא מיומנות התלויים, תוצאות לשחזור קל להשיג לאחר פיתוח הכישורים הנדרשים. כדי לגרום AHF על ידי התערבות כירורגית לבד, נדרשת כריתה של יותר מ 70% של הכבד; עם זאת, פחות ממה hepatectomy 70% עדיין יכול להיות מנוצל כדי ללמוד engraftment והתפשטות של מושתלים תאי הכבד לניתוח יכולת טיפולית שלהם במהלך פגיעה בכבד14. ההשתלה של hepatocytes כבר hepatectomy פוסט שבוצעו דרך ה צפק15, וריד הזנב16, וריד הכבד17או את הטחול18. כיום, וריד הכבד אינפוזיה והשתלות intrasplenic של hepatocytes הן ההליכים מועדף, הם יותר קל להתרבות.
בנייר זה, תארנו הליך של hepatectomy חלקי 30% ב במנוד ראש. SCID (הנהון. CB17-Prkdcscid/J) שבו טוחנות האונה השמאלית של הכבד הוא עכברים. זה ואחריו השתלת hepatocytes העכבר (6/C57BL-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) לביטוי GFP 0.2 מיליון וכן מקור אנושי NeoHep19 של הטחול. הליך זה מוביל engraftment של התאים המושתלים בכבד. ההליך זה לפחות פולשני, טכניקה כואב מינימלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלים הוצג פרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת אתיקה מוסדית חיה של המכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. מספר האישור הפניה טורי הוא IAEC #319/13.
הערה: ישנם משאבים מעולה על נהלים כירורגיה כללית20 ופרוטוקולים ספציפיים עבור ניתוח מכרסמים21. אלה עושים את הניתוח בעלי חיים בפעם הראשונה, מומלץ לתרגל בהרחבה ניתוחים על בובות ההפעלה על בעלי חיים.
1. הכנה
- לפני הניסוי, שמור תמיסת מלח סטרילית פוספט buffered (PBS) או מוכן מלוחים.
- להרכיב ערכה ניתוח המכיל מספריים מלקחיים משוננות, רקמות מלקחיים, כותנה, צמר גפן, חוטי ניילון, מחט מיקרו שונים. אוטוקלב ערכת ניתוח. טיפול מיוחד יש לנקוט אם הנהון החיסון-לסיכון. SCID העכבר נכלל בפרוטוקול.
- בצע את ההליך ניסיוני מלאה, משלב הכנת בסוף הניתוח, הביו-הבטיחות מחלקה אני ארון.
- שוקלים הנהון. SCID בעכבר של 6-8 שבועות לפני הניתוח. עכברים במשקל בין 14-18 גרם משמשים במחקר זה.
- לגלח העליון המרכזי, היפוכונדרית אזור הבטן של העכבר הקוצץ שיער. להחיל שיער הסרת קרם אחיד בכל רחבי האזור עם מרית כדי להסיר לחלוטין את השערות החתוך. להסיר את השיער בעדינות בעזרת פיסת צמר גפן סטרילי רטוב אחרי 2-5 דקות.
- הנח את העכבר בתא איזופלוריין ולפתוח את הברז של הגליל חמצן. לשמור על זרימת חמצן בשיעור של 4 L/דקה את אידוי איזופלוריין ב 4% כדי לגרום הרדמה.
- ודא כי העכבר יש כבר מורדם כראוי על ידי הבוהן עדין לצבוט.
- להציב לוח ניתוח בפנים אבטחה בארון. במקום החיה על ניתוח הלוח, כך פונה מעלה, בחלק הבטני של העכבר ואת החלק הקדמי של העכבר ממוקם בתוך אצטרובל האף מחובר את איזופלוריין ואת אספקת החמצן.
- להפחית את אידוי איזופלוריין ל- 2%, לשמור עליו לאורך כל הליך כירורגי.
- לחטא את העור של העכבר ולחטא אותו על ידי מנגב עם ספוג אתנול 70% כותנה סטרילי.
2. ניתוח
-
Hepatectomy חלקית
- לבצע חתך רוחבי של 1 ס מ של העור מתחת החזה, בניצב תהליך מצאתי ואת במקביל בית החזה, בעזרת מספריים הפעלה ישר.
- נפרדים בעדינות את העור המצורפת עם השכבה שריר הבטן בקרבת האזור חרות עם מלקחיים או ניתוח סטרילי כותנה בטעימת טיפים כדי להבחין בין העור לבין שכבת שריר הבטן. משרים את האזור intradermal עם PBS באמצעות צמר גפן סטרילי טיפים כדי להתחמק לייבוש.
- לחשוף את האזור של האונה השמאלית בצורה חלקה על ידי ביצוע חתך רוחבי דרך השכבה הצפק מתחת מצאתי. השתמש בעצות כותנה בטעימת שני לחשוף ולהרים האונה השמאלית של הכבד.
- מקום אחד הטיפים כותנה בצד הבטן של החתך, ולמקם עוד טיפ כותנה בצד הסרעפת. בעדינות את הטיפ להציב כלפי הסרעפת ואת לתת דחיפה הזזה. על ידי אחרים כדי להרים את האונה השמאלית של הכבד.
- להחליק חוט ניילון עם לולאה דרך האונה השמאלית המורמת והחלק הלולאה לעבר הבסיס של האונה השמאלית קרוב hilum בעזרת העצות מיקרו-מלקחיים או כותנה. לדחוף בעדינות את הלולאה בחוט ניילון בבסיס האונה השמאלית.
- לקשור שני קצוות של חוט ניילון מעל החלק העליון של האונה השמאלית באמצעות בעל מחט למיקרו המלקחיים מיקרו. לעשות שני קשרים נוספים בצד השני.
- שווייץ האונה קשור בעזרת מספריים. אל תנסו לחתוך מאוד קרוב החוט. למקרה ההליך נמשך יותר מ- 5 דקות, לשמור את חלל הצפק איברים לח עם PBS סטרילי כדי להימנע לייבוש בשל אובדן נוזלים.
- לתפור את הצפק באמצעות רציף הפתולוגיים בתפר לאללה 4-0. לאחר מכן, לסגור את העור על-ידי תפירת מקוטע מהר ככל האפשר.
-
השתלת תא
הערה: hepatocytes מבטאים ה-GFP הם בודדו אותנו מהמתרחש העכברים הטרנסגניים GFP (6/C57BL-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), על-פי ההליך המתואר על ידי Lee ואח. 22 , שן ואח. 23 תאים, כמו hepatocyte (NeoHep) ממוצא האנושי תריז ומונוציטים24 שימשו גם השתלת. עם זאת, תאים שמקורם מקורות אחרים עשוי לשמש גם בפרוטוקול.- להשעות את התאים קיימא 0.2 מיליון ב בסביבות 50 µL של המדיום של Iscove שונה Dulbecco (IMDM), תשאף את זה בתוך מזרק אינסולין 1 מ"ל כתרים עם המחט 30 גרם. לשמור את המזרק קר על ידי הצבתו על קרח.
- הצב את העכבר בדרך בחלק הלטראלי השמאלי כלפי מעלה לכיוון האדם שמבצע ניתוח. לזהות את אזור הטחול ומנתחים באופן רוחבי על העור ליד האזור היפוכונדרית, ואחריו חתך קצר דרך השכבה הצפק רק כדי לחשוף את הטחול.
- בעדינות להרים את הטחול והחזק שאותו החוצה חלל הבטן בעזרת שני PBS לחלח טיפים כותנה.
- החזיקו הטחול בזהירות עם שתי עצות כותנה ביד אחת, ולמקם את המחט של המזרק בדיוק אנכית כדי הטחול. פירס הטחול ולדחוף את המחט בעדינות באיטיות פנימה; המחט לא צריך לקבל עמוקות יותר מ- 2 מ מ.
- לוחץ את הבוכנה של המזרק לאט כדי להזריק את התאים לתוך הטחול. לאחר ההשתלה, להשאיר את המחט של המזרק יציב ומסירים אותו לאט לאט הטחול כדי למנוע דימום או אובדן של תאים.
- לאחר הצבת הטחול בחזרה לתוך חלל הצפק עם העצות כותנה, לסגור את השכבה הצפק על ידי תפירת רציף 4-0 בתפר לאללה. לתפור את העור באורח מקוטע עם התפר אותו. הימנע משימוש הפצע קליפים לסגירת העור; במקום זאת, לסגור את זה על ידי בתפר 4-0. הקליפים הפצע להגביל את התנועה הטבעית של העכבר, לעיתים קרובות קליפים להיות משוחרר. וצא החוצה במהירות.
3. לאחר הניתוח טיפול
- לאחר סגירת העור, נגב את הסביבה של שני האתרים תפר עם יודיפלור תמיסה (betadine) באמצעות טיפ כותנה סטרילי.
- תזריק מנה של אנטיביוטיקה cefotaxime כמו 600 מ"ג/ק"ג משקל (בדרך כלל 12 מ"ג cefotaxime ב µL 100 של תמיסת מלח/עכבר) גוף intraperitoneally באמצעות מזרק 1 מ"ל.
- לתת במינון יומי של Meloxicam כאבים בתור 1 מ"ג/ק"ג משקל גוף (בדרך כלל 12 µg Meloxicam ב µL 100 של תמיסת מלח/עכבר) לחיה intraperitoneally, במשך שלושה ימים אחרי הניתוח.
- לאחר סיום הניתוח, מפסיקים את זרימת הגז איזופלוריין ומניחים את העכבר חזרה לכלוב מאוורר בנפרד.
4. euthanization, אפיוני
- לאחר ניסיוני והגישור (יום 1 ו- 10 ימים לאחר הניתוח), המתת חסד העכברים על פי הנחיות מוסדיים אתיקה בעלי חיים.
- לאסוף דם על ידי סופני דימום החיות, ניקב את מקלעת מסוף עינית.
- לבודד נסיוב מהדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocyte התפשטות לאחר hepatectomy חלקי 30%: התפשטות hepatocytes הנותרים הכבד לאחר 30% hepatectomy נבדק על ידי immunohistochemical (IHC) צביעת עבור סמן התפשטות תאים, Ki-67. פוסט יום אחד hepatectomy, העכברים היו מורדמים, האונות הכבד הנותרים היו טוחנות, פרפין מקטעים התקבלו. הסעיפים היו מוכתמים נוגדן Ki-67, ואחריו labelling עם חזרת peroxidase (HRP) נוגדנים משניים מצומדת. אמינו Di Benzidine (DAB) שימש המצע HRP לפיתוח של צבע חום כדי לזהות תאים מוכתם. הגרעין היה מונה מוכתם hematoxylin, מתחת למיקרוסקופ אובייקטיבית 20 X. איור 1 מציג תמונת IHC נציג של חלק מהכבד. בסביבות 13% של תאים (13.66 ± 0.317, N = 3) היו Ki-67 חיובי, אשר אישר כי hepatectomy 30% מקלה על התפשטות hepatocytes בכבד עכבר.
גוף האדם: תמונת הנציגה של הכבד של הנהון. SCID בעכבר, 10 ימים hepatectomy פוסט מוצגת באיור2. תמונה זו אישר כי הכבד הנותרים היה בריא עם. אין חריגות גלוי.
נוכחות של התאים המושתלים במהלך השעה הראשונה של הניתוח: יונת התאים המושתלים אושר עם ניתוח תזרים cytometric על-ידי בדיקת הנוכחות של GFP hepatocytes חיובי 2 שעות לאחר ההשתלה.
השעיה תא בודד היה המתקבלים את הטחול והכבד של העכבר המארח לאחר עיכול אנזימטי של רקמת נכרת פוסט 2 שעות של GFP-hepatocytes השתלת. אחוז המושתלים GFP תאים חיובי הוערך באמצעות cytometer של זרימה. שער פיזור נבחר מן העלילה נקודה FSC-האס המתאימים כדי לחסל את התאים פסולת וכפיל. שער מזרחי של המגרש נוצר על ידי fluorochrome רקע עוצמת המתלים התא המתקבל את הטחול והכבד של עכבר שליטה בו הושתלו אין תאים. בסביבות 1.7% hepatocytes חיובי GFP נמצאו הטחול, hepatocytes GFP לא נמצאו בכבד 2 שעות לאחר ההשתלה. נציג נתונים מוצגים באיור3.
אימונוהיסטוכימיה: עשרה ימים לאחר הניתוח, העכברים היו מורדמים, האונה הימנית האונה נכון המדיאלי, האונות המדיאלי השמאלי של הכבד היו טוחנות ואת חלוקתה הקפאה בוצע כדי לקבל 5 מיקרומטר מקטעים. סעיפים אלה נבחנו אז כדי להפוך את יונת engraftment של התאים המושתלים. איור 4 מציג את התמונות נציג של immunohistochemical (IHC) צביעת נגד אנטי-GFP (אדום) כדי לזהות את ה-GFP לבטא hepatocytes עכברים (פאנל A, Bו- C); ונגד נגד אלבומין (אדום), כמו גם נגד connexin 32 (ירוק), כדי לזהות תאים, כמו hepatocyte (NeoHep) ממקור אנושי (פנל D, E, Fו- G). הגרעין היה counterstained עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, כחול) בשני המקרים. בחלוניות אלה תמונה, כמה GFP engrafted לבטא hepatocytes (פאנל A, Bו- C) ו NeoHep (פנל D, E, Fו- G) הם נראים בבירור.
ניתוח הביוכימי של הכבד מופרש אנזימים: על מנת לבדוק את הפונקציונליות של הכבד לאחר הליך כירורגי, בוצע ניתוח הביוכימי של אנזימים שונים על ידי הכבד. מהגרפים באיור 5 מייצגים את הערך הממוצע של אספרטט aminotransferase (AST), אלנין aminotransferase (ALT), אלקליין פוספטאז (ALK PHOS) בנסיוב של במנוד ראש בריא. SCID עכברים, קבוצות שונות של עכברים hepatectomized חלקית. ברור מהגרף כי לאחר יום 1 hepatectomy, רמות של אנזימים AST, ALT ופוספאטז גדל באופן משמעותי, כאשר לעומת עכברים בריאים.
רמות אנזים ALT ו- AST שוחזרו לשגרה, בעוד רמות פוספאטז בסיסי-נותרה גבוהה לתגובה 10 ימים בעכברים שאינם מושתלים. עם זאת, הרמות של כל שלושה אנזימים ירד ל נורמלי בעכברים המושתלים לאחר 10 ימים.
לימוד היסטולוגית הכבד: הדגימות הכבד של hepatectomized, עכברים המושתלים עובדו נוספת לבדיקה היסטולוגית ללמוד על שינויים אנטומיים לאחר הניתוח. איור 6 מראה השדה החיובי נציג תמונות של hematoxylin אאוזין (H ו- E) צבעונית מקטעים הכבד של עכברים בריאים ללא ניתוח, 1 יום פוסט hepatectomy חלקית ולפרסם 10 ימים hepatectomy חלקית והשתלות NeoHep. בתמונות האלה, נזק לכבד עקב התפשטות פיברוזיס או רקמת חיבור פרי-המרה קלה נצפתה לאחר יום 1 של hepatectomy חלקית, אין חריגות נצפו 10 ימים לאחר הניתוח.
איור 1 : תמונת הנציגה של Ki-67 מכתים של במנוד ראש. סעיף SCID הכבד לאחר יום 1 של 30% hepatectomy. סעיף הוכתם נוגדן Ki-67, חזרת peroxidase (HRP) מצומדת נוגדנים משניים, DAB (חום) שימש המצע HRP ו גרעינים היו counterstained על ידי hematoxylin (כחול). ראשי החץ מרמז להצביע חלק מהתאים (חום) חיובי Ki-67. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : מחדש אונות הכבד הנהון. SCID העכבר 10 ימים לאחר הניתוח- ת: המזונבת האונה (תהליך המזונבת), ב': נכון האונה לרוחב, c: ימין האונה המדיאלי, d: שמאל האונה המדיאלי, הלב: E, f: הנותרים של האונה השמאלית לרוחב לאחר hepatectomy, וז: באונה המזונבת (תהליך Papillary). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : אחוז GFP heptatocytes העכבר חיובי הטחול, הכבד של במנוד ראש. SCID העכבר. הלוחות העליון הצג את הפרופיל תא של עכבר בקרה מתאימים גיל שבו תאים לא היו מושתלים. לוחות התחתון הצג לפרופיל תא לאחר שעתיים של השתלת hepatocyte GFP ב עכבר hepatectomized. ציר y של החלקות מציין את עוצמת קרינה פלואורסצנטית GFP (ערוץ FITC) נמדד ביחידות שרירותיים בקנה מידה יומן, ציר x מציין את פיזור קדמי (FSC) ביחידות שרירותיים בקנה מידה ליניארי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : יונת של המושתלים GFP לבטא hepatocytes העכבר ו NeoHep בכבד המארח מחדש. תמונות נציג של קטעי כבד חלקית hepatectomized במנוד ראש. SCID בעכבר מושתלים עם GFP העכבר חיובי hepatocytes (א-ג), מציג תא engraftment, ביות. פאנל a: גרעין (כחול: דאפי), לוח ב': אנטי-GFP (אדום: אלקסה עבור חיל הים 594), ממוזג c: החלונית תמונה. פאנלים (D-G) להציג חלק הכבד של חלקית hepatectomized במנוד ראש. SCID העכבר אילו NeoHep היו מושתלים. לוח d: גרעין (כחול: דאפי), לוח ה': האדם אנטי-Connexin 32 (ירוק: אלקסה עבור חיל הים 488), f: לוח אנטי-אלבומין אנושית (אדום: אלקסה עבור חיל הים 594) ותמונה לוח ז' ממוזג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : ניתוח הביוכימי של הכבד שונה מופרש אנזימים בנסיוב עכברים. עמודה הסורגים מייצג את הערכים אכזרי של אנזימים שונים (AST/SGOT, ALT/SGPT, פוספאטז בסיסי-). נקודת הזמן של המחקר לאחר הניתוח מוצג על ציר X. בקבוצת הביקורת, היו גיל מתאימים במנוד ראש. SCID עכברים והניתוח לא בוצעה. קווי שגיאה מסמלים את שגיאת התקן הממוצע, N = 3, * מציין p< 0.05, NS מציין שאינו-חשיבות ב p> 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : מחקר histopathological סעיפים רקמת הכבד עכברים. תמונות מיקרוסקופיית שדה בהיר נציג של hematoxylin אאוזין (H ו- E) מוכתם מקטעי רקמת הכבד במנוד ראש. SCID עכברים תחת 20 X עדשה אובייקטיבי. פאנל A מציג חלק מהכבד הנהון בריא. SCID בעכבר, באותו הגיל ללא כל ניתוח. פאנל B מראה של הכבד סעיף 1 יום hepatectomy פוסט חלקית. בתמונה זו, ראשי חץ מציינים את אזור תפוצת פרי מתון-billiary פיברוזיס או רקמת חיבור. לוח ג מראה של הכבד סעיף 10 ימים פוסט חלקית hepatectomy ותא השתלת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hepatectomy חלקית היא טכניקה הוקמה עבור החקירה התחדשות הכבד, hepatectomy מוגזמת הוא דיווח כדי לחקות את מודל AHF. בין מודלים חייתיים של AHF, מכרסמים, עכברים במיוחד, הם המודל הכי חקר. כדי להשיג פגיעה בכבד מודל בעכברים, עד hepatectomy 70% דווח עם הישרדות טוב שיעור25,26. עם זאת בעירום, עכבר immunodeficient אחר, hepatectomy 70% נמסר בשם קטלנית, חיות מתו בתוך 24 שעות27.
מיטשל ו Willenbring28 הפגינו שיטה לשחזור ונסבל היטב hepatectomy 2/3 חלקי בעכברים. עבור במנוד ראש. SCID עכברים, השגנו סיכויי הישרדות 100% כאשר hepatectomy היה מוגבל עד כריתה של האונה הכבד השמאלי, אשר קרוב 30% בכבד המסה הכוללת. בקנה אחד עם התצפיות על עכברים עירום27, הבחנו כי כל עוד יותר להגביר באחוזים של hepatectomy ב במנוד ראש. SCID העכבר מובילה ירידה דרמטית שיעור ההישרדות. יתר על כן, התפשטות של hepatocytes הנותרים הכבד אונות פוסט 1 יום 30% hepatectomy חלקית אישר את התועלת של הליך השתלת ולימודי engraftment.
עבודה עדכנית יותר, אחמד בוגרות. et al. 29 הדגים הליך של xenografts קרצינומה intrahepatic hepatocellular בעכברים immunodeficient. הם הראו הליך של ההשתלה של תאים סרטניים באיברים שונים, לרבות הטחול, וביצע hepatectomy כדי להקל על intrahepatic engraftment.
בפרוצדורות שדווחו על-ידי מיטשל28 לאחמד29, יש הזדמנות עבור ליטושים על-ידי ביצוע חתכים קטנים הרבה יותר, כפי חתכים קטנים יותר הם העדיפו בניתוח. יש ראיות30 חתך כירורגי קטן יותר אורך המוביל אל פחות הפרשת הורמוני לחץ, כגון קורטיזול קטכולאמין. בנוסף, מצאנו כי ההליכים לערב אחד חתך גדול יותר דורש רמה גבוהה יותר של מיומנויות, קשים יותר להתרבות, בהשוואה לנהלים שיש שני חתכים קטנים יותר.
בנייר זה, שתיארנו הליך בו חתך מינימלי נדרש לחשוף את האונה השמאלית של הכבד, לאחר ביצוע hepatectomy של 30%, חיתוך קטן נוסף היה עשוי לחשוף את הטחול שבו תאים שהיו מושתלים. הליך זה אינו דורש כל כישורים מיוחדים, יכולה להסתיים ב- 5-7 דקות. יתר על כן, מצאנו הוכחות של אי-תקינות מורפולוגיים או אנטומי המסה הכבד הנותרים, כפי שמעידים מחקרים היסטולוגית. יתר על כן, היתה היעדרות של איסכמיה או נמק במהלך הליך כירורגי בשבוע 6-8-החיסון הישן נחשף עכברים. אינדוקציה של פגיעה בכבד לאחר hepatectomy חלקית אושר על ידי רמות גבוהות של אנזימי כבד AST, ALT ו- ALK-PHOSin עכברים סרום. נתיב intrasplenic נבחרה עבור השתלת תא מעל נתיבי ורידים אחרים, כי וריד יש נגישות גבוהה יותר לתוך קליפת כבד יותר ממערכות ורידים אחרים. הראו את השתלת של hepatocytes מבודד עכבר ה-GFP, NeoHep אשר הבדיל תאים דמויי hepatocyte ממקור אנושי, ב חלקית hepatectomized במנוד ראש. SCID חיות. ההליך לא להגביל את סוג התאים המשמש השתלת.
עם זאת, הליך זה אינו יוצר התנאי AHF ב עכבר, כפי מתבצע רק hepatectomy חלקי 30%. זה hepatectomy מוגבלת מספק הפוטנציאל proliferative hepatocytes נוכח בכבד הנותרים, אשר ובכך מספקת הזדמנויות נוספות hepatocytes המושתלים engraftment. זה רק ממחיש את ההעברה ואת engraftment של hepatocytes, NeoHep מן הטחול אל הכבד, אין נזק נוספים אל הכבד נעשית על ידי הליך השתלת.
מעל הכל, הליך זה הוא פשוט, יכול להיות מתורגל, שולט בקלות כדי להשיג תוצאות לשחזור. ניתן להעריך את פוטנציאל הרגנרציה של מספר מקורות הסלולר (תאי גזע או hepatocyte כמו תאים) בהקשר של פגיעה בכבד או הלימוד התחדשות הכבד, בקלות עם הליך כירורגי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המענק הליבה קיבל את המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו על המכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. הכתובת הנוכחית של ד ר Bhattacharjee הוא חטיבת לגסטרואנטרולוגיה, Hepatology, תזונה, החולים בלוס אנג'לס לילדים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase's analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure? Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , http://www.who.int/surgery/publications/s16383e.pdf (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
