Summary
Kısmi hepatectomy (PHx) ve hücre transplantasyonu dalak ile NOD gerçekleştirmek için bir protokol anlatmıştık. SCID (BAŞINI SALLAMAK. CB17-Prkdcscid/J) fareler. Bu protokol için ortaya çıkarmak ve hücre intrasplenic nakli için başka bir kesi ardından karaciğer sol lob çıkarabileceğim için bir kesi yapılır.
Abstract
Kısmi hepatectomy karaciğer rejenerasyonu ve değişik patolojik koşullarda hücre dayalı tedavi etkisini incelemek için çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Kısmi hepatectomy da artan engraftment ve Transplante hücrelerin çoğalması hızlanan neovaskülarizasyon ve hücre göç doğru karaciğer tarafından kolaylaştırır. Burada, bir obez olmayan şeker hastası/şiddetli, dalak performans % 30 hepatectomy ve hücre nakli kombine immünyetmezligi başını SALLAMAK için basit bir protokol açıklayın. SCID (BAŞINI SALLAMAK. CB17-Prkdcscid/J) fare.
Bu yordam, iki küçük insizyon yapılır. Belgili tanımlık ilk kesme ortaya çıkarmak ve karaciğer sol lob çıkarabileceğim etmektir ve başka bir küçük kesi dalak hücre intrasplenic nakli için ortaya çıkarmak için yapılır. Bu yordam herhangi bir özel cerrahi beceri gerektirmez ve daha az stres ve ağrı, hızlı iyileşme ve daha iyi hayatta kalma ile 5-7 dakika içinde tamamlanabilir. Fare (transgenik C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) yanı sıra Hepatosit hücreler kısmen hepatectomized başını SALLAMAK içinde insan kaynaklı (NeoHep) gibi ifade bir floresan yeşil protein (GFP) dan izole tetkikine nakli göstermiştir. SCID fareler.
Introduction
Şu anda, Hepatosit bütün organ nakli şiddetli karaciğer bozukluğu olan hastaları tedavi için bir alternatif olarak teklif edilir. Bu hastaların tüm organ nakli1köprü olabilir inanılıyor. Ek olarak allojenik tetkikine2, xenogenic tetkikine3 ve kök hücre4 ' ten türetilmiş tetkikine hayvan modellerinde da soruşturuluyor. Bu bağlamda, posta ve engraftment potansiyel alıcı transplante hücrelerinin temel hücre tedavisi için önemli bir kriter akut hepatik yetmezliği (AHF) var.
Hepatositlerin veya Hepatosit benzeri hücreler5nakli soruşturma için AHF hayvan modelinde cerrahi6 veya farmakolojik7 yordamlar, hücre nakli tarafından takip tarafından oluşturulur. Bir AHF hayvan modeli farmakolojik reaktifler, d-galactozamin8, asetaminofen9, karbon tetraklorür10, thioacetamide11, Concanavalin A12, lipopolysaccharide13 gibi birçok hepatotoxins tarafından yapmak için , vs., kullanılmıştır. Bu listeden her reaktif AHF için benzersiz bir özellik kümesi oluşturur, ancak ne yazık ki yok tek reaktif insan AHF taklit eder. Ayrıca, hepatotoxins tarafından indüklenen AHF hayvanlar kronik stres altında koyar, uzun bir zaman alır ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek zordur.
Öte yandan, kısmi hepatectomy (PHx) cerrahi işlem beceri bağımlı ve tekrarlanabilir sonuçlar gerekli becerileri geliştirme sonra elde etmek kolaydır. Cerrahi müdahale yalnız AHF ikna etmek için daha--dan %70 karaciğer rezeksiyonu gereklidir; Ancak, bir % 70 hepatectomy hala engraftment ve yaygın eğitim için yararlı olabilir daha az tedavi kapasitelerini karaciğer hasarı14sırasında analiz etmek için karaciğer hücrelerinde nakledilmektedir. Hepatositlerin nakli karın zarını15, kuyruk damar16, hepatik ven17veya18dalak aracılığıyla gerçekleştirilen yazı hepatectomy olmuştur. Yeniden oluşturmak daha kolay olduğu gibi şu anda, hepatik ven infüzyon ve tetkikine intrasplenic nakli tercih edilen, işlemlerdir.
Bu yazıda, bir yordam için % 30 kısmi hepatectomy düğümde anlatmıştık. SCID (BAŞINI SALLAMAK. CB17-Prkdcscid/J) içinde karaciğer sol lob eksize fareler. Bu nakli 0,2 milyon GFP ifade fare (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) tetkikine hem de insan kaynaklı NeoHep19 dalak içinde izler. Bu yordamı karaciğer nakledilen hücrelerinin engraftment yol açar. Bu yordam az invaziv ve en az acı veren bir teknik olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol için sunulan yordamları kurumsal hayvan etik komite tarafından Ulusal Enstitüsü İmmünoloji, Yeni Delhi onaylanmış olması. IAEC #319/13. onayı seri referans numarasıdır
Not: Genel cerrahi prosedürler20 ve kemirgen cerrahi21belirli iletişim kuralları üzerinde mükemmel kaynakları vardır. O hayvan ameliyatı: ilk kez, bu kapsamlı bir şekilde pratik cerrahi mankenleri üzerinde hayvanlar üzerinde çalıştırmadan önce tavsiye edilir.
1. hazırlık
- Deney öncesinde, steril fosfat tamponlu tuz (PBS) veya serum fizyolojik hazır tutun.
- Makas, tırtıklı forseps, doku forseps, pamuk, pamuk tomurcukları, naylon konuları ve farklı mikro iğne tutucular içeren bir cerrahi seti bir araya getirin. Otoklav cerrahi seti. Özel bir bağışıklık şaibeli NOD Eğer özen gösterilmelidir. SCID fare iletişim kuralında dahildir.
- Deneysel yordamın tamamı, ameliyat sonu için hazırlık gerçekleştirmek, biyo güvenlik sınıf ı kabine.
- Bir NOD tartın. 6-8 hafta ameliyat öncesi eski SCID fare. Fareler arasında 14-18 g ağırlığındaki bu çalışmada kullanılır.
- Fare üst orta ve hastalık karın bölgesi ile saç düzeltici tıraş. Saç kremi bölgenin tümünde eşit bir spatula ile tamamen kesilmiş kıllar kaldırmak için kaldırma uygulanır. 2-5 dakika sonra bir parça steril ıslak pamuk yardımıyla hafifçe tüyleri.
- Fareyi isoflurane odasında getirin ve oksijen silindir kapak kilidini. Oksijen akışı 4 L/dk hızında ve anestezi ikna etmek için % 4 isoflurane buharlaşma korumak.
- Fare düzgün nazik parmak pinching tarafından anestezi ki emin olun.
- Bir ameliyat kartını bir biyogüvenlik içinde kabine yerleştirin. Hayvan cerrahi gemide, öyle ki fare ventral kısmı yukarı gelecek şekilde ve fare ön kısmını isoflurane ve oksijen kaynağına bağlı burun konisi içinde yerleştirilir yerleştirin.
- % 2 isoflurane buharlaşma azaltmak ve cerrahi işlem sürdürmek.
- Fare cilt dezenfekte ve steril % 70 etanol batırılmış pamuk ile silerek sterilize.
2. cerrahi müdahale
-
Kısmi Hepatectomy
- Xiphoid süreci ve göğüs kafesi, paralel düz işletim makas yardımıyla yaklaşık 1 cm enine bir kesi derinin hemen altında göğüs kemiği, dik olun.
- Yavaşça forseps veya cilt ve karın kas katmanı birbirinden ayırmak için steril ıslatılmış pamuk ipuçları ile kazıma alanı çevresinde karın kas tabaka ile bağlı cilt ayırın. İntradermal bölge kuruma kaçınmak için steril pamuklu ipuçları kullanma PBS ile ıslatın.
- Sol lob alan sorunsuz hemen altındaki xiphoid Periton katmanı yoluyla enine bir kesi yaparak ortaya çıkarmak. İki ıslatılmış pamuk ipuçları ortaya çıkarmak ve karaciğer sol lob kaldırmak için kullanın.
- Kesme karın tarafında pamuk uçlarından birini yerleştirin ve başka pamuk uç diyafram tarafında yer. Yavaşça doğru diyafram yerleştirilen bastırın ve karaciğer sol lob kaldırmak için sürgülü diğer ucunu tarafından ayır.
- Naylon iplik kaldırdı sol lob bir döngü ile kayma ve döngü hilus yakın sol lob Bankası mikro-forseps veya pamuk ipuçları yardımıyla doğru kaydırın. Yavaşça sol lob tabanına naylon iplik döngü itin.
- Mikrocerrahi iğne bağı ve mikro forseps kullanarak sol lob üst üzerinde naylon iplik iki ucu kravat. İki ek knot diğer tarafında yapmak.
- Bir makas yardımı ile bağlı LOB incelemek. Çok yakın iplik kesmeye çalışmayın. Yordamı daha fazla 5 dakika sürer, Periton boşluğu ve organları ile kuruma sıvı kaybı nedeniyle önlemek için steril PBS nemli tutun.
- Karın zarını tarafından sürekli dikiş kullanarak 4-0 akorduna dikiş dikmek. Daha sonra cilt tarafından sürekli dikiş kısa zamanda kapatın.
-
Hücre transplantasyonu
Not: GFP ifade tetkikine transgenik GFP fareler izole edildi (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), Lee ve arktarafından açıklanan yordamı göre. 22 ve Shen ve ark. 23 Hepatosit benzeri hücreler (NeoHep) insan kaynaklı monosit24 ayrıştırılan Ayrıca ekimi için kullanılmıştır. Ancak, herhangi bir diğer kaynaklardan elde hücreleri de protokol kullanılabilir.- 0,2 milyon hücrelerin yaklaşık 50 µL Iscove'nın modifiye Dulbecco'nın orta (IMDM) içinde askıya alma ve 1 mL insülin şırınga 30 G iğne ile şapkalı içinde Aspire edin. Şırınga buza koyarak soğuk tutmak.
- Fare sol yanal bölümü ameliyatı gerçekleştiren kişi doğru yukarı dönük bir şekilde yerleştirin. Dalak alanını belirlemek ve kemiği cilt sadece dalak ortaya çıkarmak için Periton katmanı üzerinden kısa bir kesi ardından evhamlı bölge yakınındaki incelemek.
- Yavaşça dalak kaldırın ve dışarı kavite iki PBS yardımı ile ıslatılmış pamuk ipuçları tutun.
- Dalak dikkatle iki pamuk ipuçları ile bir elinde tutmak ve şırınga iğne tam olarak dalak için dikey yerleştirin. Yavaşça dalak işlemek ve iğne itmek çok yavaş içinde; İğneyi 2 mm'den daha derin almak gerekir.
- Şırınga piston yavaş yavaş hücreleri dalak enjekte için itin. Ekimi sonra iğne şırınga sabit tutmak ve yavaş yavaş kanama önlemek için dalak veya hücrelerinin kaybı kaldırma.
- Dalak pamuk ipuçları ile Periton boşluğu içine geri koyduktan sonra Periton tabakası sürekli ile 4-0 akorduna Dikiş dikiş tarafından kapatın. Cilt aralıklı ile aynı dikiş dikmek. Cilt kapanış için yara klip kullanmaktan kaçının; Bunun yerine, 4-0 dikiş tarafından kapatın. Yara klip fare doğal hareket kısıtlayabilir ve kez klipleri gevşek olmak ve hızlı bir şekilde ortaya çıkıyor.
3. ameliyat sonrası bakım
- Cilt kapattıktan sonra her iki dikiş site steril pamuklu ipucu kullanarak iyot solüsyonu (betadin) çevresi silin.
- 600 mg/kg vücut ağırlığına (genellikle 100 µL serum/fare içinde 12 mg sefotaksim) intraperitoneally gibi bir doz antibiyotik sefotaksim enjekte 1 mL şırınga kullanarak.
- Analjezik Meloksikam günlük doz 1 mg/kg hayvanın vücut ağırlığı (genellikle 12 µg Meloksikam 100 µL serum/fare içinde) intraperitoneally, ameliyattan sonra üç güne kadar ver.
- Ameliyat tamamlanması sonra isoflurane gaz akışını durdurmak ve tek tek havalandırılmış kafesine döndü fareyi getirin.
4. euthanization ve karakterizasyonu
- Deneysel endpoints sonra (1 gün ve 10 gün sonrası cerrahi), kurumsal hayvan etik kurallarına göre fareler ötenazi.
- Kan ölümcül oküler terminal pleksus delinme hayvanlar, kanama tarafından toplamak.
- Serum kandan yalıtmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
% 30 kısmi hepatectomy sonra Hepatosit nükleer silahların yayılmasına karşı: Yayılması içinde kalan hepatositlerin % 30 hepatectomy sonra karaciğer Hücre proliferasyonu avans, Ki-67 boyama immunohistokimyasal (IHC) tarafından incelenmiştir. Bir gün sonrası hepatectomy, fareler ötenazi, kalan karaciğer lobları eksize ve parafin kesitler elde. Bölümleri ile Ki-67 antikor, horseradish peroksidaz (HRP) konjuge ikincil antikor ile etiketleme tarafından takip lekeli. Di-Amino Benzidine (DAB) substrat HRP için kahverengi renk geliştirme için lekeli hücrelerini tanımlamak için kullanılan. Çekirdek Hematoksilen ile lekeli ve 20 X objektif mikroskop altında görüntülenen çalışıyordum. Şekil 1 bir karaciğer bir bölüm temsilcisi IHC görüntüsünü gösterir. Yaklaşık %13 hücre (13.66 ± 0.317, N = 3) Ki-67 idi pozitif, % 30 hepatectomy tetkikine fare karaciğer yayılması kolaylaştırır doğruladı.
Anatomik çalışma: Temsil edici bir görüntü bir NOD karaciğer. SCID fare, 10 gün sonrası hepatectomy Şekil 2' de gösterilmiştir. Bu görüntü kalan karaciğer hiçbir görünür anomalileri ile sağlıklı olduğunu doğruladı.
Varlığı cerrahi ilk bir saati sırasında transplante hücre: Transplante hücre posta akış sitometrik analizi ile 2 saat sonra nakli GFP olumlu tetkikine varlığı incelenerek teyit edildi.
Çıkarılan doku Enzimatik sindirim deftere naklettikten sonra 2 saat-in GFP tetkikine ekimi bir tek hücre süspansiyon dalak ve karaciğer ana bilgisayar fare elde edildi. Transplante GFP pozitif hücrelerinin yüzdesi bir Akış Sitometresi kullanarak tahmin edilmiştir. Bir dağılım kapı enkaz ve tamamen hücreleri ortadan kaldırmak için karşılık gelen FSC-SSC nokta arsa seçildi. Arsa çeyreği kapısı dalak ve karaciğer içinde hiçbir hücre nakli bir denetim fare elde edilen hücre süspansiyonlar arka plan fluorochrome yoğunluğunu tarafından oluşturuldu. Yaklaşık %1,7 GFP olumlu tetkikine dalak içinde bulundu ve hiçbir GFP tetkikine içinde karaciğer nakli sonra 2 saat bulundu. Temsilcisi veri şekil 3' te gösterilmektedir.
İmmünhistokimya: On gün ameliyat sonrası, fareler euthanized ve şu yan lob, sağ orta LOB ve sol mediyal karaciğer lobları eksize ve cryo-kesit gerçekleştirilen 5 µm bölümler elde etmek için. Bu bölümlerde o zaman için belgili tanımlık posta ve Transplante hücrelerinin engraftment incelenmiş. Şekil 4 immunohistokimyasal (IHC) temsilcisi görüntülerini anti-fareler tetkikine (paneli A, Bve C); ifade GFP tanımlamak için GFP karşı (kırmızı) Boyama gösterir ve karşı anti-insan albumini (kırmızı), hem de anti-insan connexin 32 (yeşil), Hepatosit benzeri hücreler (NeoHep) insan kaynaklı tanımlamak için ( D, E, Fve Gpaneli). Çekirdek ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, mavi) her iki durumda da counterstained. Bu görüntü panellerinde birkaç engrafted GFP tetkikine (paneli A, Bve C) ve NeoHep ( D, E, Fve Gpanel) ifade açıkça görülebilir.
Karaciğer biyokimyasal analiz salgılanan enzimler: Cerrahi işlem sonrası karaciğer işlevini denetlemek için farklı karaciğer salgılanan enzimler biyokimyasal analizini gerçekleştirildi. Şekil 5 çubuk grafiklerde aspartat aminotransferaz (AST), alanin aminotransferaz (ALT) ortalama değerini temsil ve alkalen fosfataz (ALK PHOS) sağlıklı NOD serum. SCID fareler ve kısmen hepatectomized farelerin farklı grupları. Hepatectomy 1 gün sonra AST, ALT ve ALK PHOS enzim düzeyleri önemli ölçüde, sağlıklı fare ile karşılaştırıldığında arttı grafik dan açıktır.
Yüksek kaldı ALK PHOS düzeyleri sigara nakledilen farelerde on gün ameliyat sonrası ise ALT ve AST enzim düzeyleri normale, geri yüklendi. Ancak, tüm üç enzim düzeyleri normal transplante farelerde 10 gün sonra düştü.
Karaciğer histolojik çalışma: Hepatectomized ve Transplante fare karaciğer örnekleri daha fazla anatomik değişiklikler ameliyat sonrası çalışmaya histolojik analiz işlendi. Şekil 6 temsilcisi parlak alan kısmi hepatectomy sonrası ameliyatsız, sağlıklı farelerin karaciğer bölümler 1 gün lekeli görüntüleri Hematoksilen ve Eozin (H ve E) ve 10 gün kısmi hepatectomy ve NeoHep transplantasyonu sonrası gösterir. Bu görüntüler, karaciğer hasarı nedeniyle hafif peri safra fibrozis ya da bağ dokusu proliferasyonu kısmi hepatectomy 1 gün sonra gözlendi ve hiçbir anormallik on gün ameliyat sonrası gözlendi.
Resim 1 : Ki-67 NOD boyama temsilcisi bir görüntü. 1 gün sonra SCID karaciğer bölümünü % 30 hepatectomy. Bölüm ile Ki-67 antikor lekeli, horseradish peroksidaz (HRP) ikincil antikor, Birleşik ve DAB (kahverengi) HRP substrat kullanıldı ve çekirdekleri Hematoksilen (mavi) tarafından counterstained. Gösterge ok uçları Ki-67 pozitif (kahverengi) hücrelerinin bir kısmını üzerine gelin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Bir NOD karaciğer lobları yeniden. SCID fare 10 gün ameliyat sonrası. A: kaudat LOB (kaudat işlemi), B: sağ yan lob, C: sağ orta LOB, D: yaptı orta LOB, E: kalp, kalan F: G: kaudat LOB (Papiller işlem) ve sol yan lob hepatectomy sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : GFP olumlu fare heptatocytes dalak ve karaciğer bir nod yüzdesi. SCID fare. Üst panelleri içinde hiçbir hücre nakli yaş eşleşen kontrol fare hücre profilini göster. Alt panelleri GFP Hepatosit hepatectomized Mouse 2 saat sonra hücre profilini göster. Parsel y ekseni bir günlük ölçekte rasgele birimleri cinsinden floresan yoğunluğu GFP (FITC kanal) gösterir ve x ekseni doğrusal bir ölçek üzerinde rasgele birimlerindeki ileri dağılım (FSC) gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Fare tetkikine ve NeoHep rejenere ana bilgisayar karaciğerde ifade transplante GFP posta. Kısmen hepatectomized karaciğer kesimlerinin temsilcisi görüntüleri SALLA. Hücre engraftment gösterilen ve homing GFP olumlu fare tetkikine (A-C), nakledilen SCID fare. Paneli A: çekirdeği (mavi: DAPI), Panel B: anti-GFP (kırmızı: Alexa Fluor 594), Panel C: birleştirilmiş görüntü. Paneller (DG) kısmen hepatectomized NOD karaciğer bölümünü göster. Hangi NeoHep SCID fare nakledilmektedir. Paneli D: çekirdeği (mavi: DAPI), Panel E: insan anti-Connexin 32 (yeşil: Alexa Fluor 488), Panel F: insan anti-Albumin (kırmızı: Alexa Fluor 594) ve Panel G: birleştirilmiş görüntü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Biyokimyasal analiz farklı karaciğer salgılanan enzimler fareler Serumda. Sütun çubuklar farklı enzimleri (AST/SGOT, ALT/SGPT, ALK PHOS) ortalama değerlerini gösterir. Ameliyat sonrası çalışma süresi noktası X ekseni üzerinde görünür. Kontrol grubunda vardı yaş eşleşen başını SALLAMAK. SCID fareler ve ameliyat uygulandı. Hata çubukları anlamına gelir demek, N = 3 standart hatası ve * pbelirtir < 0,05, NS gösterir Sigara önemi, p> 0.05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Fare karaciğer doku bölümleri histopatolojik incelenmesi. Hematoksilen ve Eozin (H ve E) temsilcisi parlak alan mikroskobu görüntülerini NOD bölümlerini karaciğer dokusu lekeli. 20 X objektif lens altında SCID fareler. Paneli A karaciğer bir bölümü sağlıklı bir NOD göstermektedir. Herhangi bir ameliyat olmadan aynı yaştaki SCID fare. Panel B karaciğer Bölüm 1 gün sonrası kısmi hepatectomy gösterir. Bu görüntüde, ok uçları hafif peri-billiary fibrozis ya da bağ dokusu proliferasyonu bölge gösterir. Bir karaciğer Bölüm 10 gün sonrası kısmi hepatectomy ve hücre nakli paneli C gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kısmi hepatectomy soruşturma karaciğer rejenerasyonu için kurulan bir tekniktir ve aşırı hepatectomy AHF modeli taklit etmek için bildirilir. Hayvan AHF arasında kemirgenler, özellikle fareler, en araştırılmış modeli modellerdir. % 70 hepatectomy kadar farelerde karaciğer yaralanma modeli elde etmek için bir iyi hayatta kalma oranı25,26' bildirilmiştir. Ancak çıplak ve diğer immünyetmezligi fare, % 70 hepatectomy ölümcül olarak bildirilmiş ve hayvanlar 24 saat27içinde öldü.
Mitchell ve Willenbring28 2/3 kısmi hepatectomy farelerde için tekrarlanabilir ve iyi tolere yöntemi gösterdi. İçin başını SALLAMAK. SCID fareler, biz % 100 sağkalım oranı elde hepatectomy toplam karaciğer kütlesinin % 30 yakın sol karaciğer LOB rezeksiyonu kadar sınırlı. Doğrultusunda gözlemler çıplak fareler27, herhangi daha fazla düğümde hepatectomy yüzdesi olarak artış gözlendi. SCID fare hayatta kalma oranı dramatik düşürülmesi için yol açar. Ayrıca, hızla çoğalmak-in içinde kalan Hepatosit karaciğer lobları sonrası % 30 kısmi hepatectomy 1 gün ekimi ve engraftment çalışmalar bu yordamda yardımcı doğruladı.
Daha yeni bir yazıda, Ahmed S.Ü vd. 29 intrahepatic Hepatosellüler karsinom xenografts immünyetmezligi farelerde için bir yordam göstermiştir. Onlar hepatectomy intrahepatic engraftment kolaylaştırmak için gerçekleştirilen ve dalak dahil olmak üzere çeşitli organlarda tümör hücrelerinin nakli için bir yordam göstermiştir.
Mitchell28 ya da Ahmed29tarafından bildirilen yordamlar, bir fırsat olduğunu iyileştirmeler için daha küçük kesik, gibi daha küçük kesiler genellikle cerrahi tercih yaparak. Daha küçük bir uzunluk cerrahi kesi stres hormonu kortizol ve katekoiamin gibi daha az salgılanması yol açar kanıt30 vardır. Ayrıca, bir daha büyük kesi ile ilgili yordamları yüksek beceri gerektiren ve iki küçük kesiler sahip yordamlar için karşılaştırıldığında daha yeniden oluşturulması zor olan bulduk.
Bu kağıt içinde en az kesi karaciğer sol lob ortaya çıkarmak için gerekli bir yordam tarif var ve % 30 hepatectomy yaptıktan sonra başka bir küçük kesi nerede hücreleri implante edildi dalak ortaya çıkarmak için yapıldı. Bu yordam herhangi bir özel cerrahi beceri gerektirmez ve 5-7 dakika içinde tamamlanabilir. Ayrıca, herhangi bir morfolojik veya anatomik anormallik bulgusuna kalan karaciğer kitle olarak histolojik çalışmalar kanıtladığı bulduk. Ayrıca, 6-8 hafta cerrahi işlem sırasında iskemi veya nekroz olmayışı vardı-eski bağışıklık uzlaşma fareler. Kısmi hepatectomy karaciğer enzimleri AST, ALT ve ALK-PHOSin fareler serum düzeyleri tarafından onaylandıktan sonra karaciğer hasarı indüksiyon. Portal Venöz sistem Venöz diğer sistemlere göre daha yüksek erişilebilirlik içine karaciğer korteks olduğundan intrasplenic bir rota üzerinde Venöz diğer yollar, hücre transplantasyonu için seçildi. Transgenik GFP fareden izole tetkikine nakli göstermiştir ve kısmen hepatectomized başını SALLAMAK içinde insan kaynaklı Hepatosit benzeri hücreler olan NeoHep farklı. SCID hayvanlar. Yordamı nakli için kullanılan hücre türü kısıtlamaz.
Ancak, bu yordamı yalnızca % 30 kısmi hepatectomy uyguladıkları bir fare AHF koşulu oluşturmaz. Bu sınırlı hepatectomy proliferatif potansiyeline tetkikine kalan karaciğerde engraftment için böylece transplante tetkikine için ek fırsatlar sağlayan mevcut sağlar. Bu sadece gösterir geçiş ve engraftment tetkikine ve NeoHep dalak karaciğere ve hiçbir ek hasar karaciğere nakli yordam tarafından gerçekleştirilen.
Her yerinde, bu yordam basittir ve uygulanan ve kolayca tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için hakim. Birkaç hücresel kaynakları (kök hücre veya Hepatosit benzeri hücreler) karaciğer hasarı veya karaciğer rejenerasyonu çalışma bağlamında yeniden üretim potansiyelini kolayca bu cerrahi işlem ile değerlendirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Bölümü Biyoteknoloji, Hindistan hükümeti Ulusal Enstitüsü İmmünoloji, Yeni Delhi için alınan çekirdek grant tarafından desteklenmiştir. Dr. Bhattacharjee'nın şu anki adresim mı bölümü Gastroenteroloji, Hepatoloji ve beslenme, Çocuk Hastanesi Los Angeles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase's analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure? Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , http://www.who.int/surgery/publications/s16383e.pdf (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
