Summary
Vi har beskrivit ett protokoll för att utföra partiell hepatectomy (PHx) och stamcellstransplantation via mjälte i NOD. SCID (NICKA. CB17-Prkdcscid/j) möss. I detta protokoll snitt ett att exponera och resect den vänstra LOB i levern följt av ett annat snitt för intrasplenic transplantation av celler.
Abstract
Partiell hepatectomy är en mångsidig och reproducerbar metod att studera lever regenerering och effekten av cellbaserade therapeutics i olika sjukdomstillstånd. Partiell hepatectomy underlättar också ökad engraftment och spridningen av transplanterade celler av accelererande kärlnybildning och cellmigration mot levern. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för utför 30% hepatectomy och transplantation av celler i mjälten hos en icke-feta diabetiker/svår kombinerad nedsatt immunförsvar nicka. SCID (NICKA. CB17-Prkdcscid/j) mus.
Två små snitt görs i den här proceduren. Första snittet är att exponera och resect den vänstra LOB i levern, och en annan liten snitt att exponera mjälte för intrasplenic transplantation av celler. Detta förfarande kräver inte någon specialiserad kirurgisk kompetens, och det kan fyllas i 5-7 minuter med mindre stress och smärta, snabbare återhämtning och bättre överlevnad. Vi har visat transplantation av hepatocyter som isolerats från ett grönt fluorescerande protein (GFP) uttrycker mus (transgena C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) samt hepatocyte liknande celler av mänskligt ursprung (NeoHep) i delvis hepatectomized nicka. SCID möss.
Introduction
För närvarande föreslås hepatocyte transplantation som ett alternativ till hela organtransplantation för behandling av patienter med allvarliga leversjukdomar. Man tror att det kan överbrygga patienter till hela organtransplantation1. Förutom de prövningar hepatocyter2utreds xenogen hepatocyter3 och hepatocyter härrör från stamceller4 också i djurmodeller. I detta sammanhang, homing och engraftment är potential de transplanterade cellerna i mottagaren ett viktigt kriterium för cellterapi baserat i akut leversvikt (AHF).
För att utreda transplantation av hepatocyter eller hepatocyte-liknande celler5, skapas AHF i en djurmodell av kirurgiska6 eller farmakologiska7 förfaranden, följt av omplantering celler. Att göra en AHF djurmodell av farmakologiska reagenser, många hepatotoxins såsom d-galactosamine8, paracetamol9, koltetraklorid10, thioacetamide11, Concanavalin A12, lipopolysackarid13 , osv., har använts. Från den här listan varje reagens genererar en unik uppsättning funktioner för AHF, men tyvärr ingen enda reagens härmar den mänskliga hushållsfolie av aluminium. Dessutom den hushållsfolie av aluminium som induceras av hepatotoxins tar lång tid, som sätter djur under kronisk stress, och reproducerbara resultat är svårt att få.
Däremot, det kirurgiska ingreppet av partiell hepatectomy (PHx) är färdighet beroende och reproducerbara resultat är lätt att få efter att ha utvecklat färdigheter som krävs. För att inducera AHF av kirurgiska ingrepp ensam, krävs resektion av mer än 70% av levern; dock transplanterade mindre än en 70% hepatectomy kan fortfarande användas för att studera engraftment och spridning av celler i levern för att analysera deras terapeutiska kapacitet under leverskador14. Transplantation av hepatocyter har varit utförda post hepatectomy genom bukhinnan15, svans ven16, nedsatt ven17eller mjälte18. För närvarande är nedsatt ven infusion och intrasplenic transplantation av hepatocyter Rekommenderad förfarandena, eftersom de är lättare att reproducera.
I detta papper, har vi beskrivit ett förfarande för en 30% partiell hepatectomy i NOD. SCID (NICKA. CB17-Prkdcscid/J) möss där den vänstra LOB i levern Bolts. Det följs av transplantation av 0,2 miljoner GFP uttrycker mus (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) hepatocyter samt mänskligt ursprung NeoHep19 i mjälten. Detta förfarande leder till engraftment av de transplanterade cellerna i levern. Detta förfarande är den minst invasiva och en minimalt smärtsamt teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfaranden som presenteras i detta protokoll har godkänts av den institutionella djur etiska kommittén av den nationella Institute of Immunology, New Delhi. Seriell referensnumret för godkännande är IAEC nr 319/13.
Obs: Det finns utmärkta resurser den allmän kirurgi förfaranden20 och särskilda protokoll för gnagare kirurgi21. För de som gör djur kirurgi för första gången, är det rekommenderat att omfattande praxis kirurgiska ingrepp på dummies innan på djur.
1. beredning
- Innan experimentet, hålla steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller saltlösning redo.
- Montera en kirurgi kit innehållande sax, tandad tång, vävnad pincett, bomull, bomullspinnar, nylontrådar och olika mikro nålförare. Autoklav kirurgi kit. Särskild försiktighet bör iakttas om en nedsatt immunförsvar nicka. SCID mus ingår i protokollet.
- Utför komplett experimentella förfarandet, från förberedelse till slutet av kirurgi, bio-säkerhet klass I skåpet.
- Väg en nick. SCID mus på 6-8 veckor gamla innan operationen. Möss som väger mellan 14-18 g används i denna studie.
- Raka övre centrala och hypokondriker buken regionen av musen med den hår trimmern. Tillämpa hår att ta bort krämen jämnt i hela regionen med en spatel för att helt ta bort klippta hårstrån. Ta bort håren försiktigt med hjälp av en bit av vått sterilt bomull efter 2-5 min.
- Placera musen i isofluran kammare och låsa upp ventilen av syre cylindern. Upprätthålla syreflödet uppgå till 4 L/min och den isofluran förångning vid 4% att inducera anestesi.
- Se till att musen har varit sövd ordentligt av mild tå klämmande.
- Placera en kirurgi styrelse inuti en biosäkerhet skåp. Placera djuret i kirurgi styrelsen, så att den ventrala delen av musen är vänd uppåt och den främre delen av musen är placerad inuti näsan konen ansluten till isofluran och syre leverans.
- Minska den isofluran förångning till 2% och bibehålla den under hela ingreppet.
- Desinficera huden av musen och sterilisera det genom att torka med 70% etanol indränkt sterila bomull.
2. kirurgiska ingrepp
-
Partiell Hepatectomy
- Göra en tvärgående snitt omkring 1 cm i huden precis under bröstbenet, vinkelrätt till xiphoid process- och parallellt med bröstkorgen, med hjälp av raka operativa sax.
- Försiktigt separera huden fäst med magmuskelstation lagret i närheten av anskäras med pincett eller steril fuktad bomull tips att skilja mellan huden och magmuskelstation lager. Blötlägg intradermala regionen med PBS använder sterila bomull tips för att undvika uttorkning.
- Utsätta området i den vänstra loben smidigt genom att göra en tvärgående snitt genom peritoneal lagret precis under xiphoid. Använd två fuktad bomull tips att exponera och lyft den vänstra LOB i levern.
- Placera en av bomull tips på buken sida av snittet, och placera en annan bomull spets på membranen sida. Försiktigt trycker du placerade mot mellangärdet, och ge ett glidande tryck av andra tipset att lyfta den vänstra LOB i levern.
- Glida en nylontråd med en slinga genom den lyft vänster LOB, och skjut slingan mot basen av den vänstra loben nära hilum med hjälp av mikro-pincett eller bomull tips. Tryck försiktigt ner en nylon tråd slinga till basen på den vänstra loben.
- Knyt båda ändarna av nylontråd över toppen av den vänstra loben som använder en microsurgery nålförare och micro tången. Gör två ytterligare knutar på andra sidan.
- Dissekera ut på bundet LOB med hjälp av sax. Försök inte att skära mycket nära tråden. Om förfaranden som varar mer än 5 min, håll bukhålan och organ fuktig med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning att undvika uttorkning på grund av vätskeförlust.
- Sy bukhinnan fortlöpande suturering med en 4-0 katgut sutur. Stäng därefter huden av diskontinuerlig suturering så snabbt som möjligt.
-
Stamcellstransplantation
Obs: De uttrycker GFP-hepatocyterna isolerades från transgena GFP möss (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), enligt proceduren som beskrivits av Lee et al. 22 och Shen et al. 23 hepatocyte-liknande celler (NeoHep) av mänskligt ursprung åtskilt från monocyter24 användes också för transplantation. Celler som härrör från andra källor kan dock också användas i protokollet.- Upphäva 0,2 miljoner viabla celler i omkring 50 µL av Iscoves modifierade Dulbecco's Medium (IMDM) och sug upp det i en 1 mL insulinspruta utjämnade med 30G nål. Förvara sprutan kall genom att placera det på is.
- Placera musen på ett sätt som den vänstra laterala delen vänd uppåt mot den person som utför kirurgi. Identifiera området mjälten och tvären dissekera huden nära regionen hypokondriker, följt av ett kort snitt genom peritoneal lagret bara för att exponera mjälte.
- Försiktigt lyft mjälte och håll den utanför hålrummet med hjälp av två PBS fuktad bomull tips.
- Håll mjälte noggrant med två bomull tips i ena handen och placera nålen på sprutan exakt vertikal till mjälten. Försiktigt pierce mjälte och tryck nålen mycket långsamt inuti; nålen ska inte få djupare än 2 mm.
- Tryck kolven i sprutan sakta att injicera cellerna i mjälten. Efter transplantation, hålla nålen på sprutan stabila och ta bort det långsamt från mjälte att undvika blödning eller förlust av celler.
- Efter att placera mjälte tillbaka in i bukhålan med bomull tips, Stäng peritoneal lagret av fortlöpande suturering med en 4-0 katgut sutur. Sy huden diskontinuerligt med samma suturen. Undvik att använda såret klipp för att stänga hud; i stället stänga den genom en 4-0 sutur. Såret klippen begränsa den naturliga rörelsen av musen, och ofta klipp lossna och komma ut snabbt.
3. postoperativ vård
- Efter stängning huden, torka omgivningen både suturen webbplatser med jodlösning (betadine) med hjälp av en steril bomull spets.
- Injicera en dos antibiotika cefotaxime som 600 mg/kg kropps vikt (normalt 12 mg cefotaxime i 100 µL av saltlösning/mus) intraperitonealt med 1 mL spruta.
- Ge dagliga doser av smärtstillande meloxikam som 1 mg/kg kroppsvikt (normalt 12 µg meloxikam i 100 µL av saltlösning/mus) till djuret intraperitonealt, för upp till tre dagar efter operationen.
- Efter slutförandet av operationen, stoppa flödet av isofluran gas och Placera musen tillbaka i individuellt ventilerade buren.
4. dödshjälp och karakteriseringar
- Efter de experimentella slutpunkterna (1 dag och 10 dagar efter operationen), eutanasi möss enligt riktlinjerna som institutionella djuretik.
- Samla in blod av obotligt blödning djuren, punktera den okulära terminal plexus.
- Isolera serum från blodet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocyte spridning efter 30% partiell hepatectomy: Spridningen av hepatocyter i den resterande lever efter 30% hepatectomy undersöktes genom immunhistokemisk (IHC) färgning för en cell spridning markör, Ki-67. Endags-post hepatectomy, mössen var euthanized, resterande lever loberna var censurerade och paraffin avsnitt erhölls. Avsnitten var fläckad med Ki-67-antikropp, följt av märkning med pepparrotperoxidas (HRP) konjugerade sekundär antikropp. Di-Amino benzidin (DAB) användes som substrat för HRP för utveckling av brun färg för att identifiera färgade celler. Kärnan var counter färgas med hematoxylin och tittade på en 20 X objektiva Mikroskop. Figur 1 visar en representativ IHC-bild av en lever avsnitt. Omkring 13% av celler (13.66 ± 0.317, N = 3) var Ki-67 positiv, vilket bekräftade att en 30% hepatectomy underlättar spridningen av hepatocyter i mus levern.
Anatomiska studie: En representativ bild av levern en nod. SCID mus, 10 dagar post hepatectomy visas i figur 2. Denna bild bekräftas att återstående levern var frisk med inga synliga avvikelser.
Förekomst av transplanterade celler under första timmen av operation: Homing av de transplanterade cellerna bekräftades med flöde flödescytometrisk analys genom att undersöka förekomsten av GFP positiva hepatocyter 2 timmar efter transplantation.
En enda cellsuspension erhölls från mjälten och levern värd musen efter enzymatisk nedbrytning av exciderad vävnad efter 2 timmar av GFP-hepatocyter transplantation. Procentuella andelen transplanterade GFP positiva celler uppskattades med hjälp av en flödescytometer. En scatter gate valde från motsvarande FSC-SSC dot tomten att eliminera skräp och doublet cellerna. Kvadrant grinden till tomten skapades av bakgrunden fluorokrom intensiteten av cellsuspensioner erhållits från mjälten och levern av en kontroll mus där inga celler transplanterade. Cirka 1,7% GFP positiva hepatocyter hittades i mjälten, och ingen god Jordbrukarsed hepatocyter hittades i levern 2 timmar efter transplantation. Representativa uppgifter visas i figur 3.
Immunhistokemi: Tio dagar efter operationen, mössen var euthanized, och den rätt laterala loben, den höger mediala loben och vänster mediala loberna av levern var censurerade och cryo-snittning utfördes för att få 5 µm sektioner. Dessa avsnitt undersöktes sedan för homing och engraftment av de transplanterade cellerna. Figur 4 visar de representativa bilder av immunhistokemisk (IHC) färgning mot anti-GFP (röd) att identifiera de GFP uttrycker möss hepatocyter (panel A, Boch C); och mot anti-humant albumin (röd), samt anti-humant connexin 32 (grön), för att identifiera hepatocyte-liknande celler (NeoHep) av mänskligt ursprung (panel D, E, Foch G). Kärnan var counterstained med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI, blå) i båda fallen. I dessa paneler av bilden syns tydligt några engrafted GFP uttrycker hepatocyter (panel A, Boch C) och NeoHep (panel D, E, Foch G).
Biokemisk analys av levern utsöndras enzymer: För att kontrollera funktionaliteten i levern efter det kirurgiska ingreppet, utfördes biokemiska analyser av olika leverenzymer utsöndrade. De bar diagrammen i figur 5 representerar medelvärdet av aspartataminotransferas (ASAT), alaninaminotransferas (ALAT) och alkalisk fosfatas (ALK-PHOS) i serum hos friska nicka. SCID möss och olika grupper av delvis hepatectomized möss. Det framgår av diagrammet att efter 1 dag av hepatectomy, ASAT, ALAT och ALK-PHOS enzymer ökat avsevärt, jämfört med de friska möss.
ALAT och ASAT enzymet nivåer har återställts till det normala, medan ALK-PHOS nivåer förblev hög post tio dagar kirurgi i icke-transplanterade möss. Dock sjönk nivåerna av alla tre enzymer till normala hos transplanterade möss efter 10 dagar.
Levern histologisk studie: De lever proverna av hepatectomized och transplanterade möss bearbetades ytterligare för histologisk analys att studera den anatomiska förändringar efter operationen. Figur 6 visar fältet representativa ljusa bilder av hematoxylin och eosin (H och E) målat levern delar av friska möss utan kirurgi, 1 dag bokföra partiell hepatectomy och 10 dagar efter partiell hepatectomy och NeoHep transplantation. I dessa bilder, leverskador på grund av den milda peri-biliär fibros eller bindväv spridningen observerades efter 1 dag av partiell hepatectomy, och tio dagar efter operationen observerades inga avvikelser.
Figur 1 : En representativ bild av Ki-67 färgning av nicka. SCID lever avsnitt efter 1 dag av 30% hepatectomy. Avsnittet var målat med Ki-67 antikropp, pepparrotsperoxidas (HRP) konjugerade sekundär antikropp, och DAB (brun) användes som HRP substrat och kärnor var counterstained av hematoxylin (blå). De vägledande pilspetsarna peka på några av de Ki-67 positiva (bruna) cellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Regenereras lever lober av en NOD. SCID mus 10 dagar efter operationen. A: caudatus lob (caudatus process), B: höger laterala loben, C: höger mediala loben, D: lämnade mediala loben, E: hjärta, F: återstående vänstra laterala loben efter hepatectomy och G: caudatus lob (papillär process). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Andel av GFP positiva mus heptatocytes i mjälte och lever med en NOD. SCID mus. De övre panelerna visar cellen profilen av en ålder matchad kontroll mus där inga celler transplanterade. Lägre paneler visar cellen profilen efter 2 timmar av GFP hepatocyte transplantation i en hepatectomized mus. Y-axeln av tomterna betecknar fluorescensintensiteten hos GFP (FITC kanal) mätt i godtyckliga enheter på en log-skala, och x-axeln betecknar framåt scatter (FSC) i godtyckliga enheter på en linjär skala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Homing av transplanterade GFP uttrycker mus hepatocyter och NeoHep i regenererad värd levern. Representativa bilder av levern sektioner av en delvis hepatectomized nicka. SCID mus transplanteras med GFP positiva mus hepatocyter (A-C), visar cellen engraftment och homing. Panelen A: Nucleus (blå: DAPI), panelen B: anti-GFP (Red: Alexa Fluor 594), panelen C: sammanfogad bild. Paneler (D-G) Visa lever avsnitt av delvis hepatectomized nicka. SCID mus i vilken NeoHep transplanterades. Panelen D: Nucleus (blå: DAPI), panelen E: human anti-Connexin 32 (Green: Alexa Fluor 488), panelen F: anti humanalbumin (Red: Alexa Fluor 594) och Panel G: sammanfogad bild. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Biokemisk analys av olika levern utsöndras enzymer i möss serum. Kolumnen staplarna representerar medelvärdena av olika enzymer (ASAT/SGOT, ALT/SGPT, ALK-PHOS). Tidpunkten av studien efter operationen visas på X-axeln. I kontrollgruppen, fanns det år matchas nicka. SCID möss och ingen operation utfördes. Felstaplar beteckna standardavvikelsen för medelvärdet, N = 3 och * indikerar p< 0,05, NS indikerar icke-signifikans vid p> 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Histopatologiska studier av möss lever vävnadssnitt. Representativa ljusa fält mikroskopi bilder av hematoxylin och eosin (H och E) målat levervävnad delar av nicka. SCID möss under 20 X objektiv. Panel A visar ett lever avsnitt från en hälsosam nicka. SCID mus i samma ålder utan kirurgiska ingrepp. Panel B visar en lever avsnitt 1 dag efter partiell hepatectomy. Denna bild visar pilen huvuden regionen mild peri-billiary fibros eller bindväv spridning. Panel C visar en lever avsnitt tio dagar post partiell hepatectomy och cell transplantation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Partiell hepatectomy är en etablerad teknik för utredande lever regenerering och överdriven hepatectomy rapporteras att efterlikna AHF modellen. Bland djurmodeller av Hushållsfolie av aluminium är gnagare, särskilt möss, den mest utforskade modellen. För att erhålla en leverskada modell i möss, upp till en 70% hepatectomy har rapporterats med en bra överlevnad kurs25,26. Men i naken och andra nedsatt immunförsvar mus, en 70% hepatectomy rapporterades som dödlig och djur dog inom 24 timmar27.
Mitchell och Willenbring28 visat en reproducerbar och väl tolererad metod för 2/3 partiell hepatectomy hos möss. För nicka. SCID möss, fick vi en 100% överlevnad när hepatectomy begränsades upp till resektion av vänster lever LOB, som ligger nära 30% av den totala lever massan. I linje med synpunkter på naken möss27observerade vi att någon ytterligare ökning av andelen hepatectomy i NOD. SCID mus leder till en dramatisk sänkning av överlevnaden. Dessutom bekräftade spridningen av hepatocyter i den resterande lever lober inlägg 1 dag av 30% partiell hepatectomy nyttan av detta förfarande i transplantation och engraftment studier.
I ett senare papper, Ahmed S.U. o.a. 29 har visat ett förfarande för intrahepatisk Hepatocellulär cancer xenograft i nedsatt immunförsvar möss. De har visat ett förfarande för transplantation av tumörceller i olika organ, inklusive mjälte, och utförs hepatectomy för att underlätta intrahepatisk engraftment.
I de förfaranden som rapporterats av Mitchell28 och Ahmed29, finns det en möjlighet för förbättringar genom att göra mycket mindre snitt som mindre snitt är generellt att föredra i kirurgi. Det finns bevis30 som en mindre längd kirurgiska snitt leder till mindre utsöndring av stresshormoner, såsom kortisol och katekolaminer. Dessutom fann vi att förfaranden som inbegriper en större incision kräver en högre nivå av färdigheter, och är svårare att reproducera, jämfört med förfaranden att ha två mindre snitt.
I detta papper, blev vi har beskrivit ett förfarande där minsta snitt krävs att exponera den vänstra LOB i levern och, efter att ha utfört en 30% hepatectomy, ett annat litet snitt att exponera mjälten där celler var implanteras. Detta förfarande kräver inte någon specialiserad kirurgisk kompetens och kan fyllas i 5-7 min. Dessutom, Vi hittade inga bevis på någon morfologiska eller anatomisk avvikelse i resterande lever samlas, vilket framgår av histologiska studier. Dessutom fanns det en avsaknad av ischemi och nekros under det kirurgiska ingreppet i 6-8 veckan-gamla immun äventyras möss. Induktion av leverskada efter partiell hepatectomy bekräftas av de förhöjda nivåerna av leverenzymer ASAT, ALAT och ALK-PHOSin möss serum. En intrasplenic väg valdes för stamcellstransplantation över andra venösa vägar, eftersom portalen venösa systemet har högre tillgänglighet i levern cortex än andra venös system. Vi har visat transplantation av hepatocyter som isolerats från en transgen mus som GFP och NeoHep som är differentierade hepatocyte-liknande celler av mänskligt ursprung, i delvis hepatectomized nicka. SCID djur. Förfarandet begränsar inte typ av celler för transplantation.
Dock skapar proceduren inte villkoret AHF i en mus som bara en 30% partiell hepatectomy utförs. Denna begränsade hepatectomy ger en proliferativ potential att hepatocyter närvarande i återstående levern, vilket därmed ger ytterligare möjligheter för transplanterade hepatocyter för engraftment. Det bara visar migration och engraftment av hepatocyter och NeoHep från mjälte till levern, och ingen ytterligare skador på levern görs genom förfarandet för transplantation.
Över allt, kan proceduren är enkel, och praktiseras och behärskar lätt för att få reproducerbara resultat. Flera cellulära källor (stamceller eller hepatocyte-liknande celler) i samband med leverskada eller levern regenerering studien, regenerativ potential kan enkelt utvärderas med detta kirurgiska ingrepp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av core bidraget fick från Institutionen för bioteknik, Indiens regering att den nationella institut för immunologi, New Delhi. Dr. Bhattacharjees nuvarande adress är sektionen för gastroenterologi, hepatologi och Nutrition, Children's Hospital Los Angeles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase's analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure? Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , http://www.who.int/surgery/publications/s16383e.pdf (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
