Summary
我们已经描述了一个协议, 执行部分肝切除 (phx-空港) 和细胞移植通过脾脏点头。(点头。CB17-Prkdc有缺陷的/J) 鼠标。在本议定书中, 切口是为了揭露和切除肝脏的左叶, 其次是另一个切口的脾移植细胞。
Abstract
部分肝切除术是研究肝再生和细胞基础疗法在各种病理条件下的作用的一种多功能和可再生的方法。部分肝切除也促进移植细胞的植入和增殖, 加速新生血管和细胞向肝脏迁移。在这里, 我们描述了一个简单的协议, 执行30% 肝切除和移植细胞在脾脏的非肥胖糖尿病/严重联合 immunodeficient 点头。(点头。CB17Prkdc的/J) 鼠标。
在这个过程中, 做了两个小切口。第一切口是暴露和切除肝脏的左叶, 另一小切口被做暴露脾脏为脾移植细胞。这个程序不需要任何专门的外科手术技能, 它可以在5-7 分钟内完成, 减轻压力和疼痛, 更快的恢复, 更好的生存。我们已经展示了从绿色荧光蛋白 (gfp) 中分离出的肝细胞移植, 表达小鼠 (转基因 C57BL/6-Tg (不列颠哥伦比亚) 30 scha/J), 以及人源性肝细胞 (NeoHep) 在部分 hepatectomized 点头。老鼠。
Introduction
目前, 肝细胞移植是一种替代全器官移植治疗严重肝病患者。据信, 它可以把病人移植到全身器官,1。除了同种异体肝细胞2外, 异体肝细胞3和干细胞 (4 ) 的肝细胞也正在动物模型中进行研究。在这一背景下, 受体移植细胞的归巢和植入电位是急性肝功能衰竭 (AHF) 细胞治疗的重要标准。
为研究肝细胞或肝样细胞的移植5, AHF 是由手术的6或药理7程序在动物模型中创建的, 其次是移植细胞。通过药理试剂制作 AHF 动物模型, 许多 hepatotoxins 如 d-乳糖8、乙酰氨基酚9、四氯化碳10、硫乙酰胺11、刀豆蛋白 12、脂多糖13已使用、等。从这个列表中, 每个试剂为 AHF 生成一组独特的功能, 但不幸的是, 没有单一试剂模仿人类 AHF。此外, hepatotoxins 诱发的 AHF 时间长, 使动物处于慢性应激状态, 难以获得重现性结果。
另一方面, 部分肝切除术 (phx-空港) 的手术方法是技能依赖性的, 在培养所需技能后, 可重现性结果容易获得。仅以手术干预诱发 AHF, 需要切除超过70% 的肝脏;然而, 70% 的肝切除术仍可用于研究肝脏移植细胞的植入和增殖, 以分析其在肝损伤期间的治疗能力14。肝细胞移植术后经腹膜切除后, 经腹腔15、尾静脉16、肝静脉17或脾18。目前, 肝静脉输液和肝细胞脾移植是首选的程序, 因为它们更容易繁殖。
在本文中, 我们已经描述了30% 部分肝切除在点头的程序。(点头。CB17-Prkdcscid/J) 肝左叶切除的小鼠。其次是移植 20万 GFP 表达小鼠 (C57BL/6-Tg (不列颠哥伦比亚) 30 scha/J) 肝细胞以及人类起源 NeoHep19在脾脏。这个过程导致肝脏移植细胞的植入。这个程序是最不具侵入性和轻微疼痛的技术。
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Protocol
本议定书所载程序已由新德里国家免疫学研究所机构动物伦理委员会批准。审批的串行参考编号为 IAEC#319/13.
注: 一般手术程序有很好的资源20和针对啮齿动物手术的特定协议21。对于那些第一次做动物外科手术的人来说, 建议在对动物进行手术前, 广泛地练习使用假的程序。
1. 准备
- 在试验之前, 保持无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 或盐水准备好。
- 组装一个包括剪刀, 锯齿钳, 组织钳, 棉花, 棉花芽, 尼龙螺纹, 和不同的微型针持有人的手术套件。高压釜的手术套件。如果免疫受损的点头, 应特别小心。协议中包含了 "免疫" 鼠标。
- 执行完整的实验程序, 从准备到手术结束, 在生物安全类 I 型橱柜。
- 重点头。手术前6-8 周大鼠。在这项研究中使用了体重在14-18 克之间的老鼠。
- 用剪毛机刮上中央和有疑的腹部区域的小鼠。将脱毛膏均匀涂抹在整个区域, 用刮刀彻底除去修剪过的毛发。2-5 分钟后, 用一块湿不育棉轻轻地去除毛发。
- 将鼠标放在异氟醚腔内, 并解锁氧气缸的阀门。保持氧流的速率为4升/分和异氟醚汽化4% 诱导麻醉。
- 通过轻柔的脚趾捏, 确保鼠标被正确地麻醉。
- 在生物安全柜内放置一个手术板。把动物放在手术板上, 这样鼠标的腹部就会朝上, 老鼠的前部被放在与异氟醚和氧气供应相连的鼻锥内。
- 减少异氟醚汽化至 2%, 并保持整个手术过程。
- 对老鼠的皮肤进行消毒, 用70% 乙醇浸泡的无菌棉擦拭消毒。
2. 手术方法
-
部分肝切除术
- 在胸骨下方的皮肤上进行横向切口, 垂直于剑突过程, 并与胸腔平行, 在直操作剪刀的帮助下。
- 用镊子或无菌湿棉小贴士轻轻地将与腹部肌肉层相连的皮肤与皮肤和腹部肌肉层分开。用无菌棉花小贴士浸泡皮区, 避免脱水。
- 通过在剑突下方的腹膜层进行横切口, 使左叶的面积平滑。使用两个湿润的棉花小贴士来暴露和举起肝脏的左叶。
- 将棉花尖放在切口的腹部一侧, 再将另一条棉花尖放在隔膜侧。轻轻按下放置在隔膜上的尖端, 并给出一个滑动推的另一尖端, 以解除肝脏左叶。
- 通过在微钳或棉花小窍门的帮助下, 通过在左叶上滑动一条带环的尼龙线, 并将环滑向靠近脐部的左叶底部。轻轻地向下推尼龙线循环到底部的左叶。
- 用显微外科针架和微钳将尼龙线的两端系在左叶顶部。在另一侧增加两个结节。
- 用剪刀把绑的裂片解剖出来。不要试图切断非常接近线程。如果手术时间超过5分钟, 保持腹膜腔和器官湿润与无菌 PBS, 以避免因液体流失而脱水。
- 用4-0 线线缝合法缝合腹膜。随后, 通过不连续缝合, 尽快关闭皮肤。
-
细胞移植
注: 根据李et(C57BL/6-Tg) 所描述的程序, 荧光蛋白表达肝细胞与转基因 gfp 小鼠 (30 Scha/J) 分离。22和沈et al。23与单核细胞 (24 ) 分化的人源肝样细胞 (NeoHep) 也用于移植。然而, 从任何其他来源获得的细胞也可以在议定书中使用。- 在 Iscove 修饰 Dulbecco 的培养基 (IMDM) 的大约50µL 中悬浮20万个可行细胞, 并将其吸入1毫升胰岛素注射器, 30G 针。把注射器放在冰上, 把它放凉。
- 放置鼠标的方式, 左侧面部分朝上执行手术的人。确定脾区, 横向解剖周围的忧郁症地区的皮肤, 其次是通过腹膜层的短切口, 只是为了暴露脾脏。
- 轻轻抬起脾脏, 并在两个 PBS 湿棉花小贴士的帮助下, 把它放在腔外。
- 一只手用两根棉花尖小心翼翼地握住脾脏, 将注射器的针头精确地垂直于脾脏。轻轻刺穿脾脏, 将针慢慢地推入体内;针不应该比2毫米更深。
- 慢慢推下注射器的活塞, 将细胞注入脾脏。移植后, 保持注射器针稳定, 并从脾脏中慢慢取出, 以避免出血或细胞丢失。
- 用棉尖将脾脏放回腹膜腔后, 通过连续缝合4-0 条线缝合腹膜层。用同样的缝线缝合皮肤间断。避免使用伤口夹来闭合皮肤;相反, 用4-0 缝合线关闭它。伤口剪辑限制了鼠标的自然运动, 经常剪辑变得松散, 迅速出来。
3. 术后护理
- 关闭皮肤后, 使用无菌棉尖, 用碘溶液 (betadine) 擦拭缝合部位的周围环境。
- 注射一剂量抗生素头孢噻肟为600毫克/千克体重 (通常12毫克头孢噻肟100µL 生理盐水/小鼠) 腹腔使用1毫升注射器。
- 每日剂量止痛 Meloxicam 为1毫克/千克体重 (通常12µg Meloxicam 100 µL 生理盐水/小鼠) 到动物腹腔, 在手术后三天。
- 手术完成后, 停止异氟醚气体的流动, 把鼠标放回单独通风的笼子里。
4. Euthanization 和刻画
- 实验结束后 (1 天10天后手术), 弄死小鼠根据机构动物伦理准则。
- 收集血液由末期流血的动物, 刺穿眼球末端丛。
- 从血液中分离出血清。
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Representative Results
30% 部分肝切除术后肝细胞增殖:用免疫组化 (IHC) 染色 Ki-67 细胞增殖标记物, 观察30% 肝切除术后剩余肝脏中肝细胞的增殖。一天后肝切除, 小鼠被安乐死, 其余肝叶切除, 石蜡切片获得。切片染色的 Ki-67 抗体, 其次是标签与辣根过氧化物酶 (HRP) 共轭二级抗体。以二氨基联苯胺为基质, 用于开发褐色色素以识别染色细胞。细胞核被用苏木精染色, 并在20X 物镜下观察。图 1显示了肝脏部分的代表性 IHC 图像。约13% 的细胞 (13.66 0.317, N=3) 是 Ki-67 阳性, 这证实了30% 肝切除促进肝细胞在小鼠肝脏的增殖。
解剖学研究:点头肝的代表形象。老鼠, 肝切除术后10天显示在图 2中。该图像证实, 其余的肝脏是健康的, 没有明显的异常。
在第一个小时的手术中存在移植的细胞:对移植后2小时内荧光蛋白阳性肝细胞的存在进行了流动细胞分析, 证实了移植细胞的归巢。
在酶消化2小时的 GFP-肝细胞移植后, 从宿主小鼠的脾和肝中获得单细胞悬浮液。使用流式细胞仪估计移植的 GFP 阳性细胞的百分比。从相应的 FSC-SSC 点图中选择了一个散射门, 以消除碎片和双峰细胞。该地块的象限门是由在没有移植细胞的控制小鼠的脾脏和肝脏中获得的细胞悬浮强度的背景 fluorochrome 产生的。脾脏中发现了大约1.7% 个 gfp 阳性肝细胞, 移植后2小时内未发现 gfp 肝细胞。代表性数据显示在图 3中。
免疫组化:术后十天, 对小鼠进行了安乐死, 右外叶、右内侧叶和肝左内侧叶切除, 并进行了低温切片, 获得5µm 切片。这些部分然后被检查为被移植的细胞的归巢和植入。图 4显示了对抗 GFP (red) 进行免疫组化 (IHC) 染色的代表性图像, 用于识别表达小鼠肝细胞的 GFP (面板A、 B和C);与抗人白蛋白 (红色), 以及抗人类连接蛋白 32 (绿色), 以识别肝细胞样细胞 (NeoHep) 的人类起源 (面板D, E, F, 和G)。在两种情况下, 细胞核的复染为 4 ', 6-diamidino 2-苯基吲哚 (DAPI, 蓝色)。在这些图像面板中, 一些表达肝细胞的嫁接 GFP (面板a、 B和C) 和 NeoHep (面板D、 E、 F和G) 明显可见。
肝脏分泌酶的生化分析:为了检查手术后肝脏的功能, 对不同的肝分泌酶进行了生化分析。图 5中的条形图表示健康点头的血清中天门冬氨酸转氨酶 (AST)、丙氨酸转氨酶 (ALT) 和碱性磷酸酶 (磷) 的平均值。小鼠和不同组的部分 hepatectomized 小鼠。从图中清楚地看出, 1 天的肝切除术后, 与健康小鼠相比, AST、ALT 和磷酶的水平显著增加。
ALT 和 AST 酶水平恢复正常, 而磷水平在非移植小鼠术后十天内保持高位。然而, 在移植小鼠10天后, 所有三种酶的水平都下降到正常。
肝脏组织学研究:对 hepatectomized 和移植小鼠的肝脏标本进行进一步的组织学分析, 研究手术后的解剖变化。图 6显示了有代表性的明亮场图像, 苏木精和伊红 (H 和 E) 染色肝切片的健康小鼠无手术, 1 天后部分肝切除和10天后部分肝切除和 NeoHep 移植。在这些图像中, 1 天的部分肝切除术后观察到轻度围胆管纤维化或结缔组织增生引起的肝脏损伤, 手术后十天没有发现异常。
图 1: 点头的 Ki-67 染色的代表图像。肝切除术1天后肝脏切片 30%.切片染色 Ki-67 抗体, 辣根过氧化物酶 (HRP) 共轭二次抗体, 和民建联 (褐色) 作为 HRP 基质, 核复染的苏木精 (蓝色)。指示箭头指出了一些 Ki-67 阳性 (褐色) 细胞。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 重新生成点头的肝叶。老鼠术后10天.A: 尾状叶 (尾状的过程), B: 右外侧叶, C: 右内侧裂片, D: 左内侧裂片, E: 心脏, F: 左外侧叶在肝切除后剩余, 和 G: 尾状叶 (乳突)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 荧光蛋白阳性小鼠 heptatocytes 在脾脏和肝脏中的百分比。老鼠.上面的面板显示一个年龄匹配的控制鼠标的细胞剖面, 其中没有细胞移植。下部的面板显示2小时后, GFP 肝细胞移植 hepatectomized 鼠细胞剖面。图的 y 轴表示在对数刻度上以任意单位测量的 GFP (FITC 通道) 的荧光强度, x 轴表示线性尺度上任意单位的正散射 (FSC)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 移植的 GFP 在再生宿主肝中表达小鼠肝细胞和 NeoHep 的归巢.部分 hepatectomized 点头的肝脏部分的代表性图像。免疫荧光蛋白阳性小鼠肝细胞移植 (A C), 显示细胞植入和归巢。小组 A: 核 (蓝色: DAPI), 小组 B: 抗 GFP (红色: Alexa 594), 小组 C: 合并的图象。面板 (D G) 显示部分 hepatectomized 点头的肝脏部分。NeoHep 移植的老鼠。小组 D: 核 (蓝色: DAPI), 小组 E: 人的抗连接蛋白 32 (绿色: alexa 氟 488), 小组 F: 人的抗白蛋白 (红色: Alexa 氟 594) 和小组 G: 合并的图象。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 对小鼠血清中不同肝分泌酶的生化分析.柱条代表不同酶的平均值 (AST/SGOT, ALT/SGPT, 磷)。术后的时间点显示在 X 轴上。在对照组, 有年龄匹配点头。未进行手术的小鼠。误差线表示平均值的标准错误, N=3 和 * 指示p< 0.05, NS 表示p> 0.05 中的非意义。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 小鼠肝组织切片的病理学研究.有代表性的明亮的现场显微图像的苏木精和伊红 (H 和 E) 染色肝组织部分点头。20X 物镜下的小鼠。小组 a 显示肝脏部分从健康点头。同一年龄的老鼠没有任何手术。小组 B 显示肝脏部分1天后部分肝切除术。在这个图像中, 箭头表明轻度胆道纤维化或结缔组织增生区。C 组显示肝脏部分十天后部分肝切除和细胞移植。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
部分肝切除术是一种研究肝再生的方法, 据报道过度肝切除是模拟 AHF 模型。在 AHF 动物模型中, 啮齿动物, 特别是小鼠, 是研究最多的模型。为了获得小鼠肝脏损伤模型, 多达70% 的肝切除已报告具有良好的存活率25,26。然而, 在裸和其他 immunodeficient 鼠, 70% 例肝切除被报告为致命, 动物死亡24小时内27。
米切尔和 Willenbring28展示了一种可重复和良好耐受的方法, 2/3 小鼠部分肝切除。点头。免疫缺陷小鼠, 我们获得了100% 的生存率时, 肝切除被限制到切除左肝叶, 这是接近30% 的总肝脏质量。根据对裸鼠的观察27, 我们观察到在点头时肝切除的百分比会进一步增加。老鼠的生存率会急剧下降。此外, 其余肝叶中肝细胞增殖1天30% 部分肝切除证实了本程序在移植和植入研究中的应用。
在最近的一篇论文中, 艾哈迈德 S.U. et 。29显示了在 immunodeficient 小鼠肝内移植肝细胞癌的程序。他们展示了移植肿瘤细胞的程序, 包括脾脏在内的各种器官, 并进行肝切除以促进肝内植入。
在米切尔28和艾哈迈德29报告的过程中, 由于手术中通常首选较小的切口, 因此有机会进行更小的切口。有证据显示30 , 较小长度的手术切口会导致压力荷尔蒙分泌减少, 如皮质醇和儿茶酚胺。此外, 我们发现, 涉及一个更大的切口的程序需要更高水平的技能, 并更难以重现, 相比的程序有两个较小的切口。
在本文中, 我们已经描述了一个程序, 其中要求最小切口暴露的左叶的肝脏, 并在执行30% 肝切除后, 另一小切口, 以暴露脾脏的细胞被植入。本程序不需要任何专门的外科手术技能, 并可在5-7 分钟内完成。此外, 我们没有发现任何证据显示任何形态学或解剖异常的其余肝脏肿块, 如组织学研究证明。此外, 6-8 周大的免疫受损小鼠在手术过程中没有缺血或坏死。部分肝切除术后肝损伤的诱导是由高浓度的肝脏酶、ALT 和 PHOSin 小鼠血清所证实的。由于门静脉系统比其他静脉系统具有更高的可进入性, 因此选择了在其他静脉通路上进行细胞移植的脾路线。我们已经证明了移植的肝细胞从转基因 GFP 小鼠和 NeoHep 是分化的肝细胞样细胞的人的起源, 在部分 hepatectomized 点头。动物。该过程不限制用于移植的细胞类型。
但是, 此过程不会在鼠标中创建 AHF 条件, 因为只执行30% 部分肝切除。这种有限的肝切除为肝脏中存在的肝细胞提供了增殖潜能, 从而为植入移植肝细胞提供了更多的机会。它只说明了肝细胞的迁移和植入, NeoHep 从脾脏到肝脏, 并没有对肝脏造成额外损害的移植程序。
总之, 这个过程很简单, 可以很容易地被实践和掌握, 以获得可重现的结果。在肝损伤或肝再生研究中, 几种细胞源 (干细胞或肝样细胞) 的再生潜能可以很容易地用这种手术方法来评价。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了印度政府生物技术部向新德里国家免疫学研究所提供的核心赠款的支持。巴塔查尔吉博士目前的讲话是胃肠病学、肝病和营养科, 洛杉矶儿童医院。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
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