Summary
Vi har beskrevet en protokoll for å utføre delvis hepatectomy (PHx) og cellen transplantasjon via milt i NIKK. SCID (NIKKER. CB17-Prkdcscid/j) mus. Denne protokollen, er et snitt gjort å avdekke og resect den venstre flik av leveren etterfulgt av en annen snitt for intrasplenic transplantasjon av celler.
Abstract
Delvis hepatectomy er en allsidig og reproduserbar metode lever foryngelse og effekten av cellen basert legemiddelselskap i ulike patologiske forhold. Delvis hepatectomy forenkler også økt engraftment og spredning av transplantert celler ved akselererende neovascularization og celle migrasjon mot leveren. Her beskriver vi en enkel protokoll for utføre 30% hepatectomy og transplantasjon av celler i milten av en ikke-obese diabetiker/alvorlig kombinert immunodeficient hilsen. SCID (NIKKER. CB17-Prkdcscid/j) musen.
I denne prosedyren er to små snitt gjort. Den første snittet er å avsløre og resect den venstre flik av leveren, og en annen liten snitt lages for å avsløre milten for intrasplenic transplantasjon av celler. Denne prosedyren krever ikke noen spesialisert kirurgiske ferdigheter, og det kan være ferdig i 5-7 minutter med mindre stress og smerte, raskere restitusjon og bedre overlevelse. Vi har vist transplantasjon av hepatocytter isolert fra en grønn fluorescerende protein (GFP) uttrykker mus (transgene C57BL/6-vs (UBC-GFP) 30Scha/J), samt hepatocyte som celler av menneskets opprinnelse (NeoHep) i delvis hepatectomized hilsen. SCID mus.
Introduction
Foreløpig er hepatocyte transplantasjon foreslått som et alternativ til hele organtransplantasjon for behandling av pasienter med alvorlig lever lidelser. Det antas at det kan bygge bro pasienter til hele organ transplantasjon1. I tillegg til allogenic hepatocytter2, blir xenogenic hepatocytter3 og hepatocytter avledet fra stamceller4 også undersøkt i dyremodeller. I denne sammenheng, homing og engraftment er potensialet transplantert cellene i mottakeren et viktig kriterium for cellen basert terapi i akutt hepatic fiasko (AHF).
For å undersøke transplantasjon av hepatocytter eller hepatocyte-lignende celler5, opprettes AHF i en dyremodell kirurgisk6 eller farmakologiske7 prosedyrer, etterfulgt av transplanting celler. Å lage en AHF dyr modell av farmakologiske reagenser, mange hepatotoxins som d-galactosamine8, Paracetamol9, carbon tetrachloride10, thioacetamide11, Concanavalin A12, lipopolysakkarid13 , osv., har blitt brukt. Hver reagens genererer et unikt sett med funksjoner for AHF fra denne listen, men dessverre ikke enkelt reagens etterligner den menneskelige AHF. Videre AHF indusert av hepatotoxins tar lang tid, som setter dyr kronisk stress, og reproduserbar resultatene er vanskelig å få.
På den annen side, kirurgiske prosedyren for delvis hepatectomy (PHx) er ferdighet avhengige, og reproduserbar resultatene er lett å få etter å utvikle nødvendige ferdigheter. For å indusere AHF av kirurgiske inngrep alene, er fjerning av mer enn 70% av leveren påkrevd. men transplantert mindre enn en 70% hepatectomy kan fortsatt brukes til å studere engraftment og spredning av celler i leveren for å analysere deres terapeutiske kapasitet under leverskader14. Transplantasjon av hepatocytter har vært utført innlegg hepatectomy gjennom peritoneum15, hale blodåre16, hepatic blodåre17eller milt18. Foreløpig er hepatic blodåre-infusjon og intrasplenic transplantasjon av hepatocytter den foretrukne prosedyrer, fordi de er lettere å reprodusere.
I dette papiret, har vi beskrevet en prosedyre for en 30% delvis hepatectomy i NIKK. SCID (NIKKER. CB17-Prkdcscid/J) mus som den venstre flik av leveren er forbrukeravgift. Det er etterfulgt av transplantasjon 0,2 millioner GFP uttrykke mus (C57BL/6-vs (UBC-GFP) 30Scha/J) hepatocytter samt menneskelige opprinnelse NeoHep19 i milten. Denne fremgangsmåten fører til engraftment av transplantert cellene i leveren. Denne fremgangsmåten er de minst invasive og en minimal smertefulle teknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fremgangsmåtene i denne protokollen er godkjent av den institusjonelle dyr etikk av det nasjonale Institutt for immunologi, New Delhi. Seriell referansenummeret for godkjenning er IAEC #319/13.
Merk: Det er gode ressurser på allmenn kirurgi prosedyrer20 og bestemte protokoller for gnager kirurgi21. For de gjør dyr kirurgi for første gang, er det anbefalt å mye praksis kirurgiske prosedyrer på dummies før på dyr.
1. forberedelse
- Før eksperimentet, holde sterilt fosfat bufret saltvann (PBS) eller saltvann klar.
- Sett sammen en kirurgi kit som inneholder saks, taggete tang, tissue tang, bomull, bomull knopper, nylontråder og forskjellige mikro nål holdere. Autoclave kirurgi kit. Forsiktighet bør tas hvis en immun kompromittert NIKK. SCID musen er inkludert i protokollen.
- Utføre den komplette eksperimentelle prosedyren, fra forberedelse til slutten av kirurgi, i bio-sikkerhet klasse I kabinettet.
- Veie et NIKK. SCID musen 6-8 uker gamle før operasjonen. Mus veier mellom 14-18 g brukes i denne studien.
- Barbere øvre sentrale og hypochondriac mageregionen musen med hår trimmer. Bruke hår fjerning krem jevnt i hele regionen med en slikkepott fjerne trimmet hårene. Fjerne håret forsiktig med hjelp av et stykke våt steril bomull etter 2-5 min.
- Plasser musen i isoflurane kammer og låse ventilen av oksygen sylinder. Opprettholde oksygen flyten frekvensen av 4 L/min og den isoflurane fordamping på 4% å indusere anestesi.
- Kontroller at musen har vært anesthetized riktig av mild tå knipe.
- Plass en kirurgi bord inne en biosafety kabinett. Plassere dyret på kirurgi brettet, slik at den ventrale delen av musen vender opp og den fremre delen av musen er plassert inne i nesen kjegle koblet til isoflurane og oksygen levering.
- Reduser isoflurane fordamping til 2%, og opprettholde det i hele den kirurgiske prosedyren.
- Rense huden av mus og steriliseres ved å tørke med 70% etanol gjennomvåt steril bomull.
2. kirurgisk prosedyre
-
Delvis Hepatectomy
- Gjøre en tverrgående snitt på rundt 1 cm i huden like under den sternum, vinkelrett i xiphoid prosessen og parallelt brystkasse, ved hjelp av direkte kirurgisk saks.
- Forsiktig skille huden festet med bukmuskel laget i skåret området med tang eller sterilt fuktet bomull tips å skille mellom huden og bukmuskel lag. Nyt intradermal regionen med PBS bruke steril bomull tips for å unngå uttørking.
- Utsett området av den venstre lobe jevnt ved å gjøre en tverrgående snitt gjennom peritoneal laget like under xiphoid. Bruk to fuktet bomull tips å avsløre og løft den venstre flik av leveren.
- Plasser en av bomull tips om abdominal siden av kutt, og plassere en annen bomull tips på membran side. Forsiktig trykker du spissen plassert mot mellomgulvet, og gi en glidende push av andre spissen å løfte den venstre flik av leveren.
- Ta en nylon tråd med en sløyfe på løftet venstre lobe, og skyv loopen mot bunnen av det venstre lobe nær hilum ved hjelp av mikro-tang eller bomull tips. Skyv ned nylon tråd sløyfe på undersiden av det venstre lobe.
- Binde to endene av nylon tråden over toppen av den venstre lobe bruker en mikrokirurgi nål holder og mikro tang. Gjøre to ekstra knop på den andre siden.
- Dissekere ut bundet lobe ved hjelp av saks. Ikke forsøk å kutte svært nær tråden. I tilfelle prosedyren varer mer enn 5 min, holde bukhulen og organer fuktig med sterilt PBS å unngå uttørking på grunn av tap av væske.
- Sy peritoneum ved kontinuerlig suturing bruker en 4-0 Catgut Sutur. Deretter Lukk huden av usammenhengende suturing så raskt som mulig.
-
Cellen transplantasjon
Merk: GFP uttrykke hepatocytter ble isolert fra transgene GFP mus (C57BL/6-vs (UBC-GFP) 30 Scha/J), i henhold til prosedyren beskrevet av Lee et al. 22 og Shen et al. 23 hepatocyte-lignende celler (NeoHep) av menneskets opprinnelse differensiert fra monocytter24 ble også brukt for transplantasjon. Cellene stammer fra andre kilder, kan imidlertid også brukes i protokollen.- Suspendere 0,2 millioner levedyktig celler i nærheten 50 µL av Iscoves endret Dulbecco Medium (IMDM), og Sug opp den i en 1 mL insulinsprøyte avkortet med 30G nål. Kjølemidler sprøyten ved å plassere den på is.
- Plass musen slik at den venstre laterale delen vender mot personen som utfører operasjonen. Identifisere splenic området og tvers dissekere huden i nærheten hypochondriac regionen, etterfulgt av en kort snitt gjennom peritoneal laget bare for å utsette milten.
- Forsiktig løfte milten og holde den utenfor hulrommet med hjelp av to PBS fuktet bomull tips.
- Hold milten med to bomull tips i den ene hånden, og plassere nålen på sprøyten nøyaktig loddrett milten. Forsiktig pierce milten og stikk nålen veldig sakte inne; nålen skal ikke få dypere enn 2 mm.
- Trykk ned stempelet til sprøyten sakte å injisere cellene i milten. Etter transplantasjon, holde nålen på sprøyten stabile og fjerne det sakte fra milt å unngå blødning eller tap av celler.
- Etter å plassere milten tilbake i bukhulen med bomull tips, lukke peritoneal laget ved kontinuerlig suturing med en 4-0 Catgut Sutur. Sy huden diskontinuerlig med det samme suture. Unngå å bruke såret klipp for å lukke huden; i stedet, lukke det ved en 4-0 Sutur. Såret klippene begrense den naturlige bevegelsen av musen, og ofte klipp bli løs og kommer ut raskt.
3. postoperativ pleie
- Etter stengetid huden, tørke rundt begge Sutur områdene med joden løsning (betadine) bruker en steril bomull tips.
- Sprøyte inn en dose antibiotika cefotaxime som 600 mg/kg kropp vekt (vanligvis 12 mg cefotaxime i 100 µL av saline/mus) intraperitoneally med 1 mL sprøyte.
- Gi daglige doser av smertestillende har meloksikam som 1 mg/kg kroppsvekt (vanligvis 12 µg har meloksikam i 100 µL av saline/mus) til dyret intraperitoneally, opp til tre dager etter operasjonen.
- Etter ferdigstillelse av kirurgi, stoppe flyten av isoflurane gass og Plasser musen i individuelt ventilert buret.
4. euthanization og karakteristikk
- Etter de eksperimentelle end-meningene (1 dag og 10 dager etter operasjonen), euthanize musene i henhold til institusjonelle dyreetikk retningslinjer.
- Samle blod av terminalt blødning dyrene, punktering av okulære terminal plexus.
- Isolere serum fra blodet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocyte spredning etter 30% delvis hepatectomy: Spredning av hepatocytter som de resterende lever etter 30% hepatectomy ble undersøkt av immunohistochemical (IHC) flekker for en celle spredning markør, Ki-67. Dag innlegget hepatectomy, mus var euthanized, gjenværende leveren lobes ble fjernet og parafinsnitt ble innhentet. Delene var farget med Ki-67 antistoff, etterfulgt av merking med pepperrot peroxidase (HRP) konjugert sekundære antistoff. Di-Amino Benzidine (DAB) ble brukt som underlag for HRP for utvikling av brun farge til å identifisere farget celler. Kjernen var counter farget med hematoxylin og vises under 20 X objektive mikroskop. Figur 1 viser et representativt IHC bilde for en lever. Rundt 13% av celler (13,66 ± 0.317, N = 3) var Ki-67 positiv, som bekreftet at en 30% hepatectomy muliggjør spredning av hepatocytter i musen leveren.
Anatomiske studie: Et representativt bilde av leveren av et NIKK. SCID mus, 10 dager innlegget hepatectomy er vist i figur 2. Dette bildet bekreftet at gjenværende leveren var sunt med ingen synlig unormalt.
Tilstedeværelse av transplantert celler under første time kirurgi: Homing transplantert cellene ble bekreftet med flyt cytometric analyse av undersøke tilstedeværelsen av GFP positive hepatocytter 2 timer etter transplantasjon.
En enkeltcelle suspensjon er Hentet fra milt og lever vert museklikk etter at enzymatisk fordøyelsen av forbrukeravgift vev 2 timer av GFP-hepatocytter transplantasjon. Prosentandelen av transplantert GFP positive celler ble beregnet ved hjelp av en flyt cytometer. Et punktdiagram gate ble valgt fra tilsvarende FSC-SSC dot plottet å fjerne rusk og doublet cellene. Kvadrant porten til handlingen ble opprettet av bakgrunnen fluorochrome intensiteten av cellen suspensjoner fra milt og lever med kontroll musen der ingen celler ble transplantert. Rundt 1.7% GFP positive hepatocytter ble funnet i milten, og ingen GFP hepatocytter ble funnet i leveren 2 timer etter transplantasjon. Representant data er vist i Figur 3.
Immunohistochemistry: Ti dager etter operasjonen, mus var euthanized, og den høyre lateral lobe rett mediale lobe og venstre mediale lobes av leveren ble fjernet og cryo-skjæring ble utført for å få 5 µm seksjoner. Disse delene ble deretter undersøkt for drap og engraftment av transplantert cellene. Figur 4 viser representant bilder av immunohistochemical (IHC) flekker mot anti-GFP (rød) å identifisere GFP uttrykke mus hepatocytter (panelet A, Bog C); og mot anti-menneskelige albumin (rød), samt anti-menneskelige connexin 32 (grønn), til å identifisere hepatocyte som celler (NeoHep) av menneskets opprinnelse ( D, E, Fog G-panelet). Kjernen var counterstained med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blå) i begge tilfellene. I disse bilde paneler, noen engrafted GFP uttrykke hepatocytter (panelet A, Bog C) og NeoHep (panel D, E, Fog G) er synlig.
Biokjemiske analyse av leveren utskilles enzymer: For å kontrollere funksjonaliteten i leveren etter kirurgiske prosedyren, ble biokjemiske analyse av ulike utskilles leverenzymer utført. Stolpediagrammer i figur 5 representerer middelverdien av aspartate aminotransferase (AST), alanin aminotransferase (ALT) og alkalisk fosfatase (ALK-PHOS) i serum sunn Nod. SCID mus og ulike grupper av delvis hepatectomized mus. Det er tydelig fra diagrammet at etter 1 dag av hepatectomy nivåer av AST, ALT og ALK-PHOS enzymer betraktelig, sammenlignet med de sunne mus.
ALAT og ASAT enzym nivåer ble gjenopprettet til det normale, mens ALK-PHOS nivåer vært høy legge ti dager kirurgi i ikke-transplanted mus. Men nivåene av alle tre enzymer falt til normal i transplantert mus etter 10 dager.
Lever histologiske studier: Leveren utvalgene av hepatectomized og transplantert mus ble ytterligere behandlet for histologiske analyse å studere anatomiske endringer etter operasjonen. Figur 6 viser feltet representant lyse bilder av hematoxylin og eosin (H og E) farget leveren deler av sunne mus uten kirurgi, 1 dag legge delvis hepatectomy og 10 dager legge delvis hepatectomy og NeoHep transplantasjon. I disse bildene, leverskader grunnet mildt peri-biliær fibrosis eller bindevev spredning ble observert etter 1 dag med delvis hepatectomy og ingen unormalt ble observert ti dager etter operasjonen.
Figur 1 : Et representativt bilde av Ki-67 flekker Nod. SCID lever delen etter 1 dag 30% hepatectomy. Delen var farget med Ki-67 antistoff, pepperrotperoksidase (HRP) konjugert sekundære antistoff, og DAB (brun) ble brukt som HRP substrat og kjerner var counterstained av hematoxylin (blå). Indikativ pilhodene påpeke noen av Ki-67 positiv (brun) cellene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Regenerert leveren lobes av et NIKK. SCID musen 10 dager etter operasjonen. A: caudate lobe (Caudate prosess), B: rett lateral lobe, C: høyre mediale lobe, D: igjen mediale lobe, E: hjerte, F: gjenværende venstre lateral lobe etter hepatectomy og G: caudate lobe (Papillary prosess). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Andelen GFP positive mus heptatocytes i milten og leveren en Nod. SCID musen. Den øvre panelene viser cellen profilen til en alder matchet kontroll musen der ingen celler ble transplantert. Nedre paneler viser cellen profilen etter 2 timer med GFP hepatocyte transplantasjon i hepatectomized mus. Y-aksen av tomter angir fluorescens intensiteten av GFP (FITC kanal) målt i vilkårlig enheter på en logaritmisk skala, og x-aksen angir fremover scatter (FSC) i vilkårlig enheter på en lineær skala. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Homing av transplantert GFP uttrykke musen hepatocytter og NeoHep i Spartments vert leveren. Representant bilder av leveren deler av et delvis hepatectomized hilsen. SCID musen transplantert med GFP positive musen hepatocytter (-vekselstrøm), viser cellen engraftment og homing. Panelet A: kjernen (blå: DAPI), panelet B: anti-GFP (Red: Alexa Fluor 594), panelet C: sammenslått bilde. Paneler (D-G) vise leveren delen av delvis hepatectomized hilsen. SCID musen i som NeoHep ble transplantert. Panelet D: kjernen (blå: DAPI), panelet E: menneskelige anti-Connexin 32 (grønn: Alexa Fluor 488), panelet F: menneskelige anti-Albumin (Red: Alexa Fluor 594) og panelet G: sammenslått bilde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Biokjemiske analyse av ulike leveren utskilles enzymer i mus serum. Kolonnen barer representerer mener verdiene av ulike enzymer (AST/SGOT, ALT/SGPT, ALK-PHOS). Tid utgangspunktet studie etter operasjonen vises på X-aksen. I kontrollgruppen, var det alder matchet NIKK. SCID mus og uten kirurgi ble utført. Feilfelt betegne standardfeilen til gjennomsnittet, N = 3 og * angir p< 0,05, NS angir ikke-betydning på p> 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Histopatologisk undersøkelse av mus leveren vev. Representant lyse feltet mikroskopi bilder av hematoxylin og eosin (H og E) farget leveren vev deler av NIKK. SCID mus under 20 X linsen. Panelet A viser en leveren delen fra en sunn NIKK. SCID musen på samme alder uten kirurgi. Panelet B viser en leveren delen 1 dag innlegg delvis hepatectomy. I dette bildet angi pilespisser regionen for mild peri-billiary fibrosis eller bindevev spredning. Panelet C viser en leveren delen ti dager innlegget delvis hepatectomy og cellen transplantasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Delvis hepatectomy er en etablert teknikk for undersøke leveren gjenfødelse, og overdreven hepatectomy rapporteres å etterligne AHF modellen. Blant dyr modeller av AHF er gnagere, spesielt mus, mest undersøkte modellen. For å få en leverskade modell i mus, til en 70% hepatectomy har blitt rapportert med en god survival rate25,26. Men i naken og andre immunodeficient mus, en 70% hepatectomy ble rapportert som fatale og dyr døde innen 24 timer27.
Mitchell og Willenbring28 vist reproduserbare og godt tolerert metode for 2/3 delvis hepatectomy i mus. For NIKK. SCID mus, vi fikk en 100% overlevelse når hepatectomy var begrenset til fjerning av den venstre leveren lobe, som ligger 30% av totale leveren. I tråd med observasjoner på naken mus27observerte vi at ytterligere økning i andelen hepatectomy i NIKK. SCID musen fører til en dramatisk senking av overlevelse. Videre bekreftet spredning av hepatocytter som de resterende leveren lobes post 1 dag 30% delvis hepatectomy nytten av denne prosedyren i transplantasjon og engraftment studier.
I en nyere artikkel, Ahmed S.U. et al. 29 har vist en prosedyre for intrahepatic hepatocellulært karsinom xenografts i immunodeficient mus. De har vist en prosedyre for transplantasjon av kreftceller i ulike organer, inkludert milten og utføres hepatectomy for å forenkle intrahepatic engraftment.
I fremgangsmåtene Mitchell28 og Ahmed29, er det en mulighet for forbedringer av gjør mye mindre snittene som mindre incisions er generelt foretrukket i kirurgi. Det er bevis30 som en mindre lengde kirurgisk snitt fører til mindre sekresjon av stresshormoner som cortisol og katekolaminer. I tillegg fant vi at prosedyrer som involverer en større snitt krever et høyere nivå av ferdigheter, og er vanskeligere å reprodusere, sammenlignet med prosedyrer har to mindre snitt.
I dette papiret, vi har beskrevet en prosedyre som minimum snitt er nødvendig å avsløre den venstre flik av leveren og etter utfører en 30% hepatectomy, en annen liten snitt ble gjort å avsløre milten der celler ble implantert. Denne prosedyren krever ikke noen spesialisert kirurgiske ferdigheter og kan være ferdig i 5-7 min. Videre fant vi ingen bevis for noe morfologiske eller anatomiske unormalt i gjenværende leveren massen, noe som gjenspeiles av histologiske studier. Videre var det et fravær av ischemia eller nekrose under kirurgiske prosedyren 6-8 ukens-gamle immun kompromittert mus. Induksjon av skader etter delvis hepatectomy er bekreftet av de forhøyede nivåene av leveren enzymer AST, ALT og ALK-PHOSin mus serum. En intrasplenic rute ble valgt for cellen transplantasjon over andre venøs ruter, fordi portalen venøse systemet har høyere tilgjengelighet i leveren cortex enn andre venøs systemer. Vi har vist transplantasjon av hepatocytter isolert fra transgene GFP mus og NeoHep som er differensiert hepatocyte-lignende celler menneskets opprinnelse, i det delvis hepatectomized hilsen. SCID dyr. Prosedyren begrenser ikke typen celler brukes for transplantasjon.
Men oppretter denne prosedyren ikke AHF betingelsen i en mus, som bare en 30% delvis hepatectomy er utført. Dette begrenset hepatectomy gir et proliferativ potensial til hepatocytter i gjenværende leveren, som dermed gir ytterligere muligheter for transplantert hepatocytter for engraftment. Det bare viser migrasjon og engraftment av hepatocytter og NeoHep fra milten til leveren og ingen ytterligere skade til leveren er gjort av transplantasjon.
Over alt kan denne fremgangsmåten er enkel, og praktiseres og mestret lett for å få reproduserbar resultater. Regenerativ potensialet av flere mobilnettet kilder (stamceller eller hepatocyte-lignende celler) i forbindelse med skader, eller lever foryngelse studien, kan lett bli evaluert med denne kirurgiske prosedyren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av kjernen bevilgning mottatt fra Department of bioteknologi, Indias regjering til de nasjonale Institutt for immunologi, New Delhi. Dr. Bhattacharjees nåværende adresse er delingen av gastroenterologi, Hepatology og ernæring, Children's Hospital i Los Angeles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase's analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure? Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , http://www.who.int/surgery/publications/s16383e.pdf (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
