Summary
We hebben een protocol voor het uitvoeren van gedeeltelijke hepatectomy (PHx) en cel transplantatie via milt in KNIPOOG beschreven. SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/j) muizen. In dit protocol wordt een incisie gemaakt bloot en resect de linker kwab van de lever, gevolgd door een andere snede voor intrasplenic transplantatie van cellen.
Abstract
Gedeeltelijke hepatectomy is een veelzijdig en reproduceerbare methode lever regeneratie en het effect van cellen gebaseerde therapeutics in verscheidene pathologische condities te studeren. Gedeeltelijke hepatectomy vergemakkelijkt ook de verhoogde engraftment en de verspreiding van getransplanteerde cellen door versnelde neovascularization en cel migratie naar de lever. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het uitvoeren van 30% hepatectomy en transplantatie van cellen in de milt van een nietzwaarlijvige diabetische/ernstige gecombineerde immunodeficiëntie knik. SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/j) muis.
In deze procedure zijn twee kleine incisies gemaakt. De eerste incisie wordt bloot en resect de linker kwab van de lever, en een andere kleine incisie wordt gemaakt om de milt voor de intrasplenic transplantatie van cellen bloot te stellen. Deze procedure is niet vereist geen gespecialiseerde chirurgische vaardigheden en deze kan worden voltooid in 5-7 minuten met minder stress en pijn, sneller herstel en beter overleven. We hebben aangetoond dat de transplantatie van hepatocyten geïsoleerd van een groen fluorescente proteïne (GFP) uiting van de muis (transgene C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), evenals de hepatocyte als cellen van menselijke oorsprong (NeoHep) in gedeeltelijk hepatectomized knik. SCID muizen.
Introduction
Op dit moment wordt hepatocyte transplantatie voorgesteld als een alternatief voor hele orgaantransplantatie voor behandelen patiënten met ernstige leveraandoeningen. Het is van mening dat patiënten op hele orgaantransplantatie1kan overbruggen. Naast de allogene hepatocyten2, worden xenogene hepatocyten3 en hepatocyten afgeleid van stamcellen4 ook onderzocht in diermodellen. In deze context, de homing en engraftment is potentieel van de getransplanteerde cellen in de ontvanger een belangrijk criterium voor celtherapie gebaseerd in acute hepatische insufficiëntie (AHF).
Voor het onderzoeken van de transplantatie van hepatocyten of hepatocyte-achtige cellen5, is AHF gemaakt in een diermodel door chirurgische6 of farmacologische7 procedures, gevolgd door het transplanteren van de cellen. Te maken van een dierlijk model van AHF door farmacologische reagentia, vele hepatotoxine zoals d-galactosamine8paracetamol9tetrachloorkoolstof10, thioacetamide11, Concanavalin A12, lipopolysaccharide13 , enz., zijn gebruikt. In deze lijst elk reagens genereert een unieke reeks van functies voor AHF, maar helaas geen enkele reagens bootst de menselijke AFH. Bovendien, de AFH geïnduceerd door hepatotoxine lang duurt, waardoor dieren onder chronische stress, en reproduceerbare resultaten zijn moeilijk te verkrijgen.
Aan de andere kant, de chirurgische ingreep van gedeeltelijke hepatectomy (PHx) is vaardigheid afhankelijk, en reproduceerbare resultaten zijn eenvoudig te verkrijgen na het ontwikkelen van de vereiste vaardigheden. Om te induceren AHF door chirurgische ingreep alleen, is resectie van meer dan 70% van de lever vereist; echter getransplanteerde minder dan een 70% hepatectomy kan nog steeds worden gebruikt om de studie van engraftment en verspreiding van cellen in de lever voor het analyseren van hun therapeutische capaciteit tijdens leverschade14. De transplantatie van hepatocyten geweest uitgevoerd post hepatectomy via het buikvlies15, staart ader16, hepatische ader17of de milt18. Op dit moment, zijn hepatische ader infusie en intrasplenic transplantatie van hepatocyten de aangewezen procedures, zoals ze gemakkelijker zijn te reproduceren.
In dit document, hebben we een procedure voor een gedeeltelijke hepatectomy van 30% in KNIPOOG beschreven. SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J) muizen waarin de linker kwab van de lever is weggesneden. Het wordt gevolgd door transplantatie van 0,2 miljoen GFP waarin muis (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) hepatocyten evenals menselijke oorsprong NeoHep19 in de milt. Deze procedure leidt tot engraftment van de getransplanteerde cellen in de lever. Deze procedure is de minst invasieve en een minimaal pijnlijke techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures gepresenteerd in dit protocol zijn goedgekeurd door de institutionele dier ethisch comité van het nationale Instituut van immunologie, New Delhi. De seriële referentienummer van de goedkeuring is IAEC #319/13.
Opmerking: Er zijn uitstekende middelen op algemene chirurgie procedures20 en specifieke protocollen voor knaagdieren chirurgie21. Voor degenen die dierlijke chirurgie doen voor de eerste keer, is het aanbevolen om uitgebreid praktijk chirurgische ingrepen op dummies voordat op dieren.
1. voorbereiding
- Voorafgaand aan het experiment, door steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of zoute klaar te houden.
- Monteren van een chirurgie kit met schaar, getande pincet weefsel pincet, katoen, wattenstaafjes, nylon draden en verschillende micro naald houders. Autoclaaf de chirurgie kit. Speciale zorg moet worden genomen als een KNIPOOG immuun-gecompromitteerd. SCID muis is opgenomen in het protocol.
- Uitvoeren van de volledige experimentele procedure, vanaf de voorbereiding tot het einde van de operatie, de bio-veiligheid klasse I kabinet.
- Weeg een KNIPOOG. SCID muis van 6-8 weken oud voorafgaand aan de operatie. Muizen met een gewicht van tussen de 14-18 g worden gebruikt in deze studie.
- Het scheren van de bovenste centrale en hypochondrisch abdominale regio van de muis met de tondeuse. Toepassing van haar crème gelijkmatig in de hele regio verwijderen met een spatel om volledig de bijgesneden haren te verwijderen. Verwijder de haren voorzichtig met behulp van een stuk natte steriele katoen na 2-5 min.
- Plaatst u de muisaanwijzer in de zaal Isofluraan en ontgrendelen van de klep van de zuurstof cilinder. Het handhaven van de zuurstof stroom met de snelheid van 4 L/min en de verdamping Isofluraan 4% voor het opwekken van de verdoving.
- Zorg ervoor dat de muis correct heeft zijn verdoofd door zachte teen knijpen.
- Plaats een bord chirurgie binnen een bioveiligheid kabinet. Plaats het dier op het bord van de operatie, zodat het ventrale gedeelte van de muis boven ligt en het voorste gedeelte van de muis in de neus kegel aangesloten op de voorziening van Isofluraan en zuurstof wordt geplaatst.
- Vermindering van de verdamping Isofluraan tot 2% en gedurende de chirurgische procedure handhaven.
- Desinfecteren van de huid van de muis en het steriliseren door af te vegen met 70% ethanol gedrenkte steriele katoen.
2. de chirurgische Procedure
-
Gedeeltelijke Hepatectomy
- Maak een dwarse snede van ongeveer 1 cm in de huid net onder het borstbeen, loodrecht aan de xiphoid process en parallel aan de ribbenkast, met behulp van rechte operationele schaar.
- De huid is aangesloten met de buikspier laag in de nabijheid van de ingesneden gebied met pincet of steriele bevochtigd katoen tips onderscheid maken tussen huid en buikspier laag zachtjes te scheiden. Geniet de intradermale regio met PBS met behulp van steriele katoen tips te onttrekken aan uitdroging.
- Het gebied van de linker kwab soepel bloot doordat een dwarse incisie door de peritoneale laag net onder de xiphoid. Gebruik twee bevochtigd katoen tips om bloot en de linker kwab van de lever op te heffen.
- Plaats een van de tips van katoen op de buik kant van het deelstuk uitmaakt, en plaats nog een katoen-tip aan de kant van het middenrif. Zachtjes druk op de tip geplaatst naar het middenrif, en geven een glijdende duw door het andere uiteinde op te heffen van de linker kwab van de lever.
- Glijden van een nylondraad met een lus door de opgeheven linker kwab, en schuif de lus naar de basis van de linker kwab dichtbij de Hilus met behulp van de micro-pincet of katoen tips. Voorzichtig duw de nylon draad lus aan de basis van de linker kwab.
- Twee uiteinden van de nylondraad over de bovenkant van de linker kwab met behulp van een naald-houder van de microchirurgie en de micro verlostang binden. Maak twee extra knopen aan de andere kant.
- Ontleden uit de gebonden kwab met de hulp van schaar. Probeer niet te snijden zeer dicht bij de wol. In het geval dat de procedure duurt meer dan 5 min, houd de peritoneale Holte en organen vochtig met steriele PBS te vermijden uitdroging als gevolg van vocht verlies.
- Naai het buikvlies via continue hechten een 4-0 Catgut hechtdraad. Vervolgens sluit de huid door discontinue wordt zo spoedig mogelijk.
-
Cell Transplantation
Opmerking: De GFP waarin hepatocyten werden geïsoleerd van transgene GFP muizen (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), volgens de procedure die wordt beschreven door Lee et al. 22 en Shen et al. 23 hepatocyte-achtige cellen (NeoHep) van menselijke oorsprong onderscheiden van monocyten24 werden ook gebruikt voor transplantatie. Cellen die verkregen uit andere bronnen kunnen echter ook worden gebruikt in het protocol.- Schorten 0,2 miljoen levensvatbare cellen in ongeveer 50 µL van Iscove van bewerkt Dulbecco Medium (IMDM) en het gecombineerd in een 1 mL insuline spuit afgetopt met 30G naald. Houd de injectiespuit koude door deze te plaatsen op het ijs.
- Plaats de muis op een manier die het linkergedeelte van de laterale gezichten omhoog richting de persoon uitvoeren van chirurgie. Identificeer de milt gebied en dwars het ontleden van de huid in de buurt van de hypochondrisch regio, gevolgd door een korte incisie door de peritoneale laag wil bloot van de milt.
- Zachtjes til de milt en houdt dat het buiten de holte met de hulp van twee PBS bevochtigd katoen tips.
- De milt zorgvuldig met twee katoen tips in de ene hand houd, en plaats de naald van de spuit precies verticaal aan de milt. Zachtjes doorboren de milt en de naald druk zeer langzaam binnen; de naald moet niet dieper dan 2 mm krijgen.
- Duw de zuiger van de spuit langzaam te injecteren van de cellen in de milt. Na de transplantatie, houd de naald van de spuit stabiel en verwijder het langzaam van de milt te voorkomen bloeden of verlies van cellen.
- Na het plaatsen van de milt terug in de peritoneale holte met de tips van katoen, vlakbij de peritoneale laag continu wordt met een 4-0 Catgut hechtdraad. Naai de huid met met de dezelfde hechtdraad. Vermijd het gebruik van wond clips voor het sluiten van de huid; in plaats daarvan, sluit u dit door een 4-0 hechtdraad. De wond clips beperken de natuurlijke beweging van de muis, en vaak clips worden losse en snel komen.
3. post-operatieve zorg
- Veeg na het sluiten van de huid, de omgeving van zowel de hechtdraad sites met jodiumoplossing (betadine) met behulp van een steriele katoen-tip.
- Injecteren van een dosis antibiotica cefotaxime zoals 600 mg/kg (meestal 12 mg cefotaxime in 100 µL van zoutoplossing/muis) intraperitoneally lichaamsgewicht met behulp van de 1 mL spuit.
- Geven dagelijkse doses van pijnstillende Meloxicam als 1 mg/kg lichaamsgewicht (meestal 12 µg Meloxicam in 100 µL van zoutoplossing/muis) aan het dier intraperitoneally, maximaal drie dagen na de operatie.
- Na voltooiing van de operatie, de stroom van Isofluraan gas stoppen en plaatst u de muisaanwijzer weer in het individueel geventileerde kooi.
4. euthanization and Characterizations
- Na de experimentele eindpunten (1 dag en 10 dagen na chirurgie), euthanaseren de muizen volgens de richtlijnen van de institutionele dierenethiek.
- Het verzamelen van bloed door terminaal het verbloeden van de dieren, de oogbeschadigingen en/of terminal plexus prikken.
- Serum uit het bloed te isoleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocyte proliferatie na 30% gedeeltelijke hepatectomy: De proliferatie van hepatocyten in de resterende lever na 30% hepatectomy werd onderzocht door immunohistochemische (IHC) kleuring voor een cel proliferatie marker, Ki-67. Eendaagse post hepatectomy, de muizen waren euthanized, de resterende lever kwabben waren weggesneden en paraffine secties werden verkregen. De secties zijn gekleurd met Ki-67 antilichaam, gevolgd door etikettering met horseradish peroxidase (HRP) geconjugeerd secundair antilichaam. Di-Amino Benzidine (DAB) werd gebruikt als basismateriaal voor HRP voor de ontwikkeling van bruine kleur gebeitst cellen worden geïdentificeerd. De kern was teller gekleurd met haematoxyline en bekeken onder een 20 X objectieve Microscoop. Figuur 1 toont een representatief beeld van de IHC van een lever sectie. Ongeveer 13% van de cellen (13.66 ± 0.317, N = 3) Ki-67 waren positief, die bevestigd dat een 30% hepatectomy proliferatie van hepatocyten in de lever van de muis vergemakkelijkt.
Anatomische studie: Een representatief beeld van de lever van een KNIPOOG. SCID muis, 10 dagen post hepatectomy is afgebeeld in Figuur 2. Dit beeld bevestigd dat de resterende lever gezond met geen zichtbare afwijkingen.
Aanwezigheid van getransplanteerde cellen tijdens het eerste uur van chirurgie: De homing van de getransplanteerde cellen werd bevestigd met flow cytometrische analyse door het onderzoek van de aanwezigheid van GFP positieve hepatocyten 2 uur na de transplantatie.
Een eencellige opschorting is verkregen uit de milt en de lever van de host-muis na 2 uur van GFP-hepatocyten transplantatie van de boeken van de enzymatische vertering van het verwijderde weefsel. Het percentage getransplanteerde GFP positieve cellen werd geschat aan de hand van een cytometer stroom. Een scatter-gate werd geselecteerd uit de overeenkomstige FSC-WS dot plot te elimineren van het puin en doublet cellen. De poort van het kwadrant van de plot ontstond door de intensiteit van de fluorescerende achtergrond van cel schorsingen verkregen uit de milt en de lever van een controle muis waarin geen cellen werden overgeplant. Ongeveer 1,7% GFP positieve hepatocyten werden gevonden in de milt, en geen GFP hepatocyten werden gevonden in de lever 2 uur na de transplantatie. Representatieve gegevens zijn afgebeeld in Figuur 3.
Immunohistochemistry: Tien dagen na chirurgie, de muizen waren euthanized, en de juiste laterale kwab, de juiste mediale kwab en de linker mediale lobben van de lever werden weggesneden en cryo-afdelen werd uitgevoerd om te verkrijgen 5 µm secties. Deze secties zijn dan onderzocht voor de homing en engraftment van de getransplanteerde cellen. Figuur 4 toont de representatieve beelden van immunohistochemical (IHC) kleuring tegen anti-GFP (rood) te identificeren van het GFP uiting van muizen hepatocyten (deelvenster A, Ben C); en tegen anti-menselijke albumine (rood), evenals tegen connexin 32 (groen), hepatocyte-achtige cellen (NeoHep) van menselijke oorsprong worden geïdentificeerd ( D, E, Fen Gvan het deelvenster). De kern werd counterstained met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blauw) in beide gevallen. In deze afbeelding panelen, een paar werk GFP uiting van hepatocyten (deelvenster A, Ben C) en NeoHep (paneel D, E, Fen G) zijn duidelijk zichtbaar.
Biochemische analyse van lever uitgescheiden enzymen: Om te controleren de functionaliteit van de lever na de chirurgische ingreep, werd biochemische analyse van verschillende secreted leverenzymen uitgevoerd. De staafdiagrammen in Figuur 5 vertegenwoordigen de gemiddelde waarde van aspartaataminotransferase (AST), alanineaminotransferase (ALT) en alkalische fosfatase (ALK-PHOS) in het serum van gezonde knik. SCID muizen, en verschillende groepen ten dele hepatectomized muizen. Het is duidelijk uit de grafiek dat na 1 dag hepatectomy, niveaus van AST, ALT en ALK-PHOS enzymen sterk toegenomen, in vergelijking met de gezonde muizen.
Niveau van de ALT en AST-enzym werden teruggezet naar normaal, terwijl ALK-PHOS niveaus bleef hoog tien dagen chirurgie bij niet-getransplanteerde muizen post. Echter, de niveaus van alle drie enzymen gedaald tot normale in getransplanteerde muizen na 10 dagen.
Lever histologisch onderzoek: De lever monsters van de hepatectomized en de getransplanteerde muizen werden verder verwerkt voor histologisch analyse te bestuderen van de anatomische veranderingen na operatie. Figuur 6 toont het representatieve helder veld beelden van haematoxyline en eosine (H en E) gekleurd lever secties van gezonde muizen zonder chirurgie, 1 dag post gedeeltelijke hepatectomy en 10 dagen na gedeeltelijke hepatectomy en NeoHep transplantatie. In deze beelden, leverschade als gevolg van de milde peri-biliaire fibrose of bindweefsel verspreiding werd waargenomen na 1 dag van gedeeltelijke hepatectomy en geen afwijkingen werden waargenomen tien dagen na chirurgie.
Figuur 1 : Een representatief beeld van Ki-67-verkleuring van de NOD. SCID lever sectie na 1 dag van 30% hepatectomy. Sectie was gekleurd met Ki-67 antilichaam, horseradish peroxidase (HRP) geconjugeerd secundair antilichaam, DAB (bruin) werd gebruikt als HRP substraat en kernen werden counterstained door Haematoxyline (blauw). De indicatieve pijlpunten wijzen op enkele van de Ki-67 positieve (bruin) cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Geregenereerd lobben van de lever van een KNIPOOG. SCID muis 10 dagen na chirurgie. A: Spiegelse kwab (Spiegelse proces), B: laterale lobe, rechts van de C: mediale lobe, D: mediale lobe, hart E:, F: resterende links rechts links laterale kwab na hepatectomy en G: Spiegelse kwab (papillaire proces). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Percentage van GFP positieve muis heptatocytes in de milt en de lever van een knik. SCID muis. De bovenste panelen tonen het profiel van de cel van een leeftijd gecompenseerde controle muis waarin geen cellen werden overgeplant. Lagere panelen tonen de cel profiel na 2 uur van GFP hepatocyte transplantatie in een hepatectomized muis. De y-as van de percelen duidt de intensiteit van de fluorescentie van GFP (FITC kanaal) gemeten in willekeurige eenheden op de schaal van een logboek, en de x-as geeft de voorwaartse spreiding (FSC) in willekeurige eenheden op lineaire schaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : De homing van getransplanteerde GFP uiting van muis hepatocyten en NeoHep in de lever van geregenereerde host. Representatieve beelden van lever secties van een gedeeltelijk hepatectomized knik. SCID muis getransplanteerde met GFP positieve muis hepatocyten (A-C), weergegeven: cel engraftment en homing. Paneel A: Nucleus (blauwe: DAPI), paneel B: anti-GFP (Red: Alexa Fluor 594), paneel C: samengevoegde afbeelding. Panelen (D-G) weergeven lever sectie van de gedeeltelijk hepatectomized knik. SCID muis in welke NeoHep waren getransplanteerd. Deelvenster D: Nucleus (blauwe: DAPI), paneel E: menselijke anti-Connexin-32 (groen: Alexa Fluor 488), paneel F: menselijke anti-albumine (Red: Alexa Fluor 594) en deelvenster G: samengevoegde afbeelding. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Biochemische analyse van verschillende lever uitgescheiden enzymen in muizen serum. De staven met de gemiddelde waarden van verschillende enzymen (AST/SGOT, ALT/SGPT, ALK-PHOS) kolom. Het tijdstip van studie na chirurgie wordt weergegeven op de X-as. In de controlegroep, waren er leeftijd afgestemd knik. SCID muizen en geen chirurgie werd uitgevoerd. Foutbalken betekenen de standaardfout van het gemiddelde, N = 3 en * geeft p< 0,05, NS geeft aan niet-betekenis bij p> 0,05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Histopathologisch onderzoek van muizen lever weefselsecties. Representatieve helder veld microscopie beelden van haematoxyline en eosine (H en E) gekleurd lever weefselsecties van knik. SCID muizen onder 20 X objectief. Deelvenster A geeft een lever onderdeel van een gezonde KNIPOOG. SCID muis van dezelfde leeftijd zonder elke operatie. Paneel B toont een lever sectie 1 dag post gedeeltelijke hepatectomy. In dit beeld geven pijlpunten de milde peri-billiary fibrose of bindweefsel proliferatie regio. Paneel C toont een lever sectie tien dagen post gedeeltelijke hepatectomy en cel transplantatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gedeeltelijke hepatectomy is een gevestigde techniek voor behandelende lever regeneratie en buitensporige hepatectomy is gemeld na te bootsen de AHF model. Dierlijke modellen van AFH behoren knaagdieren, met name muizen, tot de meest onderzochte model. Om op te halen van een model van de lever schade bij muizen, tot een 70% hepatectomy is gemeld met een goede overleving tarief25,26. Echter in naakt en andere immunodeficiëntie muis, een 70% hepatectomy is gemeld als fatale en dieren gestorven binnen 24 uur27.
Mitchell en Willenbring28 aangetoond een reproduceerbare en goed getolereerd methode voor de gedeeltelijke hepatectomy 2/3 in muizen. Voor knik. SCID muizen, kregen we een 100% overlevingskans, toen de hepatectomy was beperkt tot de resectie van de linker kwab van lever, die dicht bij 30% van de totale massa van de lever. In overeenstemming met de opmerkingen over naakt muizen27vastgesteld we hebben dat een verdere toename van het percentage van de hepatectomy in KNIPOOG. SCID muis leidt tot een dramatische verlaging van de overlevingskans. Bovendien, proliferatie van hepatocyten in de resterende lever lobben post 1 dag van 30% gedeeltelijke hepatectomy bevestigd het nut van deze procedure in transplantatie en engraftment studies.
In een meer recente papier, Ahmed vanaf et al. 29 is gebleken dat een procedure voor Intrahepatische hepatocellulaire carcinoom xenografts in immunodeficiëntie muizen. Zij hebben aangetoond een procedure voor transplantatie van tumorcellen in verschillende organen, met inbegrip van de milt, en hepatectomy om Intrahepatische engraftment uitgevoerd.
In de procedures gerapporteerd door Mitchell28 en Ahmed29, is er een kans voor verfijningen doordat veel kleinere incisies, zoals kleinere insnijdingen zijn over het algemeen de voorkeur in de chirurgie. Er is bewijs30 die een kleinere lengte chirurgische incisies tot minder secretie van stresshormonen, zoals cortisol en catecholamine leidt. Daarnaast vonden we dat procedures met betrekking tot een grotere incisie een hoger niveau van vaardigheden vereist en moeilijker te reproduceren zijn, ten opzichte van procedures met twee kleinere incisies.
In deze paper, wij hebben beschreven een procedure waarin minimale incisie moet bloot de linker kwab van de lever en, na het uitvoeren van een hepatectomy van 30%, was een andere kleine incisie gemaakt om de milt waar cellen werden geïmplanteerd bloot te stellen. Deze procedure is niet vereist geen gespecialiseerde chirurgische vaardigheden en kan worden afgerond in 5-7 minuten. Bovendien, we vonden geen bewijs van alle morfologische of anatomische afwijking in de resterende lever massa, zoals blijkt uit de histologische onderzoek. Bovendien was er een afwezigheid van ischemie of necrose tijdens de chirurgische ingreep van de week van 6-8-oude immuun gecompromitteerd muizen. De inductie van lever schade na gedeeltelijke hepatectomy wordt bevestigd door de verhoogde niveaus van serum voor leverenzymen AST, ALT en ALK-PHOSin muizen. Een intrasplenic route werd gekozen voor cel transplantatie over andere veneuze routes, omdat de portal veneuze systeem hogere toegankelijkheid in de lever cortex dan andere veneuze systemen heeft. We hebben aangetoond dat de transplantatie van hepatocyten geïsoleerd uit een transgene GFP-muis en NeoHep die zijn gedifferentieerd hepatocyte-achtige cellen van menselijke oorsprong, in gedeeltelijk hepatectomized knik. SCID dieren. De procedure beperkt niet het type cellen die worden gebruikt voor transplantatie.
Echter, deze procedure geen de AHF voorwaarde in een muis, als slechts een 30% gedeeltelijke hepatectomy wordt uitgevoerd. Deze beperkte hepatectomy biedt een proliferatieve mogelijkheden aan hepatocyten aanwezig in de resterende lever, die daardoor extra mogelijkheden voor getransplanteerde hepatocyten voor engraftment biedt. Het slechts toont het migratie- en engraftment van hepatocyten, en NeoHep van de milt aan de lever, en geen extra schade aan de lever wordt toegebracht door de transplantatie-procedure.
Al met al kan deze procedure is eenvoudig, en worden beoefend en gemakkelijk onder de knie om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Het regeneratieve potentieel van de verschillende cellulaire bronnen (stamcellen of cellen van de hepatocyte-achtige) in het kader van de lever letsel, of de lever regeneratie studie, kan gemakkelijk met deze chirurgische ingreep worden geëvalueerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de core subsidie ontvangen van de afdeling van de biotechnologie, van de Indiase regering aan de nationale Instituut van immunologie, New Delhi. Dr. Bhattacharjee de huidige adres is een divisie van gastro-enterologie, leverziekten en voeding, Children's Hospital Los Angeles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase's analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure? Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , http://www.who.int/surgery/publications/s16383e.pdf (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
