Summary
Abbiamo descritto un protocollo per l'esecuzione di epatectomia parziale (PHx) e trapianto di cellule via della milza nel cenno del capo. SCID (CENNO DEL CAPO. CB17-Prkdcscid/j) topi. In questo protocollo, un'incisione è fatta per esporre e resecare il lobo sinistro del fegato seguito da un'altra incisione per il trapianto di cellule intrasplenic.
Abstract
Hepatectomy parziale è un metodo versatile e riproducibile per studiare la rigenerazione del fegato e l'effetto di terapeutica delle cellule basata in varie circostanze patologiche. Epatectomia parziale facilita anche la maggiore attecchimento e la proliferazione delle cellule trapiantate da neovascolarizzazione accelerante e migrazione delle cellule verso il fegato. Qui, descriviamo un semplice protocollo per eseguire 30% hepatectomy e trapianto di cellule nella milza di un diabetico non obeso/grave combinata NOD immunodeficienti. SCID (CENNO DEL CAPO. CB17-Prkdcscid/j) mouse.
In questa procedura, due piccole incisioni sono fatte. La prima incisione è quello di esporre e resecare il lobo sinistro del fegato, e un'altra piccola incisione è fatta per esporre la milza per il trapianto di cellule intrasplenic. Questa procedura non richiede alcuna abilità chirurgiche specializzate, e può essere completato in 5-7 minuti con meno stress e dolore, recupero più veloce e migliore sopravvivenza. Abbiamo dimostrato il trapianto di epatociti isolati da una proteina fluorescente verde (GFP) esprimendo mouse (transgenici C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), come pure dell'epatocita come cellule di origine umana (NeoHep) in parzialmente epatectomizzati NOD. Topi SCID.
Introduction
Attualmente, il trapianto dell'epatocita è proposto come alternativa al trapianto d'organo intero per trattare i pazienti con gravi disturbi del fegato. Si ritiene che esso possa colmare pazienti per trapianto di organo intero1. Oltre il trapianto allogenico epatociti2, epatociti xenogenica3 ed epatociti derivati da cellule staminali4 sono anche indagati in modelli animali. In questo contesto, l'homing e attecchimento potenziale delle cellule trapiantate nel destinatario è un criterio importante per la terapia cellulare basata nell'insufficienza epatica acuta (AHF).
Per indagare il trapianto di epatociti o dell'epatocita-come le cellule5, AHF viene creato in un modello animale da chirurgica6 o farmacologici7 procedure, seguite da trapianto di cellule. Per rendere un modello animale di AHF di reagenti farmacologici, molti epatotossine come d-galattosamina8, acetaminofene9, tetracloruro di carbonio10, thioacetamide11, concanavalina A12, Lipopolisaccaride13 , ecc., sono stati utilizzati. Da questa lista, ogni reagente genera un insieme unico di funzionalità per AHF, ma purtroppo nessun singolo reagente imita gli AHF umano. Inoltre, gli AHF indotto da epatotossine richiede molto tempo, che mette gli animali in condizioni di stress cronico, e risultati riproducibili sono difficili da ottenere.
D'altra parte, l'intervento chirurgico di epatectomia parziale (PHx) è dipendente di abilità e risultati riproducibili sono facili da ottenere dopo lo sviluppo di competenze richieste. Per indurre AHF tramite intervento chirurgico da solo, la resezione di più del 70% del fegato è richiesta; Tuttavia, meno di un'epatectomia 70% ancora possa essere utilizzata per studiare l'attecchimento e la proliferazione di trapiantate cellule nel fegato per analizzare le loro capacità terapeutiche durante i danni al fegato14. Il trapianto di epatociti sono stati eseguiti post epatectomia attraverso il peritoneo15, coda vena16, vena epatica17o la milza18. Attualmente, infusione della vena epatica e intrasplenic trapianto di epatociti sono le procedure di comodo, come sono più facili da riprodurre.
In questo articolo, abbiamo descritto una procedura per una 30% di epatectomia parziale in NOD. SCID (CENNO DEL CAPO. CB17-Prkdcscid/J) topi in cui viene asportato il lobo sinistro del fegato. È seguito da trapianto di epatociti di mouse (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) che esprimono GFP 0,2 milioni nonché di origine umana NeoHep19 nella milza. Questa procedura conduce all'attecchimento delle cellule trapiantate nel fegato. Questa procedura è meno invasiva e una tecnica minimamente dolorosa.
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Protocol
Le procedure presentate in questo protocollo sono state approvate dal comitato di etica animale istituzionale dell'Istituto nazionale di immunologia, Nuova Delhi. Il numero di riferimento seriale dell'approvazione è IAEC n. 319/13.
Nota: Ci sono ottime risorse su procedure di chirurgia generale20 e protocolli specifici per la chirurgia del roditore21. Per quelli che fanno chirurgia animale per la prima volta, è consigliabile per ampiamente pratica procedure chirurgiche su manichini prima di operare sugli animali.
1. preparazione
- Prima dell'esperimento, mantenere la soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS) o salino pronto.
- Assemblare un kit chirurgico contenente forbici, forcipe dentato, pinze, cotone, cotton fioc, fili di nylon e porta aghi micro differenti. Sterilizzare in autoclave il kit chirurgico. Dovrebbe prestare particolare attenzione se un cenno di immuno-compromessi. Mouse di SCID è incluso nel protocollo.
- Eseguire la procedura sperimentale completa, dalla preparazione alla conclusione della chirurgia, della bio-sicurezza classe gabinetto.
- Pesare un cenno del capo. Mouse di SCID di 6-8 settimane prima dell'intervento. In questo studio vengono utilizzati topi pesano fra 14-18 g.
- Radere la regione centrale e ipocondriaca addominale superiore del mouse con il tagliacapelli. Applicare la crema in modo uniforme in tutta la regione di epilazione con una spatola per rimuovere completamente i peli tagliati. Rimuovere i peli delicatamente con l'aiuto di un pezzo di cotone sterile bagnato dopo 2-5 min.
- Posizionare il mouse nella camera di isoflurano e sbloccare la valvola della bombola di ossigeno. Mantenere il flusso di ossigeno al ritmo di 4 L/min e la vaporizzazione di isoflurane al 4% per indurre l'anestesia.
- Assicurarsi che il mouse è stato anestetizzato correttamente pizzicando punta delicata.
- Collocare una tavola di chirurgia all'interno di una biosicurezza armadio. Metti l'animale sul Consiglio di chirurgia, tale che la porzione ventrale del mouse è rivolto verso l'alto e la parte anteriore del mouse è posizionata all'interno del cono di naso collegato all'alimentazione isoflurano e ossigeno.
- Ridurre la vaporizzazione di isoflurane al 2% e mantenerla durante tutta la procedura chirurgica.
- Disinfettare la pelle del mouse e sterilizzarlo strofinando con cotone sterile imbevuto di etanolo al 70%.
2. intervento chirurgico
-
Epatectomia parziale
- Fare un'incisione trasversale di circa 1 cm nella pelle appena sotto il sterno, perpendicolare al processo xifoideo e parallelamente la gabbia toracica, con l'aiuto di Forbici rette operative.
- Separare delicatamente la pelle attaccata con lo strato del muscolo addominale in prossimità della zona incisa con forcipe o punte sterili di cotone inumidito di distinguere tra pelle e strato del muscolo addominale. Godetevi la regione intradermica con PBS usando suggerimenti di cotone sterile per evitare il disseccamento.
- Esporre l'area del lobo sinistro senza problemi facendo un'incisione trasversale attraverso lo strato peritoneale appena sotto al xifoideo. Utilizza due punte di cotone inumidito per esporre e sollevare il lobo sinistro del fegato.
- Inserire una punta di cotone sul lato addominale del taglio e inserire un'altra punta di cotone sul lato del diaframma. Delicatamente premere la punta posizionata verso il diaframma e dare una Spinta scorrevole dall'altra punta per sollevare il lobo sinistro del fegato.
- Infilare un filo di nylon con un ciclo attraverso il lobo sinistro sollevato, quindi il ciclo verso la base del lobo di sinistra vicino al hilum con l'aiuto delle punte micro-forcipe o cotone. Spingere delicatamente verso il basso il loop di filo di nylon alla base del lobo di sinistra.
- Legare due estremità del filo di nylon nella parte superiore del lobo di sinistra usando il forcipe micro e un porta-aghi microchirurgia. Fare due nodi aggiuntivi sul lato opposto.
- Sezionare il lobo legato con l'aiuto di forbici. Non tentare di tagliare molto vicino il thread. Nel caso in cui la procedura dura più di 5 min, mantenere la cavità peritoneale e organi umido con PBS sterile per evitare disidratazione a causa della perdita di liquidi.
- Cucire il peritoneo di sutura continua utilizzando una sutura in Catgut 4-0. Successivamente, chiudere la pelle suturando discontinuo nel minor tempo possibile.
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Trapianto di cellule
Nota: Gli epatociti che esprimono GFP sono stati isolati da topi transgenici GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), secondo la procedura descritta da Lee et al. 22 e Shen et al. 23 hepatocyte-come le cellule (NeoHep) di origine umana differenziati dai monociti24 sono state utilizzate anche per il trapianto. Tuttavia, le cellule derivate da altre fonti possono essere utilizzate anche nel protocollo.- Sospendere 0,2 milioni cellule vitali in circa 50 µ l di per volta Dulbecco di Iscove Medium (IMDM) e aspirare in una siringa da insulina 1 mL con ago 30g. Tenere la siringa freddo mettendo sul ghiaccio.
- Posizionare il mouse in modo che la parte laterale sinistra rivolto verso l'alto verso la persona che effettua l'intervento chirurgico. Identificare l'area splenica e sezionare trasversalmente la pelle vicino alla regione ipocondriaca, seguita da una breve incisione attraverso lo strato peritoneale solo per esporre la milza.
- La milza di sollevare delicatamente e tenere di fuori della cavità con l'aiuto di due PBS inumidito punte in cotone.
- Tenere la milza attentamente con due punte in cotone in una mano e inserire l'ago della siringa esattamente verticale alla milza. Delicatamente bucare la milza e spingere l'ago molto lentamente all'interno; l'ago non dovrebbe ottenere più profondo di 2 mm.
- Abbassare lentamente il pistone della siringa per iniettare le cellule della milza. Dopo il trapianto, mantenere stabile l'ago della siringa e rimuoverlo lentamente dalla milza per evitare sanguinamenti o perdita di cellule.
- Dopo aver posizionato la milza indietro nella cavità peritoneale con le punte di cotone, chiudere il livello peritoneale suturando continuo con una sutura in Catgut 4-0. Cucire la pelle in maniera discontinua con la sutura stessa. Evitare l'uso di ferita clip per la chiusura della pelle; invece, chiuderlo facendo una sutura 4-0. Le clip di ferita limitano il naturale movimento del mouse, e spesso clip si allentano e uscire rapidamente.
3. post-operatorio
- Dopo aver chiuso la pelle, pulire i dintorni di entrambi i siti di sutura con soluzione di iodio (betadine) utilizzando una punta di cotone sterile.
- Iniettare una dose di antibiotica cefotaxime come 600 mg/kg di peso (in genere 12 mg cefotaxime in 100 µ l di soluzione salina/mouse) corporeo intraperitonealmente usando la siringa da 1 mL.
- Dare dosi giornaliere di Meloxicam analgesico come 1 mg/kg di peso corporeo (in genere 12 µ g Meloxicam in 100 µ l di soluzione salina/mouse) all'animale intraperitonealmente, fino a tre giorni dopo l'intervento chirurgico.
- Dopo il completamento della chirurgia, fermare il flusso di gas isoflurano e posizionare il mouse nella gabbia individualmente ventilata.
4. euthanization e caratterizzazioni
- Dopo i punti finali sperimentali (1 giorno e 10 giorni dopo l'intervento), eutanasia i topi secondo le linee guida istituzionali etica animale.
- Raccogliere il sangue mediante terminalmente sanguinamento gli animali, perforando il plesso terminale oculare.
- Isolare il siero dal sangue.
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Representative Results
Proliferazione degli epatociti dopo hepatectomy parziale del 30%: La proliferazione degli epatociti nei rimanenti del fegato dopo epatectomia 30% è stata esaminata secondo immunoistochimica (IHC) per un indicatore di proliferazione delle cellule, Ki-67. Un giorno post epatectomia, i topi sono stati sacrificati, i lobi del fegato restanti sono stati asportati e sezioni della paraffina sono state ottenute. Le sezioni sono state macchiate con anticorpo Ki-67, seguita da etichettatura con anticorpo secondario coniugato con perossidasi (HRP) di rafano. Di-Amino benzidina (DAB) è stata utilizzata come substrato per HRP per lo sviluppo di colore marrone per identificare cellule marcate. Il nucleo era contatore colorato con ematossilina e hanno visto sotto un microscopio obiettivo 20x. La figura 1 Mostra un'immagine IHC rappresentativa di una sezione del fegato. Circa il 13% delle cellule (± 13.66 0,317, N = 3) erano Ki-67 positivo, che ha confermato che un 30% hepatectomy facilita la proliferazione degli epatociti in fegato del topo.
Studio anatomico: Un'immagine rappresentativa del fegato di un cenno del capo. Mouse di SCID, 10 giorni post epatectomia è illustrato nella Figura 2. Questa immagine ha confermato che il rimanente fegato sano senza le anomalie visibili.
Presenza di cellule trapiantate durante la prima ora della chirurgia: L'homing delle cellule trapiantate è stata confermata con l'analisi cytometric di flusso esaminando la presenza degli epatociti positivi GFP 2 ore dopo il trapianto.
Una sospensione unicellulare è stata ottenuta da milza e nel fegato del mouse host dopo digestione enzimatica del tessuto asportato post 2 ore di trapianto GFP-epatociti. La percentuale di cellule positive trapiantate GFP è stata stimata utilizzando un citometro a flusso. Un cancello a dispersione è stato selezionato dal corrispondente dot plot FSC-SSC per eliminare le cellule di detriti e doppietto. Il cancello del quadrante della trama è stato creato dall'intensità del fluorocromo sfondo delle sospensioni di cellule ottenute da milza e nel fegato di un mouse di controllo in cui sono state trapiantate senza cellule. Circa 1,7% positivi epatociti GFP sono stati trovati nella milza, e nessun epatociti GFP sono stati trovati nel fegato 2 ore dopo il trapianto. Dati rappresentativi sono mostrati nella Figura 3.
Immunoistochimica: Dieci giorni post-chirurgia, i topi sono stati sacrificati e il lobo laterale di destra, il lobo mediale di destra e il sinistro mediali lobi del fegato sono stati asportati e cryo-sezionamento è stato effettuato per ottenere 5 µm sezioni. Queste sezioni sono state quindi esaminate per l'homing e l'attecchimento delle cellule trapiantate. La figura 4 Mostra le immagini rappresentative di immunoistochimica (IHC) colorazione contro anti-GFP (rosso) per identificare la GFP esprimendo gli epatociti di topi (pannello A, Be C); e contro anti-umano dell'albumina (rosso), come pure anti-umani connexin 32 (verde), per identificare degli epatociti-come le cellule (NeoHep) di origine umana (pannello D, E, Fe G). Il nucleo era controcolorato con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blu) in entrambi i casi. In questi pannelli di immagine, alcuni GFP engrafted esprimendo epatociti (pannello A, Be C) e NeoHep (pannello D, E, Fe G) sono chiaramente visibili.
Analisi biochimica del fegato secreti enzimi: Al fine di verificare la funzionalità del fegato dopo l'intervento chirurgico, l'analisi biochimica dei diversi enzimi secreti del fegato è stato effettuato. I grafici a barre in Figura 5 rappresentano il valore medio di aspartato aminotransferasi (AST), alanina aminotransferasi (ALT) e fosfatasi alcalina (ALK-PHOS) nel siero di NOD sano. Topi SCID e diversi gruppi di parzialmente epatectomizzati topi. È evidente dal grafico che dopo 1 giorno di epatectomia, i livelli degli enzimi AST, ALT e ALK-PHOS aumentato significativamente, quando rispetto ai topi sani.
I livelli di enzima ALT e AST sono stati ristabiliti al normale, mentre sono rimasti elevati i livelli di ALK-PHOS post chirurgia di dieci giorni in topi trapiantati non. Tuttavia, i livelli di tutti e tre gli enzimi è sceso a normali in topi trapiantati dopo 10 giorni.
Esame istologico del fegato: I campioni del fegato del epatectomizzati e topi trapiantati sono stati ulteriormente elaborati per l'analisi istologica di studiare la post-chirurgia cambiamenti anatomici. Figura 6 Mostra il campo luminoso rappresentanza immagini di ematossilina ed eosina (H ed E) macchiati sezioni del fegato di topi sani senza chirurgia, 1 giorno post-epatectomia parziale e 10 giorni dopo epatectomia parziale e trapianto di NeoHep. In queste immagini, danni al fegato a causa della proliferazione di fibrosi o tessuto connettivo peri-biliare lieve è stato osservato dopo 1 giorno di epatectomia parziale, e nessuna anomalia è stata osservata post-chirurgia dieci giorni.
Figura 1 : Un'immagine rappresentativa di Ki-67 che macchia di NOD. Sezione di SCID del fegato dopo 1 giorno di 30% hepatectomy. Sezione è stato macchiato con l'anticorpo Ki-67, coniugati con perossidasi di rafano (HRP) anticorpo secondario e DAB (marrone) è stato usato come substrato HRP e nuclei erano controcolorati di ematossilina (blu). Le punte di freccia indicative sottolineare alcune delle cellule Ki-67 positive (marrone). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Rigenerato i lobi del fegato di un cenno del capo. Post-chirurgia 10 giorni del mouse di SCID. R: caudato lobo (processo caudato), b: a destra laterale del lobo, a destra c: lobo mediale, d: sinistra lobo mediale, cuore e:, f: restanti del lobo laterale di sinistra dopo hepatectomy e g: lobo caudate (processo papillare). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Percentuale di GFP positivo del mouse heptatocytes nella milza e nel fegato di un cenno del capo. Mouse di SCID. Pannelli superiori mostrano il profilo di cella di un mouse di controllo abbinato di età in cui le celle non sono state trapiantate. Pannelli inferiori mostrano il profilo di cella dopo 2 ore di GFP dell'epatocita trapianto in un mouse epatectomizzati. L'asse y delle trame denota l'intensità di fluorescenza di GFP (canale FITC) misurato in unità arbitrarie su scala logaritmica, e l'asse x denota il forward scatter (FSC) in unità arbitrarie su una scala lineare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : L'homing delle trapiantato GFP esprimendo epatociti del topo e NeoHep nel fegato rigenerato host. Immagini rappresentative delle sezioni del fegato di un parzialmente epatectomizzati NOD. Mouse di SCID trapiantato con epatociti GFP positivo del topo (A-C), mostrando engraftment delle cellule e Radiobussola. Pannello r: nucleo (blu: DAPI), pannello b: anti-GFP (rosso: Alexa Fluor 594), immagine di c: pannello Merged. Pannelli (D-G) mostrano parte del fegato della parzialmente epatectomizzati NOD. Mouse di SCID in cui NeoHep sono stati trapiantati. Pannello d: nucleo (blu: DAPI), e: pannello umano anti-connessina 32 (verde: Alexa Fluor 488), pannello f: anti-albumina umana (rosso: Alexa Fluor 594) e pannello g: Merged image. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Analisi biochimica del fegato diverso secreti enzimi nel siero di topi. Barre di colonna rappresentano i valori medi di diversi enzimi (AST/SGOT, ALT/SGPT, ALK-PHOS). Il punto di tempo di studio post-operatorio è indicato sull'asse X. Nel gruppo di controllo, c'erano pari età cenno del capo. Topi SCID e nessun intervento chirurgico è stato effettuato. Barre di errore indicano l'errore standard della media, N = 3 e * indica p< 0,05, NS indica non significatività a p> 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Studio istopatologico delle sezioni del tessuto del fegato di topi. Immagini di microscopia del campo luminoso rappresentante di ematossilina ed eosina (H ed E) sezioni di tessuto del fegato di NOD macchiate. Topi SCID sotto 20 X lente dell'obiettivo. Pannello A Mostra una sezione del fegato da un cenno sano. Mouse di SCID della stessa età senza alcun intervento chirurgico. Pannello B Mostra una giorno 1 sezione del fegato post epatectomia. In questa immagine, punte di freccia indicano la regione di proliferazione mite peri-billiary fibrosi o tessuto connettivo. Pannello C Mostra un sezione del fegato dieci giorni post parziale hepatectomy e trapianto di cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Hepatectomy parziale è una tecnica consolidata per inquirenti rigenerazione del fegato e hepatectomy eccessivo è segnalato per imitare il modello AHF. Tra modelli animali di AHF, roditori, soprattutto topi, sono il modello più ricercato. Per ottenere un modello di disturbo al fegato in topi, fino a un hepatectomy di 70% è stato segnalato con una buona sopravvivenza tasso25,26. Tuttavia in altri mouse immunodeficiente e nudo, un hepatectomy di 70% è stato segnalato come irreversibile e animali sono morto entro 24 ore27.
Mitchell e Willenbring28 ha dimostrato un metodo riproducibile e ben tollerato per 2/3 epatectomia parziale in topi. Per cenno del capo. Topi SCID, abbiamo ottenuto un tasso di sopravvivenza del 100% quando l'epatectomia è limitata fino alla resezione del lobo sinistro del fegato, che è quasi il 30% della massa totale del fegato. In linea con le osservazioni su topi nudi27, abbiamo osservato che gli aumenti ulteriormente la percentuale di hepatectomy in cenno. Mouse di SCID conduce ad un drammatico abbassamento del tasso di sopravvivenza. Inoltre, post lobi proliferazione degli epatociti nei rimanenti del fegato 1 giorno di epatectomia parziale 30% ha confermato l'utilità di questa procedura di trapianto e studi di engraftment.
In una carta più recente, S.U. Ahmed et al. 29 hanno dimostrato una procedura per xenotrapianti di carcinoma epatocellulare intraepatico in topi immunodeficienti. Essi hanno dimostrato una procedura per il trapianto delle cellule del tumore in vari organi, tra cui la milza ed eseguita hepatectomy per facilitare l'attecchimento intraepatico.
Nelle procedure riportate da Mitchell28 e Ahmed29, c'è un'opportunità per perfezionamenti facendo incisioni molto più piccole, come più piccole incisioni sono generalmente preferiti in chirurgia. Non c'è prova30 che una più piccola incisione chirurgica lunghezza conduce a meno la secrezione degli ormoni dello stress, come il cortisolo e catecolamine. Inoltre, abbiamo trovato che le procedure che coinvolgono una grande incisione richiedono un maggiore livello di competenze e sono più difficili da riprodurre, rispetto alle procedure aventi due più piccole incisioni.
In questo articolo, abbiamo descritto una procedura in cui incisione minima è necessaria per esporre il lobo sinistro del fegato e, dopo aver eseguito un hepatectomy di 30%, un'altra piccola incisione è stata effettuata per esporre la milza dove le cellule sono state impiantate. Questa procedura non richiede alcuna abilità chirurgica specializzata e può essere completata in 5-7 min. Inoltre, abbiamo non trovato alcuna prova di qualsiasi anomalia morfologica o anatomica nella massa del fegato restante, come testimoniano gli esami istologici. Inoltre, c'era un'assenza di ischemia o di necrosi durante la procedura chirurgica della settimana 6-8-vecchio immune compromesso topi. L'induzione del disturbo al fegato dopo epatectomia parziale è confermata dai livelli elevati del siero di topi AST, ALT e ALK-PHOSin degli enzimi epatici. Un itinerario intrasplenic è stato scelto per trapianto di cellule su altre rotte venosi, perché il sistema venoso portale ha maggiore accessibilità nella corteccia del fegato rispetto ad altri sistemi venosi. Abbiamo dimostrato il trapianto di epatociti isolati da un topo transgenico GFP e NeoHep che sono differenziati dell'epatocita-come le cellule di origine umana, in parzialmente epatectomizzati NOD. Animali di SCID. La procedura non limita il tipo di celle utilizzate per il trapianto.
Tuttavia, questa procedura non crea la condizione di AHF in un mouse, come solo un 30% di hepatectomy parziale viene eseguito. Questa limitata hepatectomy fornisce un potenziale proliferativo agli epatociti presenti nel fegato restante, che quindi fornisce ulteriori opportunità per gli epatociti trapiantati per attecchimento. Dimostra solo la migrazione e l'attecchimento dei hepatocytes e NeoHep dalla milza al fegato, e ulteriori danni al fegato non avviene mediante la procedura di trapianto.
Sopra tutti, questa procedura è semplice e può essere praticata e imparata facilmente per ottenere risultati riproducibili. Il potenziale rigenerativo delle diverse fonti cellulari (cellule staminali o dell'epatocita-come le cellule) nel contesto del disturbo al fegato, o lo studio della rigenerazione del fegato, può essere valutato facilmente con questa procedura chirurgica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla concessione core ricevuta dal dipartimento di biotecnologia, governo dell'India per l'Istituto nazionale di immunologia, Nuova Delhi. Indirizzo attuale di Dr. Bhattacharjee è divisione di gastroenterologia, Epatologia e nutrizione, Ospedale Los Angeles dei bambini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
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