Summary
Hemos descrito un protocolo para la realización de hepatectomía parcial (PHx) y trasplante de la célula vía bazo en cabeceo. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/j) ratones. En este protocolo, se realiza una incisión para exponer y resecar el lóbulo izquierdo del hígado, seguido por otra incisión para el intrasplenic trasplante de células.
Abstract
Hepatectomía parcial es un método versátil y reproducible para el estudio de la regeneración hepática y el efecto de la terapéutica celular basado en diversas condiciones patológicas. Hepatectomía parcial también facilita el engraftment aumento y proliferación de las células trasplantadas por neovascularización aceleración y migración de células hacia el hígado. Aquí, describimos un protocolo simple para realizar 30% hepatectomía y trasplante de células en el bazo de un no obeso diabético grave había combinado NOD inmunodeficiente. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/j) ratón.
En este procedimiento, se realizan dos pequeñas incisiones. La primera incisión es para exponer y resecar el lóbulo izquierdo del hígado, y otra pequeña incisión para exponer el bazo para el intrasplenic trasplante de células. Este procedimiento no requiere ninguna habilidad quirúrgica especializada y puede realizarse en 5-7 minutos con menos estrés y dolor, una recuperación más rápida y mejor supervivencia. Hemos demostrado el trasplante de hepatocitos aislados de una proteína fluorescente verde (GFP) expresando su ratón (transgénicos C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), así como los hepatocitos como células de origen humano (NeoHep) en hepatectomized parcialmente NOD. Ratones de SCID.
Introduction
Actualmente, trasplante de hepatocitos es propuesto como una alternativa al trasplante de órgano entero para tratar a los pacientes tener severos trastornos hepáticos. Se cree que puede superar a los pacientes de trasplante de órgano entero1. Además de los hepatocitos alogénicos2, hepatocitos xenogénica3 y hepatocitos derivados de las células4 también están siendo investigados en modelos animales. En este contexto, el engraftment y autoguiado hacia el blanco potencial de las células trasplantadas en el receptor es un criterio importante para la terapia celular basada en la insuficiencia hepática aguda (AHF).
Para investigando el trasplante de hepatocitos o de hepatocitos como las células5, AHF se crea en un modelo animal por quirúrgico6 o procedimientos farmacológicos7 , seguidos de transplante de células. Para hacer un modelo animal de la AHF por reactivos farmacológicos, muchas hepatotoxins como la d-galactosamina8, acetaminofén9, tetracloruro de carbono10, tioacetamida11, concanavalina A12, lipopolysaccharide13 , etcetera., se han utilizado. De esta lista, cada reactivo genera un conjunto de características únicas para AHF, pero lamentablemente no solo reactivo imita el humano AHF. Por otra parte, el AHF inducido por hepatotoxins lleva mucho tiempo, que pone a los animales bajo estrés crónico, y son difíciles de obtener resultados reproducibles.
Por otra parte, la intervención quirúrgica de hepatectomía parcial (PHx) es dependiente de la habilidad y la reproducibilidad es fácil de obtener después de desarrollar las habilidades necesarias. Para inducir AHF por solo la intervención quirúrgica, la resección de más del 70% del hígado se requiere; sin embargo, menos de una hepatectomía del 70% todavía puede ser utilizada para estudiar el engraftment y proliferación de trasplantar las células en el hígado para analizar su capacidad terapéutica en daño hepático14. El trasplante de hepatocitos han sido realizadas post hepatectomía por el peritoneo15, cola vena16, vena hepática17o el18del bazo. Actualmente, la infusión de la vena hepática y intrasplenic trasplante de hepatocitos son los procedimientos preferidos, ya que son fáciles de reproducir.
En este trabajo hemos descrito un procedimiento de una hepatectomía parcial del 30% en cabeceo. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/J) ratones en el que el lóbulo izquierdo del hígado es suprimido. Es seguida por el trasplante de hepatocitos de ratón (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) expresando GFP 0,2 millones así como origen humano NeoHep19 en el bazo. Este procedimiento conduce al engraftment de células trasplantadas en el hígado. Este procedimiento es menos invasivo y una técnica mínimamente dolorosa.
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Protocol
En este protocolo los procedimientos han sido aprobados por el Comité institucional de ética Animal del Instituto Nacional de Inmunología, en Nueva Delhi. El número de serie de referencia de la aprobación es AICE #319/13.
Nota: Hay excelentes recursos en procedimientos de cirugía general20 y protocolos específicos para roedores cirugía21. Para aquellos haciendo cirugía animal por primera vez, se recomienda ampliamente practicar procedimientos quirúrgicos en maniquíes antes de operar a los animales.
1. preparación
- Antes del experimento, se mantenga estéril tamponada de fosfato salino (PBS) o solución salina preparada.
- Montar un kit de cirugía contiene tijeras, pinzas dentadas, pinzas de tejido, algodón, bastoncillos de algodón, hilos de nylon y portaagujas diferentes micro. Autoclave el kit de cirugía. Debe tener especial cuidado si un GUIÑO inmuno-comprometidos. Ratón SCID está incluido en el protocolo.
- Realizar el procedimiento experimental completo, desde la preparación hasta el final de la cirugía, en la bio-seguridad clase I gabinete.
- Pesar un GUIÑO. Ratón SCID de 6-8 semanas antes de la cirugía. Ratones que pesen entre 14-18 g son utilizados en este estudio.
- Afeitado de la región abdominal central e hipocondríaco superior del ratón con el recortador de vellos. Aplicar el cabello eliminación crema uniformemente en toda la región con una espátula para eliminar completamente el vello recortado. Quite los pelos con la ayuda de un trozo de algodón estéril húmedo después de 2-5 minutos.
- Colocar el ratón en la cámara de isoflurano y abrir la válvula de la botella de oxígeno. Mantener el flujo de oxígeno a razón de 4 L/min y la vaporización de isoflurano en el 4% para inducir anestesia.
- Asegúrese de que el ratón ha sido anestesiado correctamente pellizcando suave del dedo del pie.
- Coloque un tablero de cirugía dentro de una bioseguridad gabinete. Coloque el animal en el tablero de la cirugía, tal que la porción ventral del ratón es hacia arriba y la porción anterior del ratón se coloca dentro del cono de nariz conectado a la fuente de isoflurano y el oxígeno.
- Reducir la vaporización de isoflurano al 2% y mantener durante todo el procedimiento quirúrgico.
- Desinfectar la piel del ratón y esterilizar limpiándolo con algodón estéril empapado etanol al 70%.
2. quirúrgico
-
Hepatectomía parcial
- Realizar una incisión transversal de aproximadamente 1 cm en la piel justo debajo del esternón, perpendicular en el proceso de xiphoid y paralelo a la caja torácica, con la ayuda de tijeras de operación recta.
- Separe suavemente la piel atada con la capa del músculo abdominal en las cercanías de la zona Incisa con puntas de algodón estéril humedecido para distinguir entre la piel y la capa de músculo abdominal o fórceps. Empape la región intradérmica con PBS utilizando puntas de algodón estéril para evitar la desecación.
- Exponga el área del lóbulo izquierdo suavemente haciendo una incisión transversal a través de la capa peritoneal justo por debajo del xifoides. Utilizar dos puntas de algodón humedecido para exponer y levantar el lóbulo izquierdo del hígado.
- Una de las puntas de algodón en el lado abdominal del corte y otra punta de algodón en el lado del diafragma. Suavemente presione la punta a hacia el diafragma y dar un impulso corredero por el otro extremo para levantar el lóbulo izquierdo del hígado.
- Deslice un hilo de nylon con un bucle el lóbulo izquierdo levantado y deslice el lazo hacia la base del lóbulo izquierdo cerca del hilio con la ayuda de los consejos micro pinzas o algodón. Presione suavemente el bucle de hilo de nylon a la base del lóbulo izquierdo.
- Atar dos extremos del hilo de nylon en la parte superior del lóbulo izquierdo con un Portaagujas de microcirugía y las micro pinzas. Hacer dos nudos adicionales en el otro lado.
- Disecan hacia fuera del lóbulo atado con la ayuda de tijeras. No intente cortar muy cerca del hilo. En caso de que el procedimiento dura más de 5 min, mantener la cavidad peritoneal y órganos húmedos con PBS estéril para evitar la desecación debido a la pérdida de líquidos.
- Coser el peritoneo utilizando sutura continua sutura Catgut 4-0. Posteriormente, cerca de la piel por la sutura discontinua lo antes posible.
-
Trasplante de la célula
Nota: Los hepatocitos expresan GFP fueron aislados de ratones transgénicos GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), según el procedimiento descrito por Lee et al. 22 y Shen et al. 23 hepatocito-como las células (NeoHep) de origen humano diferenciado de monocitos24 también fueron utilizadas para el trasplante. Sin embargo, las células derivadas de otras fuentes pueden utilizarse también en el protocolo.- Suspender las células viables 0,2 millones en alrededor de 50 μl de medio de modificado Dulbecco de Iscove (IMDM) y aspirar en una jeringa de insulina 1 mL con aguja de 30 G. Mantenga la jeringa fría puesta en hielo.
- Colocar el ratón de manera que la parte lateral izquierda se enfrenta hacia la persona que realiza la cirugía. Identificar el área esplénico y transversalmente disecar la piel cerca de la región hipocondríaco, seguida de una corta incisión a través de la capa peritoneal para exponer el bazo.
- Levante el bazo suavemente y mantener que fuera de la cavidad con la ayuda de dos PBS humedecido puntas de algodón.
- Sostenga el bazo cuidadosamente con las dos puntas de algodón en una mano y coloque la aguja de la jeringa vertical exactamente en el bazo. Perforar el bazo y empuje la aguja muy lentamente en el interior; la aguja no debe recibir más de 2 mm.
- Empuje el émbolo de la jeringa lentamente para inyectar las células en el bazo. Después del trasplante, mantener estable la aguja de la jeringa y retire lentamente desde el bazo para evitar sangrado o pérdida de las células.
- Después de colocar el bazo hacia la cavidad peritoneal con las puntas de algodón, cerca de la capa peritoneal continua de sutura con una sutura de Catgut 4-0. Coser la piel discontinuo con la misma sutura. Evitar el uso de clips de herida para el cierre de la piel; en cambio, cerrarla por una sutura de 4-0. Los clips de herida restringen el movimiento natural del ratón, y a menudo clips soltarse y salen rápidamente.
3. postoperatorio cuidado
- Tras el cierre de la piel, limpie los alrededores de los sitios de sutura con solución de yodo (betadine) usando una punta de algodón estéril.
- Inyectar una dosis de antibiótico cefotaxima como 600 mg/kg de peso (típicamente 12 mg cefotaxima en 100 μl de solución salina y el ratón) corporal por vía intraperitoneal utilizando jeringa de 1 mL.
- Dar dosis diarias de analgésico Meloxicam 1 mg/kg peso corporal (típicamente 12 μg Meloxicam en 100 μl de solución salina y el ratón) a los animales por vía intraperitoneal, hasta tres días después de la cirugía.
- Después de la terminación de la cirugía, detener el flujo de gas isoflurano y volver a colocar el ratón en la jaula individualmente ventilada.
4. euthanization y caracterizaciones
- Después de las variables experimentales (1 día y 10 días post cirugía), eutanasia a los ratones según las pautas del ética animal institucional.
- Recoger la sangre por hemorragia terminal los animales, pinchar el plexo terminal ocular.
- Aislar el suero de la sangre.
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Representative Results
Proliferación de hepatocitos después de hepatectomy parcial 30%: La proliferación de hepatocitos en el resto de hígado después de hepatectomy 30% fue examinada por inmunohistoquímica (IHC) para un marcador de proliferación celular, Ki-67. Un día post hepatectomía, los ratones fueron sacrificados, los lóbulos de hígado restantes fueron suprimidos y se obtuvieron secciones de la parafina. Las secciones fueron teñidas con anticuerpos Ki-67, seguido por etiquetado con rábano peroxidasa (HRP) conjugado de anticuerpo secundario. Di-Amino metil bencidina (DAB) fue utilizado como substrato para HRP para el desarrollo de color marrón para identificar células. El núcleo fue contador teñidos con hematoxilina y vistas bajo un microscopio objetivo de 20 X. La figura 1 muestra una imagen representativa del IHC de una sección del hígado. Aproximadamente 13% de las células (13.66 ± 0.317, N = 3) eran Ki-67 positivo, que confirmó que una hepatectomía 30% facilita la proliferación de hepatocitos en el hígado de ratón.
Estudio anatómico: Una imagen representativa del hígado de un GUIÑO. Ratón SCID, 10 días post hepatectomía se muestra en la figura 2. Esta imagen confirmó que el hígado restante era sano sin anormalidades visibles.
Presencia de células trasplantadas durante primera hora de la cirugía: El autoguiado hacia el blanco de las células trasplantadas fue confirmado con análisis cytometric del flujo mediante el examen de la presencia de hepatocitos positivo GFP 2 horas después del trasplante.
Una suspensión unicelular fue obtenida del bazo y el hígado del ratón anfitrión después de la digestión enzimática del tejido suprimido post 2 horas del trasplante de hepatocitos de GFP. El porcentaje de células positivas de GFP trasplantadas se estimó utilizando un citómetro de flujo. Una puerta de dispersión fue seleccionada de la correspondiente trama de puntos FSC-SSC para eliminar las células desechos y doblete. La puerta del cuadrante del diagrama fue creada por la intensidad del fluorocromo de fondo de suspensiones celulares obtenidas desde el bazo y el hígado de un ratón de control en el que no hay células fueron trasplantadas. Alrededor de 1,7% hepatocitos positivo GFP se encontraron en el bazo, y no hepatocitos GFP se encontraron en el hígado 2 horas después del trasplante. Datos representativos se muestran en la figura 3.
Inmunohistoquímica: Cirugía después de diez días, los ratones fueron sacrificados y el lóbulo lateral derecho, el lóbulo medial derecho y el izquierdo lóbulos mediales del hígado fueron suprimidos y seccionamiento crio fue realizado para obtener secciones μm 5. Estas secciones fueron luego examinadas para el autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células trasplantadas. La figura 4 muestra las imágenes representativas de inmunohistoquímica (IHC) tinción contra anti-GFP (rojo) para identificar la GFP expresando hepatocitos de ratones (panel A, By C); y contra albúmina humana (rojo), así como anti-humano connexin 32 (verde), para identificar células similares a hepatocitos (NeoHep) de origen humano (panel D, E, Fy G). El núcleo fue contratinción con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, azul) en ambos casos. En estos paneles de imagen, unos engrafted GFP expresión de hepatocitos (panel A, By C) y NeoHep (panel D, E, Fy G) son claramente visibles.
Análisis bioquímico del hígado secretan enzimas: Para comprobar la funcionalidad del hígado después del procedimiento quirúrgico, se realizó el análisis bioquímico de las diferentes enzimas secretados de hígado. Los gráficos de barras en la figura 5 representa el valor medio de aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT) y fosfatasa alcalina (ALK PHOS) en el suero de NOD saludable. Ratones de SCID y diferentes grupos de ratones de hepatectomized parcialmente. Está claro en el gráfico que después de 1 día de hepatectomía, niveles de las enzimas AST, ALT y ALK PHOS aumentaron significativamente, en comparación con los ratones sanos.
Los niveles de la enzima ALT y AST fueron restaurados a la normalidad, mientras que niveles de ALK PHOS se mantuvo altos post cirugía de diez días en ratones no trasplantados. Sin embargo, los niveles de los tres enzimas cayeron a normal en ratones trasplantados después de 10 días.
Estudio histológico del hígado: Las muestras de hígado de la hepatectomized y ratones trasplantados más fueron procesadas para que análisis histológico para el estudio de la cirugía después de cambios anatómicos. La figura 6 muestra el campo brillante representativo imágenes de hematoxilina y eosina (H y E) manchados hígadas secciones de ratones sanos sin necesidad de cirugía, 1 día post hepatectomía parcial y 10 días post hepatectomía parcial y el trasplante de NeoHep. En estas imágenes, daños en el hígado debido a la proliferación de fibrosis o tejido conectivo peri-biliar leve fue observada después de 1 día de hepatectomía parcial, y se observaron ningunas anormalidades cirugía después de diez días.
Figura 1 : Una imagen representativa de la tinción de Ki-67 de NOD. Sección de SCID hígado después de 1 día de hepatectomía de 30%. Sección estaba manchada con el anticuerpo Ki-67, peroxidasa de rábano (HRP) había conjugado de anticuerpo secundario, DAB (marrón) fue utilizado como sustrato HRP y núcleos fueron contratinción por hematoxilina (azul). Las puntas de flecha indicativas señalan algunas de las células positivas (marrón) de Ki-67. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Regenera hígados lóbulos de un GUIÑO. SCID ratón 10 días después de la cirugía. R: caudado lóbulo (proceso caudado), B: derecho lóbulo lateral, C: derecho lóbulo medial, D: lóbulo medial, corazón E:, F: restantes a la izquierda del lóbulo lateral izquierdo después de hepatectomy y G: lóbulo caudado (proceso papilar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Porcentaje de GFP positivas ratón heptatocytes en el bazo y el hígado de un GUIÑO. Ratón SCID. Los paneles superiores muestran el perfil de la célula de un ratón de control emparejado de edad en la que no hay células fueron trasplantadas. Paneles inferiores muestran el perfil celular después de 2 horas de trasplante de hepatocitos GFP en un ratón hepatectomized. El eje y de las parcelas denota la intensidad de la fluorescencia de GFP (canal de FITC) medida en unidades arbitrarias en una escala logarítmica y el eje x indica la dispersión hacia delante (FSC) en unidades arbitrarias en una escala lineal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : El homing de GFP trasplantado expresando hepatocitos de ratón y NeoHep en el hígado de host regenerado. Imágenes representativas de las secciones de hígado de un hepatectomized parcialmente CABECEAN. Ratón de SCID transplantado con hepatocitos de positivo ratón GFP (A-C), mostrando el engraftment de la célula y autoguiado hacia el blanco. Panel A: núcleo (azul: DAPI), grupo B: anti-GFP (rojo: Alexa Fluor 594), imagen de Panel C: Merged. Paneles (D-G) ver sección de hígado de hepatectomized parcialmente NOD. Se trasplantaron ratón SCID en que NeoHep. Panel D: núcleo (azul: DAPI), Panel E: humano anti-Connexin 32 (verde: Alexa Fluor 488), F: Panel humano anti-albúmina (rojo: Alexa Fluor 594) y Panel G: Merged imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Análisis bioquímico del hígado diferentes secretadas de enzimas en suero de ratones. Barras de columna representan los valores medios de las diferentes enzimas (AST/SGOT, SGPT/ALT, ALK PHOS). El punto del tiempo de estudio después de la cirugía se muestra en el eje X. En el grupo control, hubo edad emparejado NOD. Ratones de SCID y ninguna cirugía fue realizada. Barras de error significan el error estándar de la media, N = 3 y * indica p< 0,05 NS indica la no importancia a p> 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Estudio histopatológico de las secciones de tejido de hígado de ratones. Imágenes de microscopía de campo brillante representante de hematoxilina y eosina (H y E) secciones de tejido hepático de NOD mancharon. Ratones de SCID en objetivo de 20 X. Panel A muestra una sección de hígado de un gesto saludable. Ratón SCID de la misma edad sin ninguna cirugía. Panel B muestra una hepatectomía parcial post hígado sección 1 día. En esta imagen, cabezas de la flecha indican la región de proliferación fibrosis o tejido conectivo peri-hepáticos leves. Panel C muestra un hígado sección diez días parcial hepatectomy y celular trasplante del poste. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hepatectomía parcial es una técnica establecida para investigar la regeneración hepática y hepatectomía excesiva se divulga para imitar el modelo de AHF. Entre los modelos animales de AHF, roedores, especialmente ratones, son el modelo más investigado. Para obtener un modelo de daño hepático en ratones, hasta una hepatectomía del 70% se ha divulgado con una buena supervivencia tasa25,26. Sin embargo en nude y otro ratón inmunodeficiente, una hepatectomía del 70% fue reportada como grave y animales murieron dentro de 24 horas27.
Mitchell y Willenbring28 demostraron un método reproducible y bien tolerado para la hepatectomía parcial 2/3 en ratones. Para cabeceo. Ratones de SCID, se obtuvo una tasa de supervivencia de 100% cuando la hepatectomía se limitó hasta la resección del lóbulo hepático izquierdo, que es cerca del 30% de la masa hepática total. En consonancia con las observaciones en ratones desnudos27, observamos que cualquier aumento en el porcentaje de hepatectomía en cabeceo. Ratón SCID conduce a una dramática disminución de la tasa de supervivencia. Además, post de lóbulos de proliferación de hepatocitos en el resto de hígado 1 día de hepatectomía parcial 30% confirmó la utilidad de este procedimiento en los estudios de injerto y trasplante.
En un artículo más reciente, S.U. Ahmed et al. 29 han demostrado un procedimiento de xenoinjertos de carcinoma hepatocelular intrahepática en ratones inmunodeficientes. Han mostrado un procedimiento de trasplante de células del tumor en varios órganos, incluyendo el bazo y realiza hepatectomía para facilitar el engraftment intrahepático.
En el procedimiento reportado por Mitchell28 y Ahmed29, hay una oportunidad para refinamientos haciendo incisiones mucho más pequeñas, como incisiones más pequeñas se prefieren generalmente en cirugía. Hay evidencia30 que una incisión quirúrgica más pequeña de longitud conduce a la menor secreción de hormonas de estrés, como cortisol y la catecolamina. Además, se encontró que los procedimientos que implican una incisión más grande requieren un mayor nivel de habilidades y son más difíciles de reproducir, en comparación con procedimientos teniendo dos incisiones más pequeñas.
En este trabajo hemos descrito un procedimiento en el que es necesaria mínima incisión para exponer el lóbulo izquierdo del hígado y, después de realizar una hepatectomía del 30%, se hizo otra incisión para exponer el bazo donde se implantaron las células. Este procedimiento no requiere ninguna habilidad quirúrgica especializada y puede realizarse en 5-7 min. Por otra parte, no encontramos evidencia de cualquier anormalidad anatómica o morfológica en la masa hepática restante, según lo evidenciado por estudios histológicos. Además, había una ausencia de isquemia o necrosis durante el procedimiento quirúrgico de la semana de 6-8-antiguo inmuno comprometidos ratones. La inducción de la lesión hepática después de hepatectomy parcial se confirma por los niveles elevados del suero de las enzimas hepáticas AST, ALT y ALK-PHOSin ratones. Una ruta intrasplenic fue elegida para el trasplante de células sobre otras vías venosas, debido a que el sistema venoso porta tiene mayor accesibilidad en la corteza del hígado que otros sistemas venosos. Hemos demostrado el trasplante de hepatocitos aislados de ratón transgénico GFP y NeoHep que son diferenciadas hepatocito-como las células de origen humano, en parte hepatectomized NOD. Animales SCID. El procedimiento no restringe el tipo de células utilizadas para el trasplante.
Sin embargo, este procedimiento crea la condición de AHF en un ratón, como se realiza sólo una hepatectomía parcial 30%. Este hepatectomía limitada ofrece un potencial proliferativo de hepatocitos en el hígado restante, que lo proporciona oportunidades adicionales de hepatocitos trasplantados para el engraftment. Sólo demuestra la migración y el engraftment de hepatocitos y NeoHep del bazo al hígado, y ningún daño adicional al hígado se realiza por el procedimiento de trasplante.
Sobre todo, este procedimiento es simple, ser practicado y dominado fácilmente para obtener resultados reproducibles. El potencial regenerativo de varias fuentes celulares (células madre o células similares a hepatocitos) en el contexto de lesión hepática, o el estudio de la regeneración del hígado, se puede evaluar fácilmente con este procedimiento quirúrgico.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la concesión de la base recibida del Departamento de biotecnología, gobierno de la India en el Instituto Nacional de Inmunología, en Nueva Delhi. Dirección actual del Dr. Bhattacharjee es la división de Gastroenterología, Hepatología y nutrición, Hospital Los Ángeles de los niños.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
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