Summary
天然聚丙烯酰胺凝胶电泳是分析RNA蛋白相互作用的基础工具。传统上大多数实验都使用垂直凝胶。然而，水平凝胶提供了几个优点，例如在电泳期间监测复合物的机会。我们提供生成和使用水平天然凝胶电泳的详细协议。
Abstract
天然聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学的基础工具，广泛应用于RNA-蛋白质相互作用的生物化学分析。这些相互作用传统上用两片玻璃板和垂直电泳样品之间产生的聚丙烯酰胺凝胶进行分析。然而，聚丙烯酰胺凝胶在托盘中浇铸并水平电泳提供了几个优点。例如，用于分析荧光RNA底物和特定蛋白质之间的复合物的水平凝胶可以在电泳进行时多次成像。这提供了在实验期间在几个点监测RNA-蛋白复合物的独特机会。此外，水平凝胶电泳可以并行分析许多样品。这可以大大促进时间实验以及同时分析多个反应以比较不同的组件和条件。我们这里制定详细的方案，用于生成和使用水平天然凝胶电泳分析RNA-蛋白质相互作用。
Introduction
电泳迁移率变动分析（EMSAs）已被证明是一种宝贵的生化工具分析特定的蛋白质-核酸相互作用1，2，3。这些检测可以提供关于蛋白质与RNA或DNA的结合亲和力的重要信息3 ，核酸 - 蛋白质复合物1的组分化学计量学，并通过底物竞争实验提供关于RNA结合蛋白的结合特异性的重要新见解1 。
用于这些测定的传统实验装置包括将纯化的蛋白质与放射性标记的RNA底物混合。然后用不变性（天然的）聚丙烯酰胺凝胶分析所得的复合物，将其倒入两个玻璃板之间，然后在垂直装置3中进行样品电泳。尽管这种方法已被彻底地用于提供蛋白质与核酸结合的基础的生物化学机制的重要见解，但它也具有一些限制。例如，这种基本策略具有相对低的吞吐量，并且不容易适用于需要并行分析许多结合反应的应用。此外，与传统的立式设备是有挑战性的电泳3,4期间潜在地监测在多个时间络合物。
这里，我们提出了使用铸造成平板装置天然聚丙烯酰胺凝胶，水平电泳和荧光标记的RNA底物4，5，6，7的EMSA分析的适应。将这些相对简单的修改结合到基本的strategy提供了一些强大的优势。特别地，水平平板格式很容易同时分析几十个样本4 。此外，对于一些RNA-蛋白复合物，例如在Bicaudal-C蛋白和其RNA底物之间形成的那些在水平凝胶中电泳的那些，提供了分辨不同RNA-蛋白复合物的增加的能力，并将它们与未结合的RNA底物区分开来。
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Protocol
水平天然聚丙烯酰胺凝胶的制备4 。
- 准备所需材料
- 对于水平凝胶装置，使用具有27cm×21cm托盘的凝胶盒（37cm×24cm），并容纳两个24孔梳子。此设置提供了总共48个样本，可以同时进行分析。
- 准备以下试剂：40％丙烯酰胺 - 双19：1,5x TBE（Tris-Borate-EDTA pH 8.0），TEMED和10％APS（过硫酸铵）。
- 生成10％天然丙烯酰胺凝胶。
- 在500mL烧瓶中，加入80mL 5x TBE，100mL 40％丙烯酰胺和水，至最终体积为400mL。
- 加入4 mL 10％APS和400μLTEMED。混合好
- 将混合物倒入水平铸造托盘中，使凝胶聚合30分钟。凝胶将约2厘米厚。
注意：凝胶可以放入通风橱中加速聚合。聚合后，薄层的液体将保留在凝胶的顶部。 - 将液体倒出并用运行缓冲液冲洗。小心地取出梳子，使用注射器用运行缓冲液冲洗孔。
- 准备运行缓冲区。
- 为凝胶盒准备2 L 1x TBE运行缓冲液。用1600 mL稀释400 mL 5XTBE并混合。将1x TBE缓冲液放在冷藏室中冷却。
- 预运行凝胶
- 将2升冷运行缓冲液加入凝胶盒中并插入凝胶。
- 在冷藏室中，在4℃下将凝胶在120V预处理1小时。在此期间，制备结合反应。
绑定反应8
- 2.1。制备以下反应组分。
20 mM DTT
10mM BSA
10mM酵母tRNA
5X结合缓冲液（50mM HEPES pH 8.0,5mM EDTA，0mM KCl，0.2％Tween-20）
购自商业上购买的100nM荧光素标记的RNA
浓缩Bicaudal-C蛋白
在DEPC处理的H 2 O中的50％甘油
DEPC处理的H 2 O - 在无RNA酶的微量离心管中装配结合反应组分。
- 向管中加入5μL的10mM BSA，5μL的20mM DTT，5μL的10mM酵母tRNA，10μL的5x结合缓冲液。
- 在50μL中加入最终浓度为250 nM的蛋白。加水至最终体积为45μL。
- 加入5μL荧光标记的RNA底物。使用商业上购买的3'荧光素标记的32核苷酸底物。
- 在室温下混合并在黑暗中孵育30分钟。
3.天然水平聚丙烯酰胺凝胶样品分析
- 在每次反应中，加入15μL50％甘油，轻轻混匀。
- Carefu每次反应加入30μL凝胶。可以装入单个孔的样品量根据凝胶的厚度和孔的大小而变化。我们已经将体积少至15μL和多达45μL加入到用24孔梳子制成的单个孔中，并且倾倒到2cm的厚度。
- 将电源连接到凝胶装置开关电源并调节电压。在120℃下在4℃下运行凝胶。
注意：对于水平凝胶装置，其结果为约5V / cm。对于垂直凝胶装置，这是16 V / cm。- 为了防止荧光标记的RNA的破坏或漂白，在黑暗中进行电泳。
- 根据正在分析的RNA-蛋白质复合物的特异性而改变电泳时间。
注意：水平EMSA分析的主要优点是可以停止电泳，凝胶成像，然后再进行电泳l可以放回装置，电泳可以持续更长时间。
凝胶成像
- 使用任何设计用于检测和成像荧光底物的仪器进行分析。
- 将凝胶放在成像仪上。
- 调整成像器设置。对于荧光素标记的RNA配体，请使用以下设置：FAM（波长473 nm），750倍光电倍增管电压（PMT），100μm像素大小。
- 扫描凝胶以捕获图像。
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Representative Results
为了证明水平天然凝胶电泳的功能和多功能性，我们分析了非洲爪蟾 Bicaudal-C（Bicc1）蛋白与含有Bicc1结合位点的荧光标记RNA的结合。 Bicc1蛋白用作特异性mRNA翻译阻遏期间动物发展9，10，11，12的母体阶段以及特定器官的成人13,14的功能的控制细胞命运决定。我们的在爪蟾工作确定第一结合位点对于一个Bicc1蛋白8：32核苷酸区域从Cripto的-1 mRNA的8,12的3'UTR。使用RNase保护技术的组合来定义该结合位点离子和足迹测定， 体内结合实验和体外 EMSA测定8 。
纯化的非洲爪蟾 Bicc1蛋白与荧光标记的32个核苷酸RNA混合;来自Cripto-1 mRNA的Bicc1结合位点8 。在单独的反应中，将Bicc1蛋白与来自细胞周期蛋白B1 mRNA的3'UTR的荧光标记的32个核苷酸RNA混合。 Bicc1不结合细胞周期蛋白B1的mRNA 8,12和该RNA作为阴性对照。每个反应的一半在垂直天然聚丙烯酰胺凝胶上分析（ 图1A ），而另一部分使用水平天然凝胶并行分析（ 图1B ）。使用Bicc1与RNA Cripto-1 RNA结合并形成特异性复合物a的任一种方法是显而易见的并且它不结合细胞周期蛋白B1阴性对照RNA。然而，当用水平凝胶分析时，Bicc1-Cripto-1复合物显着更加明显，促进了它们的检测并且允许从未结合的RNA区分蛋白质-RNA复合物。成像后，将凝胶放回凝胶装置中并再电泳三个半小时。在重新成像凝胶后，复合物进一步迁移并且仍然易于检测，表明它们的稳定性（ 图1C ）。在初始成像后继续进行电泳和分析的这种能力将是垂直凝胶形式的挑战性的，甚至是不可能的。
图1：用于分析Bicc1与Cripto1 RNA的结合的垂直和水平天然凝胶的比较。双使用32核苷酸荧光CyclinB1 RNA阴性对照或荧光32核苷酸Cripto1 RNA阳性对照进行cc1结合实验。每个反应含有0nM或250nM的SUMO-Bicc1 N-末端，并在（ A ）垂直聚丙烯酰胺天然凝胶上在4℃在120V下运行30分钟或在水平聚丙烯酰胺天然凝胶中作为重复样品进行分析（ B ）在4℃下120V下2小时或4℃下120℃下（ C ）5.5小时。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
非变性聚丙烯酰胺凝胶是用于研究蛋白质-RNA相互作用和传统上这些凝胶是垂直电泳2,3的宝贵工具。我们已经使用该替代创建和水平1，4，6，7，15电泳天然聚丙烯酰胺凝胶的协议的修改。与荧光标记的RNA底物组合使用的这些变化为蛋白质 - RNA结合相互作用的生物化学分析提供了许多优点。这些优点包括以下内容：与需要泵将缓冲液从下腔室转移到上部的垂直设备相比，缓冲液的混合简化，可以用较大的孔产生水平凝胶，其提供增加的分析能力ger样品，水平凝胶上的电泳通常提供与垂直凝胶相比提高的RNA-蛋白复合物的分辨率，并且水平凝胶电泳提供在分析期间在多个时间点进行成像实验的能力。
另一个主要优点是水平格式适用于创建具有大量井的凝胶，提供并行分析多个样品的能力1 。该功能显着扩展了其作为分析RNA-蛋白质相互作用的生化工具的用途。例如，分析多个样品的能力有助于通过使用竞争实验15 ，k off分析15以及旨在定义结合复合物组分15的化学计量的实验来研究蛋白质-RNA复合物形成的定量参数。另外，使用a荧光RNA底物使得有可能执行多种分析，例如荧光偏振来自单个反应结合测定，将获得的定量和定性结合数据5，15。
为了从水平凝胶设置获得最佳结果，可以调整各种参数以提高复合物的成像质量。这些包括改变凝胶的丙烯酰胺百分数，以便更容易处理和增强蛋白质-RNA复合物与游离RNA的分离。然而，由于尺寸，可能难以处理低百分比的丙烯酰胺凝胶。我们发现最容易使用丙烯酰胺浓度为7.5％或更高的凝胶。此外，如果需要，可以改变电泳条件以提高蛋白质-RNA复合物的稳定性;调整电泳电压，在室温下运行凝胶ad在4°C，并调整预运行条件。
尽管有许多优点，但水平天然凝胶电泳测定也存在一些限制。例如，通过使用荧光RNA底物使其效用最大化。根据所选择的荧光团和RNA的大小，获得这样的底物可能是昂贵的。此外，水平凝胶通常远大于垂直凝胶，因此需要较大量的材料，例如聚丙烯酰胺和DEPC处理的溶液。
水平天然凝胶电泳必须被用作用于设法确定靶向临床相关RNA-蛋白质相互作用16化合物分子画面的验证工具的潜力。这样的筛选通常使用溶液生化测定来鉴定用于进一步研究的相关化合物。与垂直格式相比，水平格式的吞吐量潜力较高有机会应用天然凝胶电泳作为潜在候选人次要验证的工具。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
我们感谢Laura Vanderploeg准备数字。 NSF grant 1050395和NIH grant（R21HD076828）支持在Sheets实验室工作。 NIH授权R01GM117237和R01GM117008支持莱德实验室的工作。 Megan Dowdle通过美国威斯康星大学麦迪逊分校研究生院和生物技术培训项目通过国立卫生研究院国家综合医学研究所（T32GM008349）得到了SciMed GRS高级机会奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
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