Summary
La electroforesis en gel de poliacrilamida nativa es una herramienta fundamental para analizar las interacciones ARN-proteína. Tradicionalmente, la mayoría de los experimentos han utilizado geles verticales. Sin embargo, los geles horizontales proporcionan varias ventajas, tales como la oportunidad de monitorizar complejos durante la electroforesis. Proporcionamos un protocolo detallado para generar y usar electroforesis en gel nativa horizontal.
Abstract
La electroforesis nativa de gel de poliacrilamida es una herramienta fundamental de la biología molecular que se ha utilizado ampliamente para el análisis bioquímico de las interacciones ARN-proteína. Estas interacciones se han analizado tradicionalmente con geles de poliacrilamida generados entre dos placas de vidrio y muestras sometidas a electroforesis vertical. Sin embargo, los geles de poliacrilamida moldeados en bandejas y sometidos a electroforesis horizontalmente ofrecen varias ventajas. Por ejemplo, los geles horizontales utilizados para analizar complejos entre sustratos de ARN fluorescentes y proteínas específicas pueden ser visualizados múltiples veces a medida que avanza la electroforesis. Esto proporciona la oportunidad única de monitorear los complejos ARN-proteína en varios puntos durante el experimento. Además, la electroforesis en gel horizontal hace posible analizar muchas muestras en paralelo. Esto puede facilitar enormemente los experimentos en el curso del tiempo, así como analizar múltiples reacciones simultáneamente para comparar diferentes componentes y condiciones. Aquí estamosOvide un protocolo detallado para generar y usar electroforesis en gel nativa horizontal para analizar las interacciones ARN-Proteína.
Introduction
Los ensayos electroforéticos de cambio de movilidad (EMSA) han demostrado ser una herramienta bioquímica inestimable para analizar las interacciones proteína-ácido nucleico específicas 1 , 2 , 3 . Estos ensayos pueden proporcionar información importante con respecto a la afinidad de unión de las proteínas al ARN o al ADN 3 , a la estequiometría de componentes de los complejos ácido nucleico-proteína 1 y aportan nuevas e importantes ideas sobre la especificidad de unión de las proteínas de unión al ARN mediante experimentos de competición de sustratos 1 .
La configuración experimental tradicional para estos ensayos consiste en mezclar proteína purificada con un sustrato de ARN radiomarcado. Los complejos resultantes se analizan a continuación con geles de poliacrilamida no desnaturalizantes (nativos) vertidos entre dos placas de vidrio seguido por electroforesis de muestra en un aparato vertical 3. Si bien este enfoque se ha utilizado exhaustivamente para proporcionar importantes conocimientos en los mecanismos bioquímicos que subyacen a la unión de proteínas a los ácidos nucleicos, también tiene varias limitaciones. Por ejemplo, esta estrategia básica tiene un rendimiento relativamente bajo y no es fácilmente adaptable para aplicaciones que requieren analizar muchas reacciones de unión en paralelo. Además, con el aparato vertical tradicional es un desafío para potencialmente monitor de complejos en múltiples ocasiones durante la electroforesis [ 3 , 4] .
Aquí presentamos una adaptación del ensayo EMSA que utiliza geles nativos de poliacrilamida moldeados en un aparato de superficie plana, electroforesis horizontal y sustratos de ARN marcados fluorescentemente 4 , 5 , 6 , 7 . La incorporación de estas modificaciones relativamente simples a laTegy ofrece algunas ventajas poderosas. En particular, el formato de superficie plana horizontal se presta fácilmente para analizar docenas de muestras simultáneamente 4 . También, para algunos complejos de ARN-proteína, tales como los formados entre la proteína Bicaudal-C y su electroforesis de sustrato de ARN en un gel horizontal proporciona una mayor capacidad para resolver complejos de ARN-proteína distintos y discriminar éstos a partir del sustrato de ARN no unido.
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Protocol
1. Preparación del gel de poliacrilamida nativa horizontal 4 .
- Preparación de los materiales necesarios.
- Para el aparato de gel horizontal, utilice una caja de gel (37 cm x 24 cm) con una bandeja de 27 cm x 21 cm y una capacidad para dos peines de 24 pocillos. Esta configuración proporciona un total de 48 muestras que pueden analizarse simultáneamente.
- Preparar los siguientes reactivos: 40% de Acrilamida-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borato-EDTA pH 8,0), TEMED y 10% de APS (persulfato de amonio).
- Generación de un gel natural de acrilamida al 10%.
- En un matraz de 500 ml, se añaden 80 ml de TBE 5x, 100 ml de acrilamida al 40% y agua hasta un volumen final de 400 ml.
- Añadir 4 ml de APS al 10% y 400 μl de TEMED. Mezclar bien.
- Verter la mezcla en la bandeja de colada horizontal y dejar que el gel se polimerice durante 30 min. El gel tendrá aproximadamente 2 cm de espesor.
NOTA: Los geles pueden fundirse en una campana para acelerarPolimerización. Después de la polimerización, una fina capa de líquido permanecerá en la parte superior del gel. - Vierta el líquido y enjuague con buffer de funcionamiento. Retire el (los) peine (s) cuidadosamente y enjuague los pocillos con tampón de funcionamiento con una jeringa.
- Preparación del tampón de funcionamiento.
- Preparar 2 L de tampón de funcionamiento 1x TBE para la caja de gel. Diluir 400 ml de 5XTBE con 1600 ml y mezclar. Coloque el tampón TBE 1x en la habitación fría para enfriar.
- Pre-Ejecutar el gel
- Añadir 2 l de buffer de funcionamiento en frío a la caja de gel e insertar el gel.
- Pre-ejecutar el gel a 120 V durante 1 h a 4 ° C en una habitación fría. Durante este tiempo, preparar la reacción de unión.
2. Reacción de unión 8
- 2.1.Preparar los siguientes componentes de la reacción.
DTT 20 mM
BSA 10 mM
10 mM de ARNt de levadura
5X (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 25KCl 0 mM, Tween-20 al 0,2%),
100 nM de ARN marcado con fluoresceína comprado comercialmente
Concentrado de proteína Bicaudal-C
Glicerol al 50% en H _ { 2} O
H 2 O tratado con DEPC - Ensamble los componentes de la reacción de unión en un tubo de microcentrífuga libre de RNasa.
- Añadir al tubo 5 μl de BSA 10 mM, 5 μL de DTT 20 mM, 5 μL de tRNA de levadura 10 mM, 10 μl de Tampón de Unión 5x.
- Añadir proteína a una concentración final de 250 nM en 50 μ l. Añadir agua hasta un volumen final de 45 μl.
- Añadir 5 μl de sustrato de ARN marcado fluorescentemente. Utilizar un sustrato de 32 nucleótidos marcado con fluoresceína comercialmente comprado en 3 '.
- Mezclar e incubar en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente.
3. Análisis de muestras sobre el gel de poliacrilamida horizontal nativo
- A cada reacción, añadir 15 μL de glicerol al 50% y mezclar suavemente.
- CarefuAgregue 30 μL de cada reacción al gel. La cantidad de muestra que puede cargarse en un solo pocillo varía dependiendo del espesor del gel y del tamaño de los pocillos. Hemos cargado volúmenes tan poco como 15 μL y hasta 45 μL en un solo pozo de geles creados con un peine de 24 pocillos y vertidos hasta un espesor de 2 cm.
- Después de conectar la fuente de alimentación al aparato del gel encender la energía y ajustar la tensión. Ejecutar el gel a 4 ° C a 120 V.
NOTA: Para el aparato de gel horizontal, éste termina siendo de aproximadamente 5 V / cm. Para el aparato de gel vertical, éste es de 16 V / cm.- Para evitar dañar o blanquear el ARN marcado fluorescentemente, conduzca la electroforesis en la oscuridad.
- Varían los tiempos de electroforesis dependiendo de los específicos del complejo ARN-proteína que se está analizando.
NOTA: Una ventaja importante del análisis EMSA horizontal es que se puede detener la electroforesis, la imagen del gel y luego la geL se puede volver a colocar en el aparato y la electroforesis puede continuar durante más tiempo.
4. Imaging el gel
- Realice el análisis con cualquier instrumento diseñado para la detección e imagenología de sustratos fluorescentes.
- Coloque el gel en la cámara.
- Ajuste los ajustes del imager. Para los ligandos de ARN marcados con fluoresceína, utilice los siguientes ajustes: FAM (longitud de onda 473 nm), 750 Voltaje del fotomultiplicador (PMT), 100 μm de tamaño de píxel.
- Escanee el gel para capturar la imagen.
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Representative Results
Para demostrar la potencia y versatilidad de la electroforesis horizontal en gel natural se analizó la unión de la proteína Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) a un ARN marcado fluorescentemente que contenía un sitio de unión a Bicc1. Las proteínas Bicc1 funcionan como represores translacionales específicos de mRNA para controlar las decisiones de destino celular durante las etapas maternas de desarrollo animal 9 , 10 , 11 , 12 así como las funciones de órganos específicos en adultos 13 , 14 . Nuestro trabajo en Xenopus identificó el primer sitio de unión para una proteína Bicc1 8 : una región de 32 nucleótidos de la 3'UTR del mRNA Cripto-1 8 , 12 . Este sitio de unión se definió usando una combinación de técnicas: RNasa protectIon y footprinting ensayos, experimentos de unión in vivo y ensayos in vitro EMSA [ 8] .
La proteína de Xenopus Bicc1 purificada se mezcló con un ARN de 32 nucleótidos marcado fluorescentemente; El sitio de unión a Bicc1 del ARNm Cripto-1 8 . En una reacción separada, se mezcló la proteína Bicc1 con un ARN de 32 nucleótidos marcado fluorescentemente derivado del 3'UTR del ARNm de ciclina B1. Bicc1 no se une a la ciclina B1 mRNA 8 , 12 y este ARN sirve como un control negativo. La mitad de cada reacción se analizó en un gel de poliacrilamida nativa vertical ( Figura 1A ) mientras que la otra parte se analizó en paralelo usando gel nativo horizontal ( Figura 1B ). Es fácilmente evidente mediante cualquiera de los métodos que Bicc1 se une al ARN Cripto-1 ARN y forma un complejo específico aY no se une al ARN de control negativo de ciclina B1. Sin embargo, los complejos Bicc1-Cripto-1 son significativamente más distintos cuando se analizan con el gel horizontal, facilitando su detección y permitiendo la discriminación de los complejos proteína-ARN del ARN no unido. Después de la formación de imágenes, el gel se colocó de nuevo en el aparato de gel y se sometió a electroforesis durante otras tres horas y media. Después de volver a visualizar el gel de los complejos habían migrado aún más y eran todavía fácilmente detectables, lo que indica su estabilidad ( Figura 1C ]. Esta capacidad para continuar la electroforesis y el análisis después de la formación de imágenes inicial sería difícil, si no imposible, con el formato de gel vertical.
Figura 1: Una comparación de los geles nativos verticales y horizontales para analizar la unión de Bicc1 al ARN Cripto1. BiCc1 se realizaron experimentos con un 32-nucleótidos fluorescentes CyclinB1 ARN control negativo o un fluorescente de 32 nucleótidos Cripto1 RNA positivo control. Cada reacción contenía 0 nM o 250 nM de N-terminal SUMO-Bicc1 y se analizó en un gel nativo de poliacrilamida vertical ( A ) durante 30 min a 120 V a 4ºC o como muestras duplicadas en el gel nativo de poliacrilamida horizontal para ( B ) 2 h a 120 V a 4ºC o ( C ) 5,5 h a 120 V a 4ºC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los geles nativos de poliacrilamida son una herramienta invaluable para investigar las interacciones proteína-ARN y tradicionalmente estos geles son sometidos a electroforesis vertical 2 , 3 . Hemos utilizado una modificación del protocolo que sustituye los geles de poliacrilamida nativos creados y electrophoresed horizontalmente 1 , 4 , 6 , 7 , 15 . Estos cambios usados en combinación con sustratos de ARN marcados fluorescentemente proporcionan numerosas ventajas para el análisis bioquímico de las interacciones de unión proteína-ARN. Estas ventajas incluyen lo siguiente: se simplifica la mezcla de tampones en comparación con un aparato vertical que requiere una bomba para transferir el tampón de la cámara inferior a la parte superior, los geles horizontales pueden generarse con pocillos mayores que proporcionan una capacidad aumentada para analizarGer, la electroforesis en geles horizontales a menudo proporcionan una mejor resolución de los complejos ARN-proteína en comparación con los geles verticales, y la electroforesis en gel horizontal proporciona la capacidad de los experimentos de imagen en múltiples puntos de tiempo durante el análisis.
Otra gran ventaja es que el formato horizontal se presta a la creación de geles con un gran número de pozos que proporciona la capacidad de analizar múltiples muestras en paralelo 1 . Esta característica amplía significativamente su uso como una herramienta bioquímica para analizar las interacciones ARN-proteína. Por ejemplo, la capacidad de analizar múltiples muestras facilita la investigación de los parámetros cuantitativos de la formación de complejo proteína-ARN mediante el uso de experimentos de competición 15 , k off análisis [ 15] , así como los experimentos diseñados para definir la estequiometría de los componentes vinculante complejo [ 15] . Además, el uso de unFluorescente ARN sustratos hace posible realizar múltiples análisis, tales como la fluorescencia de polarización vinculante ensayos de una sola reacción y obtener tanto cuantitativa y cualitativa vinculante datos [ 5 , 15] .
Para obtener resultados óptimos de la configuración de gel horizontal, hay una variedad de parámetros que se pueden ajustar para mejorar la calidad de los complejos para la formación de imágenes. Estos incluyen cambiar el porcentaje de acrilamida del gel con el fin de hacer más fácil de manejar y mejorar la separación de los complejos proteína-ARN de ARN libre más. Sin embargo, puede ser difícil manejar porcentajes bajos de geles de acrilamida debido al tamaño. Nos parece más fácil usar geles que tengan una concentración de acrilamida de 7,5% o mayor. También, si es necesario, las condiciones de electroforesis pueden cambiarse para mejorar la estabilidad de los complejos proteína-ARN; Ajustando el voltaje de electroforesis, haciendo funcionar el gel a temperatura ambiente insteDe 4ºC y ajustando las condiciones previas a la ejecución.
A pesar de las muchas ventajas, existen también algunas limitaciones de los ensayos de electroforesis en gel natural nativa. Por ejemplo, su utilidad se maximiza utilizando substratos de ARN fluorescentes. Dependiendo del fluoróforo elegido y del tamaño del ARN, la obtención de tales sustratos puede ser costosa. Además, los geles horizontales son generalmente mucho más grandes que los geles verticales y por lo tanto requieren cantidades mayores de material tal como poliacrilamida y soluciones tratadas con DEPC.
La electroforesis en gel nativa horizontal tiene el potencial de ser utilizada como una herramienta de validación para pantallas moleculares que buscan identificar compuestos que se dirigen a las interacciones ARN-proteína clínicamente relevantes [ 16] . Tales pantallas usualmente usan ensayos bioquímicos en solución para identificar compuestos relevantes para estudio adicional. El mayor potencial de rendimiento del formato horizontal en comparación con el formato verticalDes una oportunidad de aplicar electroforesis en gel nativo como una herramienta para la validación secundaria de candidatos potenciales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a Laura Vanderploeg por la preparación de las cifras. El trabajo en el laboratorio de hojas de cálculo es apoyado por la subvención NSF 1050395 y subvención NIH (R21HD076828). El trabajo en el laboratorio de Ryder es apoyado por las concesiones de NIH R01GM117237 y R01GM117008. Megan Dowdle es apoyada por una Beca de Oportunidades Avanzadas de SciMed GRS a través de la Escuela de Graduados de la Universidad de Wisconsin-Madison y el Programa de Capacitación en Biotecnología a través del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (T32GM008349).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
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