Summary
Native polyakrylamidgelelektroforese er et grunnleggende verktøy for å analysere RNA-protein-interaksjoner. Tradisjonelt har de fleste eksperimenter brukt vertikale geler. Imidlertid gir horisontale geler flere fordeler, for eksempel muligheten til å overvåke komplekser under elektroforese. Vi gir en detaljert protokoll for generering og bruk av horisontal innfødt gelelektroforese.
Abstract
Native polyakrylamidgelelektroforese er et grunnleggende verktøy for molekylærbiologi som har blitt brukt i stor utstrekning for den biokjemiske analysen av RNA-protein-interaksjoner. Disse interaksjonene er tradisjonelt analysert med polyakrylamidgeler fremstilt mellom to glassplater og prøver elektroforesert vertikalt. Imidlertid støper polyakrylamidgeler i skuffer og elektroforeses horisontalt, og gir flere fordeler. For eksempel kan horisontale geler som brukes til å analysere komplekser mellom fluorescerende RNA-substrat og spesifikke proteiner, avbildes flere ganger ettersom elektroforese utvikler seg. Dette gir den unike muligheten til å overvåke RNA-proteinkomplekser på flere punkter under forsøket. I tillegg gjør horisontell gelelektroforese det mulig å analysere mange prøver parallelt. Dette kan i stor grad legge til rette for tidskursforsøk, samt analysere flere reaksjoner samtidig for å sammenligne ulike komponenter og forhold. Her prOvide en detaljert protokoll for generering og bruk av horisontal innfødt gelelektroforese for analyse av RNA-Protein-interaksjoner.
Introduction
Elektroforetiske mobilitetsforskyvningsanalyser (EMSAer) har vist seg å være et uvurderlig biokjemisk verktøy for å analysere spesifikke protein-nukleinsyre-interaksjoner 1 , 2 , 3 . Disse analysene kan gi viktig informasjon om bindingsaffiniteten til proteiner til RNA eller DNA 3 , komponentstøkiometrien av nukleinsyre-protein-kompleksene 1 og gi viktige nye innsikter om bindingsspecifikiteten til RNA-bindingsproteiner via substratkonkurranseeksperimenter 1 .
Det tradisjonelle eksperimentelle oppsettet for disse analysene består i å blande renset protein med et radioaktivt merket RNA-substrat. De resulterende kompleksene analyseres deretter med ikke-denaturerende (native) polyakrylamidgeler hellet mellom to glassplater etterfulgt av prøveelektroforese i et vertikalt apparat 3. Selv om denne tilnærmingen har blitt brukt uttømmende for å gi viktig innsikt i de biokjemiske mekanismene som ligger til grunn for bindingen av proteiner til nukleinsyrer, har den også flere begrensninger. For eksempel har denne grunnleggende strategien relativt lav gjennomstrømning, og det er ikke lett å tilpasse til applikasjoner som krever analyse av mange bindende reaksjoner parallelt. I tillegg er det med det tradisjonelle vertikale apparatet utfordrende å potensielt overvåke komplekser ved flere ganger under elektroforese 3 , 4 .
Her presenterer vi en tilpasning av EMSA-analysen som bruker native polyakrylamidgeler som støpes i et flatbed-apparat, horisontal elektroforese og fluorescensmerkede RNA-substrat 4 , 5 , 6 , 7 . Inkorporering av disse relativt enkle modifikasjonene til den grunnleggende straTegy gir noen sterke fordeler. Spesielt gir det horisontale flatbedformatet seg lett å analysere dusinvis av prøver samtidig 4 . For noen RNA-proteinkomplekser, som de som dannes mellom Bicaudal-C-proteinet og dets RNA-substratelektroforese i en horisontal gel, gir også en økt evne til å løse forskjellige RNA-proteinkomplekser og diskriminere disse fra ubundet RNA-substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av horisontal naturlig polyakrylamidgel 4 .
- Forberedelse av materialene som trengs.
- For det horisontale gelapparatet, bruk en gelkasse (37 cm x 24 cm) med en 27 cm x 21 cm skuff og en kapasitet til to 24-brønn kamme. Dette oppsettet gir totalt 48 prøver som kan analyseres samtidig.
- Forbered følgende reagenser: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borat-EDTA pH 8,0), TEMED og 10% APS (ammoniumpersulfat).
- Generering av en 10% naturlig akrylamidgel.
- I en 500 ml kolbe tilsettes 80 ml 5x TBE, 100 ml 40% akrylamid og vann til et sluttvolum på 400 ml.
- Tilsett 4 ml 10% APS og 400 μL TEMED. Bland godt.
- Hell blandingen i den horisontale støpebrettet og la gelen polymerisere i 30 minutter. Gelen vil være ca 2 cm tykk.
MERK: Geler kan kaste i en hette for å øke hastighetenUp polymerisering. Etter polymerisering vil et tynt lag av væske forbli på toppen av gelen. - Hell væsken av og skyll med løpebuffer. Fjern kammen / -ene forsiktig og skyll brønnene med løpende buffer ved hjelp av en sprøyte.
- Fremstilling av løpebuffer.
- Forbered 2 liter 1x TBE-løpebuffer for gelboksen. Fortyn 400 ml 5XTBE med 1600 ml og bland. Legg 1x TBE buffer i kaldt rom for å kjøle seg ned.
- Pre-Running gelen
- Tilsett 2 liter kald løpebuffer til gelboksen og sett i gelen.
- Pre-run gelen ved 120 V i 1 time ved 4 ° C i et kaldt rom. I løpet av denne tiden skal du forberede bindingsreaksjonen.
2. Bindende reaksjon 8
- 2.1. Lag de følgende reaksjonskomponentene.
20 mM DTT
10 mM BSA
10 mM gjær tRNAer
5X bindingsbuffer (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0,2% Tween-20)
100 nM fluorescein-merket RNA kjøpt kommersielt
Konsentrert Bicaudal-C protein
50% glycerol i DEPC-behandlet H 2 O
DEPC-behandlet H 2 O - Monter bindingsreaksjonskomponentene i et RNase-fri mikrocentrifugerør.
- Til røret tilsettes 5 μl 10 mM BSA, 5 μl 20 mM DTT, 5 μl 10 mM gjær-tRNA, 10 μl 5x bindingsbuffer.
- Tilsett protein til en sluttkonsentrasjon på 250 nM i 50 μl. Tilsett vann til et sluttvolum på 45 μl.
- Tilsett 5 μL fluorescensmerket RNA-substrat. Bruk et kommersielt kjøpt 3 'fluorescein-merket 32-nukleotidsubstrat.
- Bland og inkuber i mørket i 30 minutter ved romtemperatur.
3. Analyse av prøver på den indfødte horisontale polyakrylamidgelen
- Til hver reaksjon tilsettes 15 μl 50% glycerol og blandes forsiktig.
- carefuTilsett 30 μl av hver reaksjon på gelen. Mengden prøve som kan lastes inn i en enkelt brønn varierer avhengig av tykkelsen på gelen og størrelsen på brønnene. Vi har lastet volumer så lite som 15 μL og så mye som 45 μL i en enkelt brønn av geler opprettet med en 24 brønn kam og helles til en tykkelse på 2 cm.
- Etter tilkobling av strømforsyningen til gelapparatbryteren på strømmen og juster spenningen. Kjør gelen i 4 ° C ved 120 V.
MERK: For det horisontale gelapparatet blir dette ca. 5 V / cm. For det vertikale gelapparatet er dette 16 V / cm.- For å forhindre skade eller bleking av det fluorescensmerkede RNA, utfør elektroforese i mørket.
- Varierende elektroforese ganger avhengig av spesifikkene til RNA-proteinkomplekset som analyseres.
MERK: En stor fordel ved den horisontale EMSA-analysen er at elektroforese kan stoppes, gelbildet og deretter geJeg kan plasseres tilbake i apparatet, og elektroforese kan fortsette i lengre tid.
4. Imaging gelen
- Utfør analyse med ethvert instrument designet for deteksjon og bildebehandling av fluorescerende underlag.
- Legg gelen på bildebehandleren.
- Juster bildeinnstillingene. For fluorescein-merkede RNA ligander, bruk følgende innstillinger: FAM (bølgelengde 473 nm), 750 Fotomultiplikator spenning (PMT), 100 μm pixel størrelse.
- Skann gelen for å fange bildet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere kraften og allsidigheten til den horisontale innfødte gelelektroforese analyserte vi bindingen av Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) -proteinet til et fluorescensmerket RNA inneholdende et Bicc1-bindingssted. Bicc1-proteiner fungerer som mRNA-spesifikke translatoriske repressorer for å kontrollere beslutninger om celleflyt i mødrestadiene av dyreutvikling 9 , 10 , 11 , 12 samt funksjonene til bestemte organer hos voksne 13 , 14 . Vårt arbeid i Xenopus identifiserte det første bindingsstedet for et Bicc1 protein 8 : et 32-nukleotid-område fra 3'UTR av Cripto-1 mRNA 8 , 12 . Dette bindingssted ble definert ved bruk av en kombinasjon av teknikker: RNase-beskyttelseIon- og fotavtrykkstesting, in vivo bindingsforsøk og in vitro EMSA analyser 8 .
Renset Xenopus Bicc1 protein ble blandet med et fluorescensmerket 32 nukleotid RNA; Bicc1 bindingsstedet fra Cripto-1 mRNA 8 . I en separat reaksjon ble Bicc1-protein blandet med et fluorescensmerket 32 nukleotid-RNA avledet fra 3'UTR av cyklin B1-mRNA. Bicc1 binder ikke til cyklin B1 mRNA 8 , 12, og dette RNA tjener som en negativ kontroll. Halvparten av hver reaksjon ble analysert på en vertikal innfødt polyakrylamidgel ( figur 1A ) mens den andre delen ble analysert parallelt ved bruk av horisontal nativ gel ( figur 1B ). Det er lett tydelig å bruke enten en metode som Bicc1 binder til RNA Cripto-1 RNA og danner et spesifikt kompleks aNd det binder ikke cyclin B1 negativ kontroll RNA. Imidlertid er Bicc1-Cripto-1-kompleksene signifikant tydeligere når de analyseres med den horisontale gel, som både letter deres deteksjon og tillater diskriminering av protein-RNA-komplekser fra ubundet RNA. Etter avbildning ble gelen plassert tilbake i gelapparatet og elektroforesert i ytterligere tre og en halv time. Etter reimaging av gelen hadde kompleksene migrert videre og var fortsatt lett detekterbare, hvilket indikerer stabiliteten deres ( figur 1C ). Denne evnen til å fortsette elektroforese og analyse etter første bildebehandling ville være utfordrende, om ikke umulig, med det vertikale gelformatet.
Figur 1: En sammenligning av vertikale og horisontale innfødte geler for analyse av bindingen av Bicc1 til Cripto1 RNA. BiCc1 bindingseksperimenter ble utført med en 32-nukleotid fluorescerende CyclinB1 RNA negativ kontroll eller en fluorescerende 32-nukleotid Cripto1 RNA positiv kontroll. Hver reaksjon inneholdt enten 0 nM eller 250 nM SUMO-Bicc1 N-terminale og analysert på enten en ( A ) vertikal polyakrylamid-nativ gel-runde i 30 minutter ved 120 V ved 4 ° C eller som dupliserte prøver i den horisontale polyakrylamid-nativ gel for ( B ) 2 timer ved 120 V ved 4 ° C eller ( C ) 5,5 timer ved 120 V ved 4 ° C. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Native polyakrylamidgeler er et uvurderlig verktøy for å undersøke protein-RNA-interaksjoner, og tradisjonelt blir disse gelene elektroforesert vertikalt 2 , 3 . Vi har brukt en modifisering av protokollen som erstatter native polyakrylamidgeler opprettet og elektroforesert horisontalt 1 , 4 , 6 , 7 , 15 . Disse endringene som brukes i kombinasjon med fluorescensmerkede RNA-substratene, gir mange fordeler for den biokjemiske analysen av protein-RNA-bindingsinteraksjoner. Disse fordelene inkluderer følgende: blanding av buffere er forenklet sammenlignet med et vertikalt apparat som krever en pumpe for å overføre buffer fra det nedre kammer til det øvre, horisontale geler kan genereres med større brønner som gir en økt kapasitet for analyse av larGerprøver, elektroforese på horisontale geler gir ofte forbedret oppløsning av RNA-proteinkomplekser sammenlignet med vertikale geler, og horisontal gelelektroforese gir muligheten til bildeeksperimenter ved flere tidspunkter under analyse.
En annen stor fordel er at det horisontale formatet gir seg til å lage geler med et stort antall brønner som gir muligheten til å analysere flere prøver i parallell 1 . Denne funksjonen utvider sin bruk som et biokjemisk verktøy for å analysere RNA-protein-interaksjoner. Evnen til å analysere flere prøver letter for eksempel undersøkelse av de kvantitative parametrene for protein-RNA-kompleksdannelse ved bruk av konkurranseeksperimenter 15 , k off- analyse 15 samt eksperimenter utformet for å definere støkiometrien av bindekomplekskomponentene 15 . I tillegg er bruken av aFluorescerende RNA-substrat gjør det mulig å utføre flere analyser, slik som fluorescenspolarisasjonsbindingsanalyser fra en enkelt reaksjon og oppnå både kvantitative og kvalitative bindingsdata 5 , 15 .
For å oppnå optimale resultater fra det horisontale geloppsettet, finnes det en rekke parametere som kan justeres for å forbedre kvaliteten på kompleksene for avbildning. Disse inkluderer endring av akrylamidprosent av gelen for å gjøre det lettere å håndtere og forbedre separasjonen av protein-RNA-komplekser fra fri RNA mer. Det kan imidlertid være vanskelig å håndtere lave prosentvise akrylamidgeler på grunn av størrelsen. Vi finner det enklest å bruke geler som har en akrylamidkonsentrasjon på 7,5% eller mer. Om nødvendig kan elektroforesebetingelsene endres for å forbedre stabiliteten av protein-RNA-komplekser; Justere elektroforese spenningen, kjører gelen ved romtemperatur insteAnnonse ved 4 ° C og justering av forhåndsforholdene.
Til tross for de mange fordelene er det også noen begrensninger av horisontale innfødte gelelektroforese-analyser. For eksempel maksimeres dets bruk ved å bruke fluorescerende RNA-substrat. Avhengig av hvilken fluorofore som er valgt og størrelsen på RNA, kan oppnåelse av slike substrater være dyrt. I tillegg er horisontale geler generelt mye større enn vertikale geler og krever derfor større mengder materiale som polyakrylamid og DEPC-behandlede løsninger.
Horisontal innfødt gelelektroforese har potensialet til å bli brukt som et valideringsverktøy for molekylære skjermer som søker å identifisere forbindelser som målretter klinisk relevante RNA-protein-interaksjoner 16 . Slike skjermbilder bruker typisk biokjemiske analyser for å identifisere relevante forbindelser for videre studier. Det høyere gjennomstrømningspotensialet i det horisontale formatet sammenlignet med det vertikale formatetDes en mulighet til å anvende innfødt gelelektroforese som et verktøy for sekundær validering av potensielle kandidater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Laura Vanderploeg for å lage tall. Arbeide i Sheets-laboratoriet støttes av NSF-stipend 1050395 og NIH-stipend (R21HD076828). Arbeid i Ryder-laboratoriet støttes av NIH-tilskuddene R01GM117237 og R01GM117008. Megan Dowdle støttes av et SciMed GRS Advanced Opportunity fellesskap gjennom University of Wisconsin-Madison Graduate School og Bioteknologi Training Program gjennom National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health (T32GM008349).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
- Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
- Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
- Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
- Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
- Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).
- Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
- Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
- Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
- Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
- Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
- Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).
