Summary
الأصلي بول أكريلاميد هلام الكهربائي هو أداة أساسية لتحليل التفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين. تقليديا استخدمت معظم التجارب المواد الهلامية العمودية. ومع ذلك، توفر المواد الهلامية الأفقية العديد من المزايا، مثل فرصة لمراقبة المجمعات أثناء الكهربائي. نحن نقدم بروتوكول مفصل لتوليد واستخدام الأفقي هلام الأصلي الكهربائي.
Abstract
بول أكريلاميد الأصلي الكهربائي هلام هو أداة أساسية من البيولوجيا الجزيئية التي استخدمت على نطاق واسع للتحليل البيوكيميائية للتفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين. وقد تم تحليل هذه التفاعلات تقليديا مع المواد الهلامية بولي أكريلاميد ولدت بين اثنين من لوحات الزجاج والعينات إليكتروفوريسد عموديا. ومع ذلك، المواد الهلامية بولكرلميد يلقي في الصواني و إليكتروفوريسد أفقيا يقدم العديد من المزايا. على سبيل المثال، المواد الهلامية الأفقية المستخدمة لتحليل المجمعات بين ركائز الفلورسنت رنا والبروتينات محددة يمكن تصوير عدة مرات كما تقدم الكهربائي. وهذا يوفر فرصة فريدة لرصد المجمعات رنا البروتين في عدة نقاط خلال التجربة. وبالإضافة إلى ذلك، الأفقي هلام الكهربائي يجعل من الممكن لتحليل العديد من العينات بالتوازي. وهذا يمكن أن يسهل كثيرا من التجارب بالطبع الوقت وكذلك تحليل ردود الفعل متعددة في وقت واحد لمقارنة المكونات والظروف المختلفة. هنا نحن بيأرأوفيد بروتوكول مفصلة لتوليد واستخدام الأفقي الكهربائي هلام الأصلي لتحليل التفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين.
Introduction
وقد أثبتت مقايسات التحول التنقل الكهربي (إمساس) أن تكون أداة بيوكيميائية لا تقدر بثمن لتحليل تفاعلات حمض البروتين النووي محددة 1 ، 2 ، 3 . هذه المقايسات يمكن أن توفر معلومات هامة بشأن تقارب ملزمة من البروتينات إلى الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي 3 ، مكون الكيمياء المتفاعلة من المجمعات الحمض النووي البروتين 1 وتوفير رؤى جديدة هامة حول خصوصية ملزمة للبروتينات ملزمة رنا عبر التجارب المنافسة الركيزة 1 .
الإعداد التجريبي التقليدي لهذه المقايسات يتكون من خلط البروتين النقي مع راديولبلد رنا ركيزة. ثم يتم تحليل المجمعات الناتجة مع المواد الهلامية بوليكرلميد غير تغيير طبيعة (الأم) سكب بين اثنين من لوحات الزجاج تليها عينة الكهربائي في جهاز عمودي 3. في حين تم استخدام هذا النهج على نحو شامل لتوفير رؤى هامة في الآليات الكيميائية الحيوية التي تكمن وراء ارتباط البروتينات إلى الأحماض النووية، كما أن لديها العديد من القيود. على سبيل المثال، هذه الاستراتيجية الأساسية لديها منخفضة نسبيا الإنتاجية وأنها ليست قابلة للتكيف بسهولة للتطبيقات التي تتطلب تحليل العديد من ردود الفعل ملزمة في موازاة ذلك. وبالإضافة إلى ذلك، مع الجهاز الرأسي التقليدي فإنه من الصعب أن يحتمل رصد المجمعات في عدة مرات خلال الكهربائي 3 ، 4 .
هنا نقدم التكيف من الفحص إمزا الذي يستخدم المواد الهلامية بولي أكريلاميد الأم يلقي في جهاز مسطحة، الكهربائي الأفقي و فلورزنتلي المسمى ركائز رنا 4 ، 5 ، 6 ، 7 . دمج هذه التعديلات بسيطة نسبيا على سترا الأساسيةتيغي يوفر بعض المزايا القوية. على وجه الخصوص، فإن الشكل المسطح الأفقي بسهولة يفسح المجال لتحليل عشرات العينات في وقت واحد 4 . أيضا، بالنسبة لبعض المجمعات البروتين الحمض النووي الريبي، مثل تلك التي شكلت بين البروتين بيكودال-C والرنا الركيزة الكهربائي في هلام أفقي يوفر زيادة القدرة على حل المجمعات رنا البروتين متميزة وتمييز هذه من الركيزة رنا غير منضم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد أفقي بولي أكريلاميد جل الأصلي 4 .
- إعداد المواد اللازمة.
- للحصول على جهاز هلام أفقي، استخدم مربع هلام (37 سم × 24 سم) مع 27 سم × 21 سم صينية والقدرة على اثنين من أمشاط 24 جيدا. يوفر هذا الإعداد ما مجموعه 48 العينات التي يمكن تحليلها في وقت واحد.
- إعداد الكواشف التالية: 40٪ الأكريلاميد-مكرر 19: 1، 5X تب (تريس-بورات-إدتا درجة الحموضة 8.0)، تيمد، و 10٪ أبس (بيرسلفات الأمونيوم).
- جيل من 10٪ هلام الأكريلاميد الأصلي.
- في قارورة 500 مل، إضافة 80 مل من تب 5X، 100 مل من 40٪ الأكريلاميد، والماء إلى الحجم النهائي من 400 مل.
- إضافة 4 مل من 10٪ أبس و 400 ميكرولتر من تيمد. اخلط جيدا.
- صب المزيج في علبة صب الأفقية والسماح للهلام بلمرة لمدة 30 دقيقة. سوف يكون هلام حوالي 2 سم سميكة.
ملاحظة: هلام يمكن أن يلقي في غطاء الدخان إلى سرعةحتى البلمرة. بعد البلمرة، سوف تبقى طبقة رقيقة من السائل على رأس هلام. - صب السائل قبالة وشطف مع العازلة تشغيل. إزالة المشط (ق) بعناية وشطف الآبار مع العازلة تشغيل باستخدام حقنة.
- إعداد العازلة تشغيل.
- إعداد 2 لتر من 1X تب تشغيل عازلة لصندوق هلام. تمييع 400 مل من 5XTBE مع 1600 مل وخلط. مكان 1X تب العازلة في الغرفة الباردة لتبرد.
- قبل تشغيل هلام
- إضافة 2 لتر من العازلة تشغيل الباردة إلى مربع هلام وإدراج هلام.
- قبل تشغيل هلام في 120 V لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية في غرفة باردة. خلال هذا الوقت، وإعداد رد فعل ملزم.
2. ملزم رد فعل 8
- 2.1.إعداد مكونات التفاعل التالية.
20 ملي دت
10 ملي بسا
10 ملي الحمض النووي الخميرة
5X العازلة ملزمة (50 ملي هيبيس درجة الحموضة 8.0، 5 ملي إدتا، 250 ملي بوكل، 0.2٪ توين -20)
100 نانومتر فلوريسئين المسمى الحمض النووي الريبي شراؤها تجاريا
تتركز بيكودال-C البروتين
50٪ الجلسرين في ديبك المعالجة H 2 O
ديبك المعالجة H 2 O - تجميع مكونات التفاعل ملزمة في أنبوب ميكروسنتريفوج الحرة ريبونوكلياز.
- إلى أنبوب، إضافة 5 ميكرولتر من 10 ملي بسا، 5 ميكرولتر من 20 ملي دت، 5 ميكرولتر من 10 ملي ترناس الخميرة، 10 ميكرولتر من 5X ملزمة ملزمة.
- إضافة البروتين إلى تركيز النهائي من 250 نانومتر في 50 ميكرولتر. إضافة الماء إلى حجم النهائي من 45 ميكرولتر.
- إضافة 5 ميكرولتر من فلورزنتلي المسمى رنا الركيزة. استخدام شراؤها تجاريا 3 'فلوريسئين المسمى 32 الركيزة النوكليوتيدات.
- مزيج واحتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. تحليل العينات على هلام بولي أكريلاميد الأفقي الأصلي
- لكل رد فعل، إضافة 15 ميكرولتر من الجلسرين 50٪ وتخلط بلطف.
- يتنبهلي إضافة 30 ميكرولتر من كل رد فعل على هلام. كمية العينة التي يمكن تحميلها في بئر واحد يختلف اعتمادا على سمك هلام وحجم الآبار. لدينا تحميل كميات أقل من 15 ميكرولتر وبقدر 45 ميكرولتر في بئر واحدة من المواد الهلامية التي تم إنشاؤها مع مشط 24 جيدا وسكب لسمك 2 سم.
- بعد توصيل إمدادات الطاقة إلى جهاز هلام التبديل على السلطة وضبط الجهد. تشغيل هلام في 4 درجات مئوية في 120 V.
ملاحظة: لجهاز هلام الأفقي، وهذا ينتهي ما يقرب من 5 V / سم. لجهاز هلام العمودي، وهذا هو 16 V / سم.- لمنع إتلاف أو تبييض رنا فلورزنتلي المسمى، إجراء الكهربائي في الظلام.
- تختلف أوقات الكهربائي اعتمادا على تفاصيل مجمع البروتين الحمض النووي الريبي يجري تحليلها.
ملاحظة: وهناك ميزة رئيسية لتحليل إمزا الأفقي هو أن الكهربائي يمكن أن تتوقف، وتصوير هلام ومن ثم غيل يمكن وضعها مرة أخرى في الجهاز والالكهربائي يمكن أن تستمر لأوقات أطول.
4. تصوير جل
- إجراء التحليل مع أي أداة مصممة للكشف والتصوير ركائز الفلورسنت.
- وضع هلام على تصوير.
- ضبط إعدادات التصوير. لروابط فلوريسئين المسمى الحمض النووي الريبي، استخدم الإعدادات التالية: فام (الطول الموجي 473 نانومتر)، 750 المضاعف الجهد (بمت)، 100 ميكرون بكسل الحجم.
- مسح هلام لالتقاط الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإثبات قوة وبراعة الأفقي هلام الأصلي الكهربائي قمنا بتحليل ملزمة من القيطم بيكودال-C (Bicc1) البروتين إلى رنا فلورزنتلي المسمى يحتوي على موقع ملزمة Bicc1. البروتينات Bicc1 وظيفة كما مرنا القمعية متعدية محددة للسيطرة على قرارات مصير الخلية خلال مراحل الأمهات من التنمية الحيوانية 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، فضلا عن وظائف أجهزة معينة في البالغين 13 ، 14 . حددت عملنا في القيطم أول موقع ملزم للبروتين Bicc1 8: منطقة 32 النوكليوتيدات من 3'UTR من Cripto-1 مرنا 8 و 12. تم تعريف موقع الربط هذا باستخدام مجموعة من التقنيات: حماية ريبونوكليازأيون والفحوصات البصمة، في التجارب ملزمة الجسم الحي وفي المختبر إمزا المقايسات 8 .
كانت مختلطة تنقية البروتين القيطم Bicc1 مع fluorescently المسمى RNA 32 النوكليوتيدات. موقع ملزمة Bicc1 من كريبتو -1 مرنا 8 . في رد فعل منفصل تم خلط البروتين Bicc1 مع فلورزنتلي المسمى 32 رنا النوكليوتيدات المستمدة من 3'UTR من مرنا سيكلين B1. Bicc1 لا يرتبط سيكلين B1 مرنا 8 ، 12 وهذا رنا بمثابة السيطرة السلبية. تم تحليل نصف كل رد فعل على هلام بولي أكريلاميد الأصلي العمودي ( الشكل 1A ) في حين تم تحليل الجزء الآخر بالتوازي باستخدام هلام الأم الأفقي ( الشكل 1B ). ومن الواضح بسهولة باستخدام أي طريقة أن Bicc1 يربط الحمض النووي الريبي كريبتو -1 الحمض النووي الريبي ويشكل مجمع معين وند أنه لا ربط سيكلين B1 السيطرة السلبية رنا. ومع ذلك، فإن المجمعات Bicc1-كريبتو -1 هي أكثر وضوحا بكثير عند تحليلها مع هلام أفقي، على حد سواء تسهيل الكشف والسماح للتمييز من المجمعات البروتين الحمض النووي الريبي من الحمض النووي الريبي غير منضم. بعد التصوير، وضعت الهلام مرة أخرى في جهاز هلام و إليكتروفوريسد لمدة ثلاث ساعات ونصف إضافية. بعد إعادة التصوير هلام قد هاجرت المجمعات أبعد من ذلك وكانت لا تزال قابلة للاكتشاف بسهولة، مما يدل على استقرارها ( الشكل 1C ). هذه القدرة على مواصلة الكهربائي والتحليل بعد التصوير الأولي سيكون تحديا، إن لم يكن مستحيلا، مع شكل هلام عمودي.
الشكل 1: مقارنة بين المواد الهلامية الرأسية والأفقية المحلية لتحليل ملزمة Bicc1 ل Wrpto1 الحمض النووي الريبي. بيوأجريت تجارب ملزمة CC1 مع النيكلأوتيد 32 نيكلأوتيد CyclinB1 رنا السيطرة السلبية أو الفلورسنت 32 النوكليوتيدات Crpto1 الحمض النووي الريبي السيطرة الإيجابية. كل رد فعل الواردة إما 0 نانو مولار أو 250 نانومتر من سومو-Bicc1 N- محطة وتحليلها على أي ( أ ) بولي أكريلاميد عمودي هلام الأم تشغيل لمدة 30 دقيقة في 120 V في 4 درجات مئوية أو عينات مكررة في هلام بولي أكريلاميد الأفقي الأصلي ل ( B ) 2 ساعة عند 120 فولت عند 4 درجات مئوية أو ( C ) 5.5 ساعة عند 120 فولت عند 4 درجات مئوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المواد الهلامية بولكرلميد الأصلية هي أداة لا تقدر بثمن للتحقيق التفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي وتقليديا هذه المواد الهلامية هي إليكتروفوريسد عموديا 2 ، 3 . لقد استخدمنا تعديل البروتوكول الذي يحل المواد الهلامية بولكرلميد الأم إنشاؤها و إليكتروفوريسد أفقيا 1 ، 4 ، 6 ، 7 ، 15 . هذه التغييرات المستخدمة في تركيبة مع ركائز رنا فلورزنتلي المسمى توفر مزايا عديدة للتحليل البيوكيميائية للتفاعلات البروتين الحمض النووي الريبي ملزمة. وتشمل هذه المزايا ما يلي: يتم تبسيط خلط المخازن المؤقتة بالمقارنة مع الجهاز الرأسي الذي يتطلب مضخة لنقل المخزن المؤقت من الغرفة السفلى إلى المواد الهلامية العليا الأفقية يمكن أن تتولد مع الآبار الكبيرة التي توفر زيادة القدرة على تحليل لارعينات جر، الكهربائي على الهلام الأفقي غالبا ما توفر تحسين القرار من المجمعات الحمض النووي الريبي البروتين بالمقارنة مع المواد الهلامية العمودي، والهلام الكهربائي الأفقي يوفر القدرة على تجارب الصور في نقاط زمنية متعددة أثناء التحليل.
ميزة رئيسية أخرى هي أن الشكل الأفقي يفسح المجال لخلق المواد الهلامية مع عدد كبير من الآبار التي توفر القدرة على تحليل عينات متعددة في موازاة 1 . هذه الميزة توسع بشكل كبير استخدامها كأداة البيوكيميائية لتحليل التفاعلات الحمض النووي الريبي البروتين. على سبيل المثال، القدرة على تحليل عينات متعددة يسهل التحقيق في المعلمات الكمية من البروتين-رنا تشكيل مركب من خلال استخدام تجارب المنافسة 15 ، ك من تحليل 15 وكذلك التجارب المصممة لتحديد الكيمياء المتفاعلة من مكونات معقدة ملزمة 15 . وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام أركائز الفلورسنت الحمض النووي الريبي يجعل من الممكن لأداء تحليلات متعددة، مثل فحوصات مضان الاستقطاب ملزمة من رد فعل واحد والحصول على كل من البيانات الكمية والنوعية ملزمة 5 ، 15 .
للحصول على أفضل النتائج من الإعداد هلام الأفقي، وهناك مجموعة متنوعة من المعلمات التي يمكن تعديلها لتحسين نوعية المجمعات للتصوير. وتشمل هذه تغيير نسبة الأكريلاميد من هلام من أجل جعله أسهل للتعامل وتعزيز الفصل بين المجمعات البروتين رنا من الحمض النووي الريبي مجانا أكثر. ومع ذلك، يمكن أن يكون من الصعب التعامل مع نسبة منخفضة من المواد الهلامية الأكريلاميد بسبب حجم. نجد أنه من الأسهل استخدام المواد الهلامية التي لديها تركيز الأكريلاميد من 7.5٪ أو أكثر. أيضا، إذا لزم الأمر يمكن تغيير الظروف الكهربائي لتحسين الاستقرار من المجمعات البروتين الحمض النووي الريبي. ضبط الجهد الكهربائي، تشغيل هلام في درجة حرارة الغرفة إنستإعلان في 4 درجات مئوية وضبط ظروف ما قبل التشغيل.
على الرغم من العديد من المزايا هناك أيضا بعض القيود من المقايسات الكهربائي هلام الأصلي الأفقي. على سبيل المثال، يتم تعظيم فائدته باستخدام ركائز الفلورسنت الحمض النووي الريبي. اعتمادا على فلورفور اختيار وحجم الحمض النووي الريبي، والحصول على مثل هذه ركائز يمكن أن تكون مكلفة. بالإضافة إلى ذلك، المواد الهلامية الأفقية عموما أكبر بكثير من المواد الهلامية العمودية، وبالتالي تتطلب كميات أكبر من المواد مثل بولي أكريلاميد والحلول المعالجة ديبك.
الأفقي هلام الكهربائي الأصلي لديه القدرة على أن تستخدم كأداة التحقق من صحة للشاشات الجزيئية التي تسعى إلى تحديد المركبات التي تستهدف سريريا ذات الصلة رنا البروتين التفاعلات 16 . وتستخدم هذه الشاشات عادة فحوصات كيميائية بيولوجية لتحديد المركبات ذات الصلة لمزيد من الدراسة. قدرة إنتاجية أعلى من الشكل الأفقي مقارنة مع شكل عمودي بروفيديس فرصة لتطبيق الهلام الكهربائي الأصلي كأداة للتحقق الثانوي من المرشحين المحتملين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر لورا فاندربلوغ لإعداد الأرقام. ويدعم العمل في المختبر صفائح من قبل جبهة الخلاص الوطني منحة 1050395 ومنح المعاهد الوطنية للصحة (R21HD076828). ويدعم العمل في مختبر رايدر من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01GM117237 و R01GM117008. ويدعم ميغان دودل من قبل زميد غرس فرصة متقدمة زمالة من خلال جامعة ويسكونسن ماديسون كلية الدراسات العليا وبرنامج التدريب على التكنولوجيا الحيوية من خلال المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة (T32GM008349).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
- Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
- Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
- Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
- Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
- Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).
- Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
- Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
- Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
- Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
- Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
- Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).
