Summary
L'elettroforesi natale di poliacrilammide è uno strumento fondamentale per analizzare le interazioni tra proteine RNA. Tradizionalmente la maggior parte degli esperimenti hanno utilizzato gel verticale. Tuttavia, i gel orizzontali offrono diversi vantaggi, come l'opportunità di monitorare i complessi durante l'elettroforesi. Forniamo un protocollo dettagliato per la generazione e l'uso di elettroforesi geotermica orizzontale.
Abstract
L'elettroforesi natale di poliacrilammide è uno strumento fondamentale della biologia molecolare che è stato usato ampiamente per l'analisi biochimica delle interazioni di proteine RNA. Queste interazioni sono state tradizionalmente analizzate con gel di poliacrilammide generati tra due lastre di vetro e campioni elettroforati verticalmente. Tuttavia, i gel di poliacrilamide gettati in vassoi e elettroforesi orizzontalmente offre diversi vantaggi. Ad esempio, i gel orizzontali utilizzati per analizzare complessi tra substrati di RNA fluorescenti e proteine specifiche possono essere riprese più volte come l'avanzamento dell'elettroforesi. Questo fornisce l'opportunità unica di monitorare complessi proteina RNA in diversi punti durante l'esperimento. Inoltre, l'elettroforesi orizzontale a gel permette di analizzare molti campioni in parallelo. Ciò può notevolmente facilitare esperimenti di tempo e analizzare più reazioni simultaneamente per confrontare componenti e condizioni differenti. Qui abbiamo prOvide un protocollo dettagliato per la generazione e l'utilizzo di elettroforesi geotermica orizzontale per l'analisi delle interazioni RNA-Protein.
Introduction
I test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSAs) hanno dimostrato di essere uno strumento prezioso biochimico per analizzare le interazioni specifiche dell'acido nucleico-proteico 1 , 2 , 3 . Questi test possono fornire informazioni importanti riguardo all'affinità di legame delle proteine all'RNA o al DNA 3 , la stechiometria del complesso 1 dei proteine nucleici e fornire importanti novità circa la specificità di legame delle proteine legate all'RNA tramite esperimenti di concorrenza del substrato 1 .
La configurazione sperimentale tradizionale per questi dosaggi consiste nel mescolare la proteina purificata con un substrato RNA radiomarcato. I complessi risultanti vengono poi analizzati con gel di poliacrilammide non denaturanti (nativi) versati tra due lastre di vetro seguite da elettroforesi di campione in un apparecchio verticale 3. Mentre questo approccio è stato utilizzato in modo esaustivo per fornire importanti conoscenze nei meccanismi biochimici che sono alla base del legame delle proteine agli acidi nucleici, ha anche diverse limitazioni. Ad esempio, questa strategia di base ha un rendimento relativamente basso e non è facilmente adattabile per applicazioni che richiedono l'analisi di molte reazioni vincolanti in parallelo. Inoltre, con l'apparato verticale tradizionale è impegnativo monitorare potenzialmente complessi in più volte durante l'elettroforesi 3 , 4 .
Qui presentiamo un adattamento del test EMSA che utilizza gel naturali di poliacrilammide gettate in un apparecchio pianale, elettroforesi orizzontale e sostanze RNA a fluorescenza 4 , 5 , 6 , 7 . L'incorporazione di queste modifiche relativamente semplici alla base straTegy fornisce alcuni potenti vantaggi. In particolare, il formato orizzontale a piattaforma si presta facilmente ad analizzare contemporaneamente dozzine di campioni 4 . Inoltre, per alcuni complessi di proteine RNA, come quelle formate tra la proteina Bicaudal-C e l'elettroforesi del suo substrato RNA in un gel orizzontale, fornisce una maggiore capacità di risolvere complessi distinti di proteine RNA e di discriminarli dal substrato RNA non legato.
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Protocol
1. Preparazione del Gel Naturale Orizzontale di Polyacrylamide 4 .
- Preparazione dei materiali necessari.
- Per l'apparecchio a gel orizzontale, utilizzare una scatola di gel (37 cm x 24 cm) con vassoio da 27 cm x 21 cm e una capacità per due pettini a 24 pozzetti. Questa impostazione fornisce un totale di 48 campioni che possono essere analizzati contemporaneamente.
- Preparare i reagenti seguenti: 40% Acrilammide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borato-EDTA pH 8,0), TEMED e 10% APS (ammonio persolfato).
- Generazione di un gel nativo di acrilammide al 10%.
- In un pallone da 500 mL, aggiungere 80 mL di 5x TBE, 100 mL di acrilammide al 40% ed acqua fino ad un volume finale di 400 mL.
- Aggiungere 4 mL di APS 10% e 400 μL di TEMED. Mescolare bene.
- Versare il mix nel vassoio di fusione orizzontale e lasciare che il gel si polimerizza per 30 min. Il gel sarà di circa 2 cm di spessore.
NOTA: I gel possono gettare in una cappa di fumo per velocizzarePolimerizzazione. Dopo la polimerizzazione, un sottile strato di liquido rimarrà in cima al gel. - Versare il liquido e sciacquare con il tampone di funzionamento. Rimuovere attentamente i pettini e sciacquare i pozzetti con il tampone in esecuzione utilizzando una siringa.
- Preparazione del buffer di esecuzione.
- Preparare 2 L di buffer di esecuzione 1x TBE per la scatola del gel. Diluire 400 mL di 5XTBE con 1600 mL e mescolare. Posizionare il tampone 1x TBE in camera fredda per raffreddarsi.
- Pre-eseguire il gel
- Aggiungere 2 l di tampone di freddo alla scatola del gel e inserire il gel.
- Pre-eseguire il gel a 120 V per 1 ora a 4 ° C in una stanza fredda. Durante questo tempo, preparare la reazione di legame.
2. Reazione legante 8
- 2.1.Prepare i seguenti componenti di reazione.
20 mM DTT
10 mM BSA
10 mM tRNA di lievito
5X buffer di legame (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0,2% Tween-20)
100 nM fluoresceina etichettata RNA acquistata in commercio
Proteina Bicaudal-C concentrata
50% glicerolo in trattata con DEPC H 2 O
Trattata con DEPC H 2 O - Montare i componenti di reazione di binding in un tubo di microcentrifuga libero di RNase.
- Al tubo aggiungere 5 μl di 10 mM BSA, 5 μL di 20 mM DTT, 5 μL di tRNA 10 mM di lieviti, 10 μl di 5X Binding Buffer.
- Aggiungere la proteina ad una concentrazione finale di 250 nM in 50 μL. Aggiungere acqua a un volume finale di 45 μL.
- Aggiungere 5 μL di substrato RNA a fluorescenza. Utilizzare un substrato a 32 nucleotidi etichettato con fluoresceina 3 'commercialmente acquistato.
- Mescolare e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Analisi dei campioni sul Gel nativo orizzontale di poliacrilammide
- Ad ogni reazione aggiungere 15 μl di glicerolo al 50% e mescolare delicatamente.
- CarefuAggiungere 30 μL di ogni reazione al gel. La quantità di campione che può essere caricata in un pozzo singolo varia a seconda dello spessore del gel e della dimensione dei pozzetti. Abbiamo caricato volumi fino a 15 μL e fino a 45 μL in un unico pozzetto di gel creato con un pettine da 24 pozzetti e versato allo spessore di 2 cm.
- Dopo aver collegato l'alimentazione elettrica all'interruttore dell'apparecchio di alimentazione del gel e regolate la tensione. Eseguire il gel in 4 ° C a 120 V.
NOTA: per l'apparecchiatura orizzontale del gel, questo finisce per essere circa 5 V / cm. Per l'apparecchiatura verticale del gel, questo è 16 V / cm.- Per evitare danni o sbiancamento del RNA a fluorescenza, eseguire elettroforesi al buio.
- Varianti di elettroforesi a seconda delle specificità del complesso proteico RNA in fase di analisi.
NOTA: Un importante vantaggio dell'analisi orizzontale EMSA è che l'elettroforesi può essere interrotta, il gel che è stato imaged e poi il gePuò essere posizionato nell'apparecchio e l'elettroforesi può essere continuata per tempi più lunghi.
4. Imaging del gel
- Eseguire analisi con qualsiasi strumento progettato per rilevare e riprodurre substrati fluorescenti.
- Posizionare il gel sull'immagine.
- Regolare le impostazioni dell'immagine. Per i ligandi RNA con etichettatura fluoresceina, utilizzare le seguenti impostazioni: FAM (lunghezza d'onda 473 nm), 750 tensione fotomoltiplicatrice (PMT), dimensioni di 100 μm pixel.
- Scansiona il gel per catturare l'immagine.
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Representative Results
Per dimostrare la potenza e la versatilità dell'elettroforesi gel geo orizzontale abbiamo analizzato il legame della proteina Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) a un RNA a fluorescenza etichettato contenente un sito di legame Bicc1. Le proteine Bicc1 funzionano come repressori transazionali trasversali mRNA per controllare le decisioni del destino cellulare durante le fasi materne dello sviluppo animale 9 , 10 , 11 , 12 così come le funzioni di organi specifici negli adulti 13 , 14 . Il nostro lavoro in Xenopus ha identificato il primo sito di legame per una proteina Bicc1 8 : una regione a 32 nucleotidi dalla 3'UTR dell'MRNA 8 , 12 di Cripto-1. Questo sito di legame è stato definito utilizzando una combinazione di tecniche: RNase proteggereIoni e impronta, esperimenti in lega in vivo e test in vitro EMSA 8 .
La proteina purificata Xenopus Bicc1 è stata mescolata con un RNA a 32 nucleotidi etichettati con fluorescenza; Il sito di legame Bicc1 dall'MRNA 8 di Cripto-1. In una reazione separata, la proteina Bicc1 è stata mescolata con un RNA a 32 nucleotidi etichettato con fluorescenza derivato dalla 3'UTR del mRNA ciclin B1. Bicc1 non si lega al ciclina B1 mRNA 8 , 12 e questo RNA serve come controllo negativo. La metà di ogni reazione è stata analizzata su un gel di poliacrilamide nativo verticale ( Figura 1A ) mentre l'altra parte è stata analizzata in parallelo utilizzando gel nativo orizzontale ( Figura 1B ). È immediatamente evidente utilizzando un metodo che Bicc1 si lega all'RNA Crypto-1 RNA e forma un complesso specifico aNd non lega il ciclo B1 negativo di controllo RNA. Tuttavia, i complessi Bicc1-Cripto-1 sono significativamente più distinti quando vengono analizzati con il gel orizzontale, facilitando il loro rilevamento e consentendo la discriminazione dei complessi proteina-RNA da RNA non legato. Dopo l'imaging, il gel è stato riposto nell'apparecchio gel e elettroforizzato per altri tre ore e mezzo. Dopo la reimaging del gel, i complessi si erano migrati ulteriormente e sono ancora prontamente rilevabili, indicando la loro stabilità ( Figura 1C ). Questa capacità di continuare l'elettroforesi e l'analisi dopo l'imaging iniziale sarebbe impegnativa, se non impossibile, con il formato gel verticale.
Figura 1: confronto dei gel nativi verticali e orizzontali per l'analisi del legame di Bicc1 a Cripto1 RNA. BiGli esperimenti di binding di cc1 sono stati condotti con un controllo negativo di CyclinB1 RNA fluorescente a 32 nucleotidi o un controllo positivo di Cryptone RNA a 32 nucleotidi fluorescenti. Ogni reazione conteneva 0 nM o 250 nM di terminale N-terminale SUMO-Bicc1 e analizzato su un gel nativo di poliacrilammide verticale ( A ) eseguito per 30 minuti a 120 V a 4 ° C o come campioni duplicati nel gel nativo di poliacrilammide orizzontale per ( B ) 2 h a 120 V a 4 ° C o ( C ) 5,5 h a 120 V a 4 ° C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I gel naturali di polyacrylamide sono uno strumento prezioso per indagare le interazioni proteina-RNA e tradizionalmente questi gel sono elettroforizzati verticalmente 2 , 3 . Abbiamo utilizzato una modifica del protocollo che sostituisce gel naturali di poliacrilammide creati ed elettroforesi orizzontalmente 1 , 4 , 6 , 7 , 15 . Queste modifiche usate in combinazione con substrati RNA con etichettatura a fluorescenza forniscono numerosi vantaggi per l'analisi biochimica delle interazioni di binding proteina-RNA. Questi vantaggi includono i seguenti: la miscelazione dei buffer è semplificata rispetto ad un apparecchio verticale che richiede che una pompa trasferisca il buffer dalla camera inferiore ai gel superiori orizzontali possa essere generata con i pozzi più grandi che forniscono una maggiore capacità di analisi della larI campioni di ger, l'elettroforesi sui gel orizzontali spesso forniscono una migliore risoluzione dei complessi di proteine RNA rispetto ai gel verticali e l'elettroforesi orizzontale a gel fornisce la capacità di sperimentare immagini in più punti temporali durante l'analisi.
Un altro grande vantaggio è che il formato orizzontale si presta alla creazione di gel con un gran numero di pozzetti che fornisce la capacità di analizzare più campioni in parallelo 1 . Questa caratteristica espande significativamente il loro utilizzo come strumento biochimico per l'analisi delle interazioni tra proteine RNA. Ad esempio, la capacità di analizzare campioni multipli facilita indagare parametri quantitativi di formazione del complesso proteina-RNA mediante l'uso di esperimenti di competizione 15, k off analisi 15 nonché esperimenti volti a definire la stechiometria dei componenti complessi leganti 15. Inoltre, l'uso di unI substrati fluorescenti di RNA permettono di effettuare analisi multiple, come i test di legame di polarizzazione di fluorescenza da una singola reazione e ottenere sia dati quantitativi che qualitativi di legame 5 , 15 .
Per ottenere risultati ottimali dall'installazione orizzontale del gel, esistono vari parametri che possono essere regolati per migliorare la qualità dei complessi per l'imaging. Queste includono la modifica della percentuale di acrilammide del gel per rendere più facile gestire e migliorare la separazione dei complessi proteina-RNA dal libero RNA più. Tuttavia, può essere difficile gestire gel di acrilammide a bassa percentuale a causa della dimensione. Abbiamo più facile usare gel che hanno una concentrazione di acrilamide del 7,5% o più. Inoltre, se necessario, le condizioni di elettroforesi possono essere modificate per migliorare la stabilità dei complessi proteina-RNA; Regolando la tensione di elettroforesi, eseguendo il gel a temperatura ambienteAd a 4 ° C e regolando le condizioni di pre-funzionamento.
Nonostante i numerosi vantaggi ci sono anche alcune limitazioni dei test orizzontali di elettroforesi di gel nativo. Ad esempio, la sua utility viene massimizzata utilizzando un substrato RNA fluorescente. A seconda del fluoroforo scelto e della dimensione dell'RNA, l'ottenimento di tali substrati può essere costoso. Inoltre, i gel orizzontali sono generalmente molto più grandi dei gel verticali e richiedono pertanto maggiori quantità di materiali quali poliacrilammide e soluzioni trattate con DEPC.
L'elettroforesi gel nativa orizzontale ha il potenziale per essere utilizzato come strumento di convalida per schermature molecolari che cercano di identificare composti che interessano le interazioni RNA-proteine clinicamente rilevanti 16 . Tali schermi utilizzano in genere soluzioni biochimiche di soluzione per identificare composti pertinenti per ulteriori studi. Il potenziale di trasmissione più elevato del formato orizzontale rispetto al formato di formato verticaleDes l'opportunità di applicare l'elettroforesi genica natale come strumento per la convalida secondaria di potenziali candidati.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Laura Vanderploeg per la preparazione di figure. Il lavoro nel laboratorio Sheets è supportato dalla sovvenzione NSF 1050395 e dalla concessione di NIH (R21HD076828). Il lavoro nel laboratorio di Ryder è supportato da NIH concede R01GM117237 e R01GM117008. Megan Dowdle è sostenuta da una Scienza GRS Advanced Opportunity Fellowship attraverso l'Università di Wisconsin-Madison Scuola di Laurea e Programma di Formazione Biotecnologia attraverso l'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Salute (T32GM008349).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
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