Summary
Här presenterar vi ett protokoll för levande avbildning av mus-sekundär palatsfusion med konfokal mikroskopi. Detta protokoll kan användas i kombination med en rad fluorescerande reportermuslinjer, och med pathway-hämmare för mekanisk inblick. Detta protokoll kan anpassas för levande bildbehandling i andra utvecklingssystem.
Abstract
Sammansmältningen av de sekundära palatalhyllorna för att bilda den intakta sekundära gommen är en nyckelprocess i däggdjursutveckling och dess störning kan leda till kluven sekundär gom, en vanlig medfödd anomali hos människor. Sekundär gomfusion har studerats omfattande, vilket leder till flera föreslagna cellulära mekanismer som kan förmedla denna process. Dessa studier har emellertid för det mesta utförts på fasta embryonala vävnader vid progressiva tidpunkter under utveckling eller i fasta explantkulturer analyserade vid statiska tidpunkter. Statisk analys är begränsad för analys av dynamiska morfogenetiska processer, såsom en palatsfusion och vilka typer av dynamiska cellulära beteenden som medier palatalfusion är ofullständigt förstådd. Här beskrivs ett protokoll för levande avbildning av ex vivo sekundärpalatsfusion i musembryon. För att undersöka cellulära beteenden av gommen fusion användes epithelial-specifik Keratin14- cre för att märka gomepitelceller i ROSA26-mTmG Flox reporter embryon. För att visualisera filamentöst aktin användes Lifeact-mRFPruby- reportermöss. Levande bildbehandling av sekundär palatsfusion utfördes genom att dissekera nyligen adhererade sekundära palatalhyllor av embryonala (E) 14.5-stegsembryon och odling i agaroshaltiga medier på en glasskål för att möjliggöra avbildning med ett inverterat konfokalmikroskop. Med hjälp av denna metod har vi upptäckt en mängd nya cellulära beteenden under sekundär palatsfusion. En uppskattning av hur distinkt cellbeteende samordnas i rymden och tiden bidrar mycket till vår förståelse av denna dynamiska morfogenetiska process. Detta protokoll kan appliceras på mutanta muslinjer eller kulturer behandlade med farmakologiska hämmare för att ytterligare förstå förståelse för hur sekundär palatsfusion kontrolleras.
Introduction
Vävnadsfusion är ett viktigt steg i utvecklingen av flera organ. Huvudsakliga mänskliga fosterskador som klyvtapp och gom, spina bifida och missbildningar av hjärtat kan bero på brister i vävnadsfusion 1 . Mus sekundär gommen fusion har studerats omfattande för att identifiera de cellulära och molekylära mekanismerna som kontrollerar vävnadsfusion i utveckling 2 , 3 , 4 . I muskeln börjar sekundär gommen utveckling runt E11.5 med utväxten av en sekundär palatalhylla från varje bilateral maxillärprocess. Initial tillväxt av palatalhyllorna sker vertikalt längs tungan, tills ungefär E14.0, vid vilken tidpunkt palatalhyllorna höjs horisontellt över tungan. Medialt riktad tillväxt resulterar i fysisk kontakt mellan epithelernas tillhörande epitel i de två palatala hyllorna, som bildar mittlinjen epitheliAl seam (MES) vid E14.5. Den mellanliggande MES måste avlägsnas från mellan de sekundära palatalhyllorna för att möjliggöra mesenkymkonfluens och utvecklingen av en intakt, fullständigt smält sekundär gommen genom E15.5 3 .
Hur en gemensam epitelial MES-cellskikt bildas mellan två separata palatala hyllor och sedan avlägsnas för att uppnå mesenkymkonfluens har varit en central fråga vid gomutveckling. Baserat på mus histologiska och elektronmikroskopi (EM) studier, explant kulturstudier och funktionella musgenetiska experiment har flera grundläggande cellbeteenden varit inblandade i denna process. Filopodia-liknande utsprång från medialkanten epitel MEE av varje palatalhylla underlättar initial kontakt 5 , 6 följt av interkalering av dessa epitelceller till en gemensam singel MES 6 , 7 . Avlägsnande av den resulterande delade MESHar föreslagits att fortsätta med tre icke-exklusiva mekanismer. Tidiga studier som använde histologisk observation och ex vivo linjespårning med vitala färgämnen indikerade att MES kan avlägsnas genom epitel till mesenkymal övergång (EMT) hos MES-celler 8 , 9 , men nyligen har genetisk linjär spårning av epitelceller ökat osäkerheten med avseende på Det långsiktiga bidraget från epitelceller till palatalhylsan mesenchym 10 , 11 , 12 . Signifikant antal apoptotiska celler och en minskning av deras antal i vissa mutanter som misslyckas med att genomgå riktig palatsfusion har lett till tanken att apoptos kan vara en viktig drivkraft för MES-upplösning 2 , 3 . Slutligen baseras initialt på studier som involverar epitelmärkning och statisk observation vid progressiva tidpunkter, MES-cellerFöreslogs att migrera i oronasala och anteroposterior dimensionerna 11 , 13 , men sådana dynamiska cellbeteenden var initialt okontrollerade på grund av en oförmåga att observera dem i levande palatal vävnad. Nyligen kunde vi direkt observera dessa beteenden genom att utveckla en ny levande bildhanteringsmetodik som kombinerar musegenetiska metoder för fluorescerande märkning med konfokal levande bildbehandling av explanted palatal hyllor.
Först, för att visualisera dynamiska cellulära beteenden i gom epitelceller under gommen fusion, genererade vi en epitelial specifika reporter mus genom att korsa ROSA26-mTmG flox möss med Keratin14-cre möss 14, 15. Konfokal levande avbildning av palat explant kultur av de resulterande embryon bekräftade några tidigare föreslagna cellulära beteenden och identifierade nya händelser i fusionsprocessen 6 6 , 16 . Denna bildmetod kan användas med andra reporterlinjer; Vi utnyttjade Lifeact-mRFPruby- transgena möss 17 , 18 för att undersöka aktins cytoskeletaldynamik under fusionsprocessen. Andra journalister kan också användas för att observera andra specifika aspekter av gomfusion, och denna metod kan anpassas antingen till laserskanning av konfokal mikroskopi eller för spin-disk-konfokal mikroskopi beroende på bildbehov och tillgänglighet av mikroskop. Levande bildbehandling blir alltmer en keystone-strategi i utvecklingsbiologi. PartiCularly, kraniofacial morfogenes är komplex och mänskliga fosterskador som påverkar ansiktet är vanliga. Denna konfokala levande avbildningsmetod kommer att bidra till att möjliggöra en bättre förståelse av underliggande grundläggande utvecklingsmekanismer såväl som ursprung för mänskliga kraniofaciella abnormiteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med protokoll från University of California i San Francisco Institutionella djurvård och användningskommitté.
1. Förberedelse av Live Imaging Media
- Framställning av flytande odlingsmedium
- Lägg till 20% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 200 | ig / ml L-askorbinsyra, 15 mM HEPES till Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) / F12 media.
OBS! Live-bildmedia gjordes nyligen före bilden. Detta medium innehåller fenolrött vilket kan leda till fototoxicitet över långa kurser med levande bildbehandling. Att ersätta media utan fenol-röda kan förbättra långsiktig bildbehandling.
- Lägg till 20% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 200 | ig / ml L-askorbinsyra, 15 mM HEPES till Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) / F12 media.
- Framställning av lågsmältande agaroslösning
- Lös 350 mg lågsmältande agaros i 10 ml autoklaverat destillerat vatten för att ge en 3,5% stamlösning.
- Blanda agaroslösningen väl och inkubera vid 70 ° C i ett vattenbad för att upplösa agarosen fullständigt.
- Kyl ner agaroslösningen i ett 37 ° C vattenbad innan du lägger det till livebildningsmediet.
- Tillsätt 1 ml agaros stamlösning till 5 ml av det flytande levande bildmediet för att få en slutlig koncentration (0,6%).
- Förvara media med agaros i ett 37 ° C vattenbad för att förhindra för tidig stelning.
2. Framställning av Palate Explant Culture för Live Imaging
- Dissektion av nyligen adhered E14.5 sekundära palatal hyllor
OBS! Enligt vår erfarenhet kräver bildbildningsfusion att man börjar med ett lite adhered par palatal hyllor; Denna vidhäftning förhindrar explantrörelser som förhindrar fusion från att inträffa under bildbehandling.- Dissekter E14.5-stadium embryon i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och välj grönt fluorescerande protein (GFP) -expressing (frånK14-cre; ROSA26-mTmG flox) eller (Röd fluorescerande protein) RFP-uttryck (från Lifeact-mRFPruby) positiva embryon med hjälp av ett dissekerande mikroskop utrustat med lysrör. Överför vävnad till förvärmd levande bildkulturmedium utan agaros.
- Klipp embryohuvudet och ta bort övre hjärnområde genom att använda två fina 5-tångar ( Figur 1 A-C ). Använd ett nr 5 tångar för att hålla embryot medan den andra nr 5 tångar för att skära bort extra vävnad utanför de palatala hyllorna.
OBS: Fin sax kan användas för att skära embryohuvudet (det första steget) i stället för en nr 5 tangent. Men två nr 5 finpincett ger bättre kontroll för att göra exakta nedskärningar. - Ta bort mandeln försiktigt utan att skada palatal hyllor som visas i Figur 1 D och 1E . För att minska risken att skada palat, behåll tungan genom dissektion av mandilen, fOrsakad av noggrann avlägsnande av tungan.
- Efter att du har tagit bort mandel och tunga, undersök den orala sidan av sekundärgommen med ett stereomikroskop med fluorescens för att bekräfta stark reportersignal i MES ( Figur 1 M ).
- Dissektera bakre delar, inklusive hjärnben och hjärnstammen efter att ha tagit bort mandel och tunga ( Figur 1 F ).
- Ta bort båda maxillorna med vidhäftande palatal hyllor ( Figur 1 G ).
- Skär den främre övre käftvävnaden som håller både primär och sekundär gommen intakt ( Figur 1 H och I ).
- Ta bort nasal septum på nasidan av explant som exponerar MES.
OBS! Dessa senare steg med dissektioner behöver noggrann uppmärksamhet, så att kontakterna mellan två sekundära palatalhyllor inte störs. Avlägsnande av nässla septum hjälper tillMinska bakgrundssignalen från andra områden och minska också vertikal vävnadsrörelse, vilket möjliggör stabil bildbehandling ( Figur 1 J-L ). - Efter dissekering av palatalhyllorna, granska reportersignalen igen för att se till att det inte finns skador på epitelskiktet mellan vävnaderna.
- Inrätta palatexplantat i kulturrätt med levande bildmaterial
- Sätt levande bildbildningsmedia i 35 mm glasfodral.
- Sätt dissekerade palatal hyllor muntlig sida nedåt så nära glasplattan som möjligt för avbildning med ett inverterat konfokalmikroskop ( Figur 1 N ).
- Placera torrispellets på en ledande yta i närheten av odlingsskålen för att påskynda agaroshärdning genom att minska temperaturen snabbt eller sätt odlingsskålen vid 4 ° C. En kall tallrik, såsom en som används för inbäddning av paraffin, kan också användas vid denna stage.
OBS! När torris används, måste agaros byte av media övervakas noggrant för att förhindra frysmedia.
3. Confocal Time-lapse Imaging of Palate Explant
- Bildbehandling och datainsamling
- Efter agaros var halvstärkt, montera odlingsskålen i ett inverterat konfokalt mikroskop utrustad med 37 ° C inkubationskammare. Använd ett konfokalmikroskop med vitljus och cellobservatörs spinnskiv konfokalmikroskop.
OBS: Vi använde ett modifierat medium innehållande 15 mM HEPES utan CO 2 -gas. - Lägg petroleumjelly mellan odlingsskålen och täcka med en spruta för att förhindra avdunstning av media ( Figur 1 N ).
OBS: En viss kondensation ovanpå odlingsskålen efter över natten (O / N) -kultur inträffar men volymen av media ändras inte vilket tyder på att petroleumgelen förhindrar att medierna avdunstar. - Hitta intressanta regionen med låga förstoringsmål (10x) och använd högre förstoringsmål (20x objektiv med 3x digital zoom eller 40x objektiv med Immersol W) för time-lapse live imaging.
OBS: Uppdelade sekundära palatal hyllor är inte plana. Den sekundära gommen är en krökt struktur och det gör det svårt att bilda hela MES i samma plan. Låg förstoring (10x) avbildning kan möjliggöra hel palatsbildning men 40x-mål ger bättre bildupplösning för att undersöka detaljerade cellulära rörelser i djupare Z-positioner. Krumningen är hög i mittenpalatsregionen. Den främre och bakre gommen är relativt platt jämfört med mitten gommen. Vi bildar ofta mot mitten av framsidan av sekundärgommen för att undvika regioner med störst krökning. - Skanna flera Z-staplar med 5 μm varje steg i 16-24 timmar med korrekt laser excitation (488 nm för GFP och 532/561 nm för RFP) ( Figur 2 ).
OBSERVERA: För att minska potentiell fototoxicitet, använd minsta laserkraft och exponeringstid. Detta är viktigt, särskilt vid flerfärgad bildbehandling. Använd 22% av 552 nm laserkraft för membranTomato (mT), 30% av 495 nm laserkraft för membranGFP (mG) och 25% av 561 nm laserkraft för membranRFP. Genomsnittlig exponeringstid var 550 ms. - Använd bildanalysprogramvara för att utföra cellspårning och kvantitativ analys.
- Efter agaros var halvstärkt, montera odlingsskålen i ett inverterat konfokalt mikroskop utrustad med 37 ° C inkubationskammare. Använd ett konfokalmikroskop med vitljus och cellobservatörs spinnskiv konfokalmikroskop.
4. Data Image Analysis
OBS! Här användes Imaris. Liknande data analyser kan också utföras med ImageJ eller Volocity mjukvarupaket.
- Rendering av tredimensionella (3D) ytor från bildsekvenser.
OBS! Det här avsnittet möjliggör generering av en yta från en film som genereras med en membran-GFP-signal.- Klicka på Redigera | Visa skärmjustering och använd histogramreglaget för att justera signalintensiteten så att membransignalen är klarUt längden på filmen ( figur 3 A ).
- Korrekt blekt signal med hjälp av Image Bearbetning | Dämpningskorrigering . Justera Intensity Front och Intensity Back-värden så att membransignalen är klar under hela filmens längd. Vissa försök och fel kan behövas vid inställningen av dessa värden.
OBS: Värdet för Intensity Back (Deper Z-läge) kommer att vara mindre än Intensity Front (Surface Z position) värdet på grund av begränsad laserpenetration. Dessa värden kan därför också ändras för att normalisera signalintensiteten i Z-serien. Båda värdena kan justeras för att uppnå blekningskorrigering. Dämpningskorrigering kallas också emissionsdämpningskorrigering 19 . - För att skapa en yta från membransignalen, välj Surpass | Surfaces , välj en källkanal och Threshold-typ (Absolute Intensity) och under Algoritm Settings select Segment endast en region av intresse Och processen för hela bilden äntligen följt av att klicka på framåtpilen; Fortsätt att trycka på framåtpilen (använd standardinställningarna, eller ange Surface Area Detail Nivåer och tröskelvärdesmetod genom försök och fel), kontrollera om den genererade ytan återspeglar fluorescenssignalen. För att ange en region av intresse, välj region och tid (er) som ska göras genom att beskära X, Y, Z positioner.
OBS: Välj Processen med hela bilden så att justeringar och tröskelvärden kommer att appliceras över hela filmen. - Generera en yta genom att klicka på pilknappen framåt igen. Justera sedan tröskeln genom att ändra histogrammet i Filter för att motsvara membransignalen.
- När ytan är genererad, välj yta i ytor / inställningar för att visualisera ytsignalen och avsluta ytgenereringsprocessen genom att trycka på dubbelförskjutningenArd pilknappen ( Figur 3 B ).
- Gå till Yta | Redigera och klicka på Mask alla i Maskegenskaper för att generera en maskerad kanalbild.
- När du har klickat på OK öppnas fönstret Maskekanal automatiskt. Välj GFP-kanalen, ställ in voxlar utanför ytan till det högsta signalintensitetsvärdet (finns i Redigera | Displayjustering ) och voxlar inuti ytan till det lägsta GFP-intensitetsvärdet (finns även i Redigera | Displayjustering ), i Mask Settings för att generera en mask av membransignalen.
- Eftersom masken av membransignalen kommer att visas i volymvyn , generera inverterade bilder med hjälp av bildbehandling | Kontrastförändring | Invertera ( Figur 3C ).
- Upptäcka fläckar från inverterade ytbilder.
OBS! Det här avsnittet gör att varje cells centrum kan varaMarkerad med en unik plats och spårade över tid och rum.- Välj Överträffa scen | Spots | Skapa ; I Algoritm Inställningar väljer Segment endast en region av intresse , Process av hela bilden äntligen och Spårpunkter (över tiden) .
- Klicka på framåtpilen och ange en region av intresse Välj region och tid (er) för att spåra fläckar; Fortsätt att trycka på framåtpilen, välj den maskerade kanalen som en källkanal och bestäm den uppskattade XY-diameteren för fläckar.
- När du klickar på pilknappen framåt öppnas automatiskt ett filterfönster; Justera spotdetekteringströskeln genom att ändra värden i histogrammet för att generera enskilda fläckar i mitten av varje cell ( Figur 3 D ).
- Som att klicka på framåtpilen knappen igen öppnar Algorithm fönstret. Väljer Autoregressive motion tracking modell 20 och ange maximal tracking diHållning och maximal spaltstorlek för att ansluta spår som blir diskontinuerliga under en kort tidsperiod.
- När du klickar på pilknappen framåt kommer du att öppna fönstret Filters, ställa in tröskelvärdet för spårets längd genom att justera histogrammet så att varje cell spåras. Om du klickar på pilknappen för dubbla framåtriktningar kommer du att slutföra platsdetektering.
- För att korrigera vävnadsdrift, klicka på Spots | Spårredigerare och välj Korrekt drift . En algoritm öppnas automatiskt; Välj välj Translational drift, Include hela resultatet och korrigera objektpositioner .
- Generera utsiktsplaner för kvantitativ analys.
OBS! Programmets Scatterplot är ett verktyg för att generera flerdimensionella (X, Y, Z, Color and Scale) grafer med flera objekt. Dessa diagram är användbara för att se trender i många cellrörelser över tiden.- Gör 2D eller 3D-diagram av cellspårningsdata med hjälp avVantage-Add New Vantage- plottmeny ( Figur 3 E och 3F ).
- Välj Volym eller Spots och välj Skapa / Kategori och Plot Typ
- Justera plotvärden för att generera olika Vantage-grafer.
- Exportera diagram med hjälp av stillbildsfunktionen .
OBS! Statistiska data kan också exporteras som ett kalkylblad för ytterligare kvantitativ analys genom att klicka på Plot Numbers Area | Spara .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Levande avbildning av palat explant kultur avslöjade flera cellulära processer mediating palate fusion 6 . Inledande kontakter mellan två epitelceller är gjorda av membranutsprång ( Figur 2 B-2E ). När två epitelskikt möts bildar de ett flerskiktskiktat MES följt av interkalering för att skapa ett integrerat enkelcellskikt MES genom epithelkonvergens ( Figur 2 A-2E och Figur 2 K-2O ). Epitelceller i djupare Z-nivåer förskjuts också progressivt till den orala sidan av MES som bidrar till epithelkonvergensprocessen ( Figur 2 K ). Posterior-riktade cellmigration observerades i mittenpalats MES ( Figur 2 F-2J ). Dessutom fann vi epithelial cell extStörningar vid palatsfusion som tyder på att epitelceller i MES kan avlägsnas genom denna aktiva process ( Figur 2 Q, 2T ). Den integrerade epithelialsömmen kommer i slutändan att bryta ner för att uppnå mesenkymkonfluens ( Figur 2 S, 2T ).
Lifeact-mRFPruby- gommen visade dynamiska aktin-cytoskeletala omläggningar under palatsfusion 6 . Filamentous actin blev berikat vid gränsen mellan epitel- och mesenkymala områden som bildar en kabelliknande struktur längs den främre-bakre axeln ( Figur 2 K-2T) . Actomyosinkontraktilitet driver epithelkonvergens och MES-brott eftersom kemisk inhibering av antingen myosinaktivitet eller aktinpolymerisation blockerar dessa dynamiska processer 6 .
Hin-page = "1"> Programvaran användes för att spåra cellulära beteenden under palatsfusion. Den bästa metoden för cellspårning beror på reporterns signal. Om en kärnreportermus används, kan programmet spåra centrum för fluorescerande signaler som cellulära centra 21 . Nukleär GFP-reportermus, såsom ROSA26 GFP-NLS-lacZ ( GNZ) 22, kan därför användas för att märka epitelceller med användning av vävnadsspecifika Cre-linjer; I vår händer uppvisade den här specifika kärnreporteren snabbare blekning över den långa tidskursen som användes vid levande bildbehandling. Därför, utnyttjade vi den membran GFP reporter (ROSA26-mTmG flox) att följa epiteliala cellrörelser i våra studier. Detta krävde en metod för att identifiera och spåra enskilda celler med en membransignal. För att lösa detta problem använde vi en modifierad cellspårningsmetod ( Figur 3 och Protokoll avsnitt 4 ).
Innehåll "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1 : Schematisk vy av mus sekundär palatsdissektion. ( A ) Sett från sidan av E14.5 musembryo. För att dissekera palatala hyllor skarades huvudet längs den första vita prickade linjen, # 1. ( B, C ) Den övre hjärnan (ovanför den andra vita linjen, # 2) avlägsnades. ( D, E ) Oral bild av dissekerad huvud. Nedre mandil (# 3) dissekerades och tungan (# 4) avlägsnades. ( F ) Posterior del av huvudet längs linjen # 5 skars ut. ( GI ) Både maxillan (# 6, # 7) och den främre delen av övre käften (# 8) avlägsnades. ( JL ) Nasal septum (# 9) avlägsnades ( M ) GFP signaler i MES av dissekerad gom från en K14-cre; ROSA26 mTmG- musembryo. ( N ) Live bildbehandling setup. Den muntliga sidan av palmenÅt explant vände sig ned för att bli avbildad med inverterat konfokalt mikroskop. MES anges med vita pilhuvud ( FI ). Det avbildade området indikeras av vita prickade lådor i L och M. Skalstänger = 2 cm i A, 1 cm i BI, 500 μm i JM. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Levande avbildning av palat explant kulturer. ( AE ) Live bildbehandling av den främre sekundära gommen från en K14-cre; ROSA26 mTmG explant (5 μm djup). Det vita pilhuvudet visar ett membranutsprång från en epithelialcell ( FJ ) Live bildbehandling av mittenpalatset från K14-cre; ROSA26 mTmG- explant (5 μm depth). Vita pilar indikerar riktningen av cellmigrationer från den främre till bakre gommen. ( KO ) Live bildbehandling av den främre gommen från Lifeact-mRFPruby explant (5 μm djup). Epitelcellförskjutning (gul pil) till oral yta och konvergens för att bilda en integrerad MES med kabelliknande aktinstrukturer i mittlinjen. ( PT ) Levande avbildning av den främre gommen från Lifeact-mRFPruby explant (25 μm djup). Den röda pilen indikerar en cellsträngsprutningshändelse ( Q, T ). Framtidsbristpunkten för sömmen indikeras av två vertikala vita pilar i S och T. Skalstänger = 20 μm. Alla levande avbildningsdata i denna figur är härledda från experiment som tidigare publicerats i 6 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
-sidan = "1"> 
Figur 3 : Dataanalys. ( AD ) för att spåra epitelceller med membran-GFP-signaler från K14-cre; ROSA26 mTmG- palat explant ( A ), En yta genererades genom volymåtergivning av membran-GFP-signalen ( B ). Inverterade bilder genererades efter maskering av den skapade ytan ( C ). Cellcentra identifierades från de inverterade bilderna med hjälp av en fläckdetekteringsfunktion i Imaris ( D ). ( E ) 3D-rekonstruktioner möjliggör spårning av cellrörelser i flera riktningar. A: anterior, P: posterior, N: nasal, O: oral ( F ) 2D-analys genererar en utsiktsplot som visar celler som migrerar från främre till bakre riktning i mitten av mitten. Skalstänger = 20 μm i AD, 10 μm i EF.S / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Video Figur 1: Live bildbehandling av K14-cre; ROSA26-mTmG flox anterior gommen (5 | j, m djup). Bilder fångades var 10: e minut (10 min / ram) under 16 h 20 min, Skala bar = 25 μm. Den här videon är en annan Z-position för en film som tidigare publicerats i referens 6 . Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video Figur 2: Live bildbehandling av K14-cre; ROSA26-mTmG flox Mitten gommen (5 μm djup). Bilderna fångades var 15: e minut (15 min / ram) i 13 h 30 min, Skala bar = 25 μm. Den här videon har tidigare publicerats i referens 6 . Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video Figur 3: Live bildbehandling av Lifeact-mRFPruby främre gommen (5 μm djup).
Bilder togs var 10: e minut (10 min / ram) under 7 h 50 min. Skala bar = 20 μm. Den här videon har tidigare publicerats i referens 6 . Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video Figur 4: Live bildbehandling av Lifeact-mRFPruby- främre gommen (25 μm djup).
Bilder togs var 10: e minut (10 min / ram) under 7 h 50 min. Skala bar = 20 μm. Den här videon är en annan Z-position för en film som tidigare publicerats i referens 6 . Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levande avbildning av vävnadsmorfogenes med 3D-organexplanteringskulturen kan ge detaljerad information om cellulära processer som inte kan visas i konventionell färganalys av fasta vävnadssektioner. Genom att använda in vitro- explant-kulturen av mus-embryonala sekundärpalats, observerade vi flera intressanta cellulära beteenden som ledde oss att föreslå en ny mekanism av palatsfusion som innefattar epitelkonvergens och cellsträngsprutning.
En gemensam utmaning i studier av denna typ är fotobildning genom kontinuerliga laser excitationer under en lång tidskurs. I våra studier användes en vit-confokal och ett spin-disk-konfokalmikroskop. En viss minskning av signalintensiteten över tiden kan korrigeras genom blekningskorrigeringar i bildhanteringsprogrammet (LAS-AF) (protokoll 4.1). Eftersom blekningskorrigering är begränsad är det viktigt att laseroptiken och exponeringstiden noggrant optimeras i varje bildsystem. Vi kontrollerade ocksåAtt gommen fusion sker normalt i live imaging media efter 3 dagars kultur 6 .
En andra vanlig fråga i live imaging är vävnadsdrift. Det är viktigt att minimera drift för att få konsekventa bilder under levande bildbehandling eftersom förändringar i fokusplanet kan förklara en förståelse för morfogenetiska förändringar över tiden. Medan kontroll av termisk drift kan uppnås i många konfokala mikroskop (bestämt fokus i mikroskopet) kan vävnadsdrift relativt glasbotten inte korrigeras med dessa metoder. Utnyttjande av agaros, liksom att placera explant mot glasbotten hjälper till att minimera detta, men det måste bara tas noggrannhet att analysera de filmer som upprätthåller en relativt konstant position. Detta kan bestämmas genom att följa flera kontrollpunkter i bildfältet över tiden för att bestämma om de är konstanta, flytta med en liknande trend eller flytta annorlunda. I en utsträckning använder man efterbehandlings fuNctions möjliggör en korrigering av viss vävnadsdrift i live imaging (protokoll 4.2).
Lågsmältande agaros användes vid en slutlig koncentration av 0,6% i levande bildmedium för att immobilisera de explanta vävnaderna. När vi testat högre koncentrationer av agaros verkar de försvaga vävnadsmorfogenes möjligen på grund av mekanisk begränsning. Det är därför viktigt att använda den korrekta agaroskoncentrationen för att minimera vävnadsdrift och inte störa morfogenesen.
På grund av konfokalt bilddjup utgör denna metod gränser vid undersökning av mycket djupa Z-planer av gomfusion. Med hjälp av både WHITE LIGHT och spin-disk-konfokalmikroskop kan signal från 100 μm djup bildas framgångsrikt, trots att bilden började bli matt och svag över denna gräns. Eftersom gommen fusion är en progressiv process i oronasala och anteroposterior axlar, föreslår vi att bildhantering flera positioner effektivt möjliggör avbildning av olika deptHs av gommen fusion, men två-foton eller ljusblad konfokal mikroskopi kan användas i framtiden för att förbättra bilddiametern. I de flesta av våra experiment var den orala sidan av gomexplantering avbildad. Imaging av nätsidan av gommen explant är svår eftersom nasal septum är smält eller mycket nära de sekundära palatal hyllorna. I våra försök att bildfusion från nässidan var det också nödvändigt att avlägsna den extra nasala vävnaden så att den inte störde signalen från gommen epitel. Trots det var det svårt att avbilda nässidan av gomexplanteringen, eftersom dissektion av nässkytten ofta orsakade skada på gommenexplanteringarna.
Levande avbildning av reportermus-vävnadsexplantanter är en kraftfull metod för att studera cellmekanismer för vävnadsmorfogenes under embryonisk utveckling. Med hjälp av konfokalmikroskopiteknik och kvantitativ bildanalys kan grundläggande utvecklingsprocesser som sekundär palatsfusion varaUndersökts på mobilnivån.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar M. Douglas Benson för första samtal om sekundär gombildning. Vi erkänner också David Castaneda-Castellanos (Leica) och Chris Rieken (Zeiss) för deras hjälp att anpassa bildförhållanden i konfokal mikroskopi. Vi uppskattar Lynsey Hamilton (Bitplane) för användbara förslag på kvantitativ bildanalys med hjälp av Imaris-programvaran. Detta arbete finansierades av NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
