Summary
كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء تحليل تمثل أدوات تجريبية للتحقيق التوازن الدوبامين في الفئران بعد تقييم وظيفة نقل الدوبامين ومستويات الدوبامين في نسيج سترياتال، وامتصاص الدوبامين سينابتوسومال على التوالي. نقدم هنا بروتوكولات لقياس محتوى الأنسجة الدوبامين وتقييم الأداء الوظيفي للناقل الدوبامين.
Abstract
الدوبامين (DA) ناقل عصبي مودولاتوري السيطرة على النشاط الحركي ومكافأة العمليات والوظائف المعرفية. ضعف كبيرة تتميز (دايرجيك) يرتبط ارتباطاً قويا بالعديد من الأمراض المرتبطة بالجهاز العصبي المركزي مثل مرض باركنسون، واضطراب نقص الانتباه-العجز-فرط النشاط وإدمان المخدرات1،2 ،،من34. تحديد آليات الأمراض التي تنطوي على خلل دا يتوقف بصورة حاسمة على نماذج حيوانية تحاكي جوانب الأمراض، وهكذا البروتوكولات التي تقييم أجزاء معينة من التوازن دا مهم لتقديم رؤى جديدة وممكن العلاجية أهدافا لهذه الأمراض.
هنا، نحن نقدم اثنين من البروتوكولات التجريبية مفيدة أن عند الجمع بينها وتوفر قراءة وظيفية للنظام دايرجيك في الفئران. يتم الحصول على المعلمات البيوكيميائية والوظيفية على التوازن دا من خلال تقييم مستويات دا والدوبامين وظيفة الناقل (دات)5. عند التحقيق في النظام دا، القدرة على قياس موثوق بها مستويات الذاتية دا من الدماغ الكبار أمر أساسي. ولذلك، نقدم على كيفية أداء كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) في أنسجة المخ من الفئران لتحديد مستويات التنمية. ونحن إجراء التجربة على الأنسجة من المخطط الظهرية (دستر) ونواة accumbens (NAc)، ولكن الأسلوب أيضا مناسبة للمناطق الأخرى في المخ معصب دا.
دات ضروري لامتصاص دا إلى المحطة presynaptic، وبالتالي السيطرة على النشاط الزماني والمكاني في صدر جدول أعمال التنمية. معرفة مستويات ووظائف دات في المخطط أهمية كبرى عند تقييم التوازن دا. هنا، نحن نقدم بروتوكول يسمح للاستدلال في نفس الوقت معلومات عن مستويات السطحية ودالة باستخدام مقايسة امتصاص سينابتوسومال6 دا.
توفر الأساليب الحالية جنبا إلى جنب مع البروتوكولات القياسية إيمونوبلوتينج الباحث بالأدوات ذات الصلة لوصف النظام دايرجيك.
Introduction
الدوبامين (DA) ناقل عصبي مودولاتوري حاسمة بالنسبة للسلوك الحركي والمكافأة والوظائف المعرفية1،7،،من89. الاختلالات في التوازن دا متورطة في العديد من الأمراض العصبية مثل الاهتمام-اضطراب فرط النشاط، وإدمان المخدرات والاكتئاب ومرض باركنسون1. يتم تحريرها دا من العصبية presynaptic في المشقوق متشابك، حيث يربط وينشط المستقبلات على غشاء ما قبل وبوستسينابتيك، وبالتالي زيادة نقل الإشارات. مستوى دا في المشبك بعد إطلاق سراح يسيطر دات3،10مكانياً وزمنياً. الناقل تبتلع دا من الفضاء خارج الخلية، وهكذا تحافظ على مستويات دا الفسيولوجية3،11. الأسباب الوراثية إزالة دات في الفئران من هايبردوبامينيرجيك النمط الظاهري تتميز بمستويات مرتفعة من دا متشابك، استنفاد مجمعات دا داخل الخلايا وتغيرات عميقة في دايرجيك بوستسينابتيك يشير إلى10،12.
هنا، تعرض اثنين من بروتوكولات منفصلة، أسلوب واحد لمحتوى الأنسجة التدبير دا وأخرى لتقييم الأداء الوظيفي ل dat. المجمعة مع الإنزيم بيوتينيليشن السطحية ووصف غابرييل et al.13 هذان الأسلوبان يوفر معلومات عن دا المحتوى ووظيفية مستويات دات لإجراء تقييم دقيق للتوازن دا. مع هذه الأساليب يمكن وصف التوازن دا الفئران المحورة وراثيا أو نماذج الأمراض المختلفة ووصف. تم تنفيذ هذه الأدوات والأمثل ويتم استخدام القياسية في مختبراتنا. عملت فحوصات الحالية للتحقيق في الآثار على التوازن دا لتغيير ج--المحطة الطرفية دات14 أو التعبير عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية تحت المروج تيروزين hydroxylase (TH) 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
المبادئ التوجيهية "مفتشية التجريب الحيوان الدانمركية" (رقم إذن: 2017-15-0201-01160) أعقب وإجراء التجارب في منشأة آآلاك المعتمدة كاملة تحت إشراف رعاية الحيوانات المحلية اللجنة-
1-"امتصاص الدوبامين سينابتوسومال" (أسلوب 1)
ملاحظة: هذا البروتوكول هو تقييم موازية لاثنين من العقول، ولكن يمكن أن تستخدم بنجاح القيام بتجارب الامتصاص دا سينابتوسومال مع العقول الأربعة في متوازي.
- أنابيب الاستعدادات
- تسمية 48 1.5 مل مايكرو--أجهزة الطرد المركزي في الجدول 1 (24 لكل الدماغ). استخدام ألوان مختلفة لأنابيب المنتمين إلى كل الدماغ لمنع الالتباس بين عينات
- التﻷلؤ 51 تسمية أنابيب #1-51- فوسفات
- مكان مخزنة المالحة (PBS) على الجليد. سيتم استخدام هذا للحفاظ على العقول مبردة.
- تشغيل أجهزة الطرد المركزي للسماح لتبرد قبل إلى 4 درجة مئوية.
- قبل تزن أنبوبين مايكرو--أجهزة الطرد المركزي للحصول على وزن الأنسجة الدقيقة أثناء إعداد سينابتوسومال (قسم 2.6).
- التجانس إعداد المخزن المؤقت عن طريق خلط السكروز حبيس و 0.32 م 4 مم. ضبط ال pH إلى 7.4 والحفاظ على مدت
ملاحظة: التجانس المخزن المؤقت يمكن الاحتفاظ بها في مختبرين في-20 درجة مئوية ومذاب يوم التجربة.
المخزن المؤقت لامتصاص - تحضير عن طريق الجمع بين ما يلي: 25 مم هيبيس، 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 1.2 مم كاكل 2، 1.2 مم MgSO 4، 1 ملم حمض الأسكوربيك (0.194 غرام/لتر)، 5 ملم د-الجلوكوز (0.991 غرام/لتر). ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم (يؤدي إلى تركيز صوديوم حوالي 130 مم) والحفاظ على مدت
ملاحظة: للعقول 2، إعداد المخزن المؤقت لاستيعاب 1500 مل. إعداد المخزن المؤقت لامتصاص 10 × الحل الأسهم دون حمض الأسكوربيك والجلوكوز في 4 ° جعل جيم 1 × الحل العامل طازجة اليوم، المكمل مع حمض الأسكوربيك والسكر. ضبط الأس الهيدروجيني مع هيدروكسيد الصوديوم إلى 7.4.
المخزن المؤقت لامتصاص إعداد - + يجند بالجمع بين ما يلي: 25 مم هيبيس، 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 1.2 مم CaC l2، 1.2 مم MgSO 4، 1 ملم حمض الأسكوربيك (0.194 غرام/لتر)، 5 ملم د-الجلوكوز (0.991 غرام/لتر)، 1 ميكرومتر بارجيليني، 100 نانومتر desipramine، 10 نانومتر مثبط الكاتيتشول-O-الميثيل-ترانسفيراز (ضميرياً). ضبط على درجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم، والحفاظ على مدت
ملاحظة: استخدام المخزن المؤقت لاستيعاب 50 مل وإضافة [ليغند]. تتم إضافة بارجيليني للمساعدة في منع تدهور دا بالاكسدة عن طريق مونوأمين أوكسيديز (ماو). يتم إضافة ضميرياً المانع (RO-41-0960) للحيلولة دون تردي دا (الكاتيشولامين بصورة عامة) من خلال ضميرياً. ديسيبراميني إضافة إلى تمنع امتصاص عن طريق الناقلين السيروتونين وإفراز، ومما جعل الإقبال على نتائج محددة دات
المخزن المؤقت لامتصاص إعداد - + يجند الكوكايين عن طريق الجمع بين ما يلي: 25 مم حبيس، 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 1.2 مم كاكل 2، 1.2 مم MgSO 4، 1 ملم حمض الأسكوربيك (0.194 غرام/لتر)، 5 ملم د-الجلوكوز (0.991 غرام/لتر)، 1 ميكرومتر بارجيليني، 100 نانومتر desipramine ، 10 نانومتر ضميرياً المانع، والكوكايين 500 ميكرومتر. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم، والحفاظ على مدت
ملاحظة: استخدام المخزن المؤقت لاستيعاب 7 مل + يجند وإضافة الكوكايين. يتم إضافة الكوكايين للحصول على قياس خلفية لامتصاص دا غير محددة للطرح من البيانات، وترك استيعاب DAT محددة فقط (حيث هي إعاقة سيرة وصافي من ديسيبراميني كما هو موضح أعلاه). وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام مثبط دات قوية للغاية ومحددة روسيدسكي-12935، بدلاً من ذلك-
هام: إبقاء كل شيء على الجليد من الآن فصاعدا .
- سينابتوسومال إعداد
- التضحية ماوس واحدة في وقت واحد بالتفسخ عنق الرحم وقطع الرأس.
- قطع الجلد باستخدام مقص لتكشف عن الجمجمة وقطع أي مؤخرة الأنسجة الزائدة من يسار الجمجمة من قطع الرأس. قطع الجمجمة مع مقص مستقيمة صغيرة على طول ساجيتاليس سوتورا تنتهي إلى الأسفل قدر الإمكان.
- وضع نصائح مقص اثنين في كل عين من الماوس وقطع طريق الجمجمة لإزالة ما تبقى من الجمجمة والدماغ سليمة. سرعة إزالة الدماغ ووضعه في برنامج تلفزيوني المثلج. هذا وسوف تبقى من البرد، بينما الثاني هو تشريح الدماغ.
- استخدام مصفوفة الدماغ، تشريح شريحة الاكليلية 3 مم من المخطط (الأمامي الخلفي: +1.5 مم-1.50 مم) متبوعاً بالتشريح الدقيقة مع تثقيب. انظر الشكل 1 لمنطقة لكمه.
- الحفاظ على الأنسجة على الجليد في جميع الأوقات المضي قدما-
- نقل الأنسجة إلى أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي 1.5 مل لوزنها.
ملاحظة: سيتم استخدام هذا الوزن في خطوة 1.2.14- - كرر الخطوة 1.2.1-1.2.6 للدماغ الثاني.
- مرة واحدة وقد تم الحصول على الوزن لكل العقول، نقل الأنسجة لزجاج تجانس الذي يحتوي على 1 مل من المخزن المؤقت لتجانس المثلج.
- مجانسة الأنسجة باستخدام مدقة مدفوعة موتور 800 لفة في الدقيقة، السكتات الدماغية حتى 10-
ملاحظة: ضربة واحدة يساوي واحد إلى أعلى وأسفل العمل، ينبغي أن تكون السكتة الدماغية الأولى حوالي 5 ق، ما يلي 3-4 س. التجانس في المتوسط متساوي التوتر مهم لمنع انفجار سينابتوسوميس 6. استخدام القوة المناسبة والمتوسطة متساوي التوتر سيسمح المحطات بريسينابتيك لإعادة ختم أرفق السيتوبلازم وحويصلات متشابك، الميتوكوندريا وسيتوسكيليتون 15- - نقل هوموجيناتي إلى 1.5 مل أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي وتجميع هوموجيناتي المتبقية من الزجاج التجانس قبل الشطف مع المخزن المؤقت لتجانس إضافية 0.5 مل.
- تبقى العينة على الجليد بينما هو تجانس الأنسجة من الدماغ الأخرى. تشغيل العقول اثنين في نفس الوقت في الخطوات 1.2.12-1.2.13.
- بيليه الأنوية وخلية الحطام بالطرد المركزي (1,000 x ز، 10 دقيقة، 4 درجة مئوية)-
- نقل المادة طافية (S1) (التي تحتوي على أغشية الخلية، والسيتوبلازم) إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب جديدة والطرد المركزي في س 16,000 ز لمدة 20 دقيقة في 4 ° C.
- تجاهل المادة طافية (التي تحتوي على السيتوبلازم) وريسوسبيند بيليه (P2) (التي تحتوي على سينابتوسوميس النفط الخام) في المخزن المؤقت لتجانس ميكروليتر 40/mg الأنسجة (استناداً إلى الوزن التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.2.6). ريسوسبيند الكسر سينابتوسومال النفط الخام مع ماصة p1000 لطف كما سيتم قطع الكثير من القوة في سينابتوسوميس-
ملاحظة: من المهم في نهاية المطاف مع ميكروليتر 280 على الأقل. إذا لم يكن الأمر كذلك، تمييع مع أكثر من 40 ميكروليتر كل مغ سيكون ضروريا. 1.2.1-1.2.13 خطوات يجب أن يتم في أسرع وقت ممكن، وكل شيء يجب أن تبقى على الجليد. بمجرد قد تم حراكه سينابتوسوميس الخام في المخزن المؤقت للتجانس فمستقرة إلى حد ما طالما يتم الاحتفاظ بها على الجليد 6 ، ، من 15 16-
2. تجربة امتصاص
المخزن المؤقت لامتصاص- ميكروليتر إضافة 440 + يجند الكوكايين للأنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل 12 المعينة والعازلة امتصاص ميكروليتر 440 + يجند إلى 36 المتبقية 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب (انظر الجدول 1 للتخطيط)-
ملاحظة: إزالتها من الجليد 15 دقيقة قبل البدء التجربة إلى تقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة، ولكن تبقى على الجليد حتى ثم للحفاظ على مثبطات. - تحضير منحنى التشبع (الدوبامين (2، 5، 6-[3H]-DA) (3-ح الدوبامين) (91.1 Ci/ملمول) بتركيزات مختلفة النهائي (0.031 0.0625، 0.125، 0.25، 0.5 و 1.0 ميكرومتر)).
- تسمية ستة أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل 10 و 5، 2.5، 1.25، 0.62 و 0.31-
- المخزن المؤقت لامتصاص ميكروليتر إضافة 750 + يجند للأنابيب ميكروسينتريفوجي 5 مع عدد أدنى.
- المخزن المؤقت لامتصاص ميكروليتر 1,455.4 إضافة + يجند، 14.6 الدوبامين ميكروليتر (1 ملم)، ميكروليتر 30 3-ح الدوبامين (11 ميكرومتر) إلى الأنبوب المسمى 10-
- نقل 750 ميكروليتر من الأنبوب المسمى 10 إلى الأنبوب المسمى 5. مزيج جيد ونقل 750 ميكروليتر من هذا الأنبوب إلى الأنبوب 2.5. كرر هذا التخفيف مع أنابيب المتبقية.
- قبل شطف مرشحات ستوكات الزجاج مع المخزن المؤقت لامتصاص 4 مل بعد وضعها في دلو تصفية جيدا 12- أنابيب
- ميكروليتر 10 إضافة تعليق غشاء سينابتوسومال إلى 24 الأولى 1.5 مل مايكرو--أجهزة الطرد المركزي (انظر الجدول 1 للتخطيط) التي تحتوي على 440 ميكروليتر العازلة. الدوامة بعناية وتدور أسفل قريبا لضمان أن سينابتوسوميس مغمورة في المخزن المؤقت. ترك في 37 س ج للحد الأدنى 10
ملاحظة: من المهم على وجه الدقة في أوقات خلال التجربة الإقبال مقارنة منصفة بين العقول. استخدام ساعة توقيت للدقة.
الدوبامين - إضافة 50 ميكروليتر من تركيز 10 و 5 ميكرومترات (القسم 2-2) في أول عمودين وإجازة في 37 س ج لمدة 5 دقائق مع الهز. بعد 5 دقائق بالضبط، وقف رد الفعل بإضافة 1 مل امتصاص المثلج المخزن المؤقت. تفعل الشيء نفسه مع تركيز 2.5 و 1.25 ميكرومتر (القسم 2-2)، ومن ثم مع تركيز 0.62 و 0.31 ميكرومترات. إضافة العينات للمرشحات ستوكات قبل مشطوف
- وتغسل مع المخزن المؤقت لامتصاص المثلج مل 5 × 4. عندما تم إضافة العينات 12 أولاً إلى عوامل التصفية، وتحريك عوامل التصفية لأنابيب التﻷلؤ. كرر هذه العملية مع العينات التالية 12-
- كرر الخطوة 2.4-2.6 للدماغ المقبل.
- عد ماكس 3 إعداد أنابيب بوضع عامل تصفية ستوكات في الجزء السفلي من الأنابيب التﻷلؤ 49-51 وإضافة 25 ميليلتر من تركيز الدوبامين كحد أقصى في الأعلى (10 ميكرومترات).
- ترك جميع الأنابيب التﻷلؤ 51 في غطاء دخان حاء – 1
- أضف 3 مل التﻷلؤ السائل إلى كل أنبوب التﻷلؤ وهزه قوية في شاكر حاء – 1
- العد [ح] 3 [--دا في عداد بيتا للحد الأدنى 1
- افتح البرنامج واختر: التسمية: H-3، لوحة/تصفية: قنينة مل 4، 4 من 6، نوع الفحص: عادي وحساب الوقت: 1 كحد أدنى
ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن يؤديها في اليوم التالي إذا كان أكثر ملاءمة. ترك عينات مغطاة بالقصدير إحباط طوال الليل-
- افتح البرنامج واختر: التسمية: H-3، لوحة/تصفية: قنينة مل 4، 4 من 6، نوع الفحص: عادي وحساب الوقت: 1 كحد أدنى
- تحديد البروتين
- استخدام أدوات "مقايسة البروتين اتفاق التعاون الأساسي" قياسية لتحديد تركيزات البروتين سينابتوسوميس لتعديلات من التهم الموجهة إليه في الدقيقة (cpm) ميكروغرام/فمول/دقيقة ومقارنة سليمة لامتصاص بين العينات.
3. تحليل بيانات
- استخدام البيانات من الاستيعاب التجربة جعل تشبع منحنى لكل مجموعة، وحساب معدل رد الفعل (V max) وثابت ميكايليس مينتين (ك م)-
ملاحظة: القيمة ك م يعكس تركيز الركيزة اللازمة للوصول إلى نصف الخامس كحد أقصى. وبناء على ذلك، الخامس ماكس مباشرة يعكس وظيفة DAT (القدرة على امتصاص الحد الأقصى)، الذي يعتمد على عدد دات على السطح وكيف يمكن التضمين نشاطها بتعديلات بوسترانسلاشونال و/أو البروتينات المتفاعلة وكذلك على التعديلات في التدرجات أيون. القيمة ك م تدبير غير مباشر لتقارب الركيزة للناقل أن الأهم من ذلك أيضا يمكن أن يكون عن طريق التعديلات بوسترانسلاشونال و/أو البروتينات المتفاعلة التضمين. إجراء تقييم كامل للتغييرات الوظيفية المهم وبالتالي لتحديد مستويات التعبير السطحي مباشرة بها على سبيل المثال مقايسة بيوتينيليشن سطحية. وقد استعرضت وصفاً لامتصاص الدوبامين، ووضع على معنى القيم ماكس ك م والخامس شميتز et al. 17-
4. كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (أسلوب 2)
- تشريح المخ
- أنابيب ميكروسينتريفوجي التسمية ووزنها؛ وواحدة في المنطقة الواحدة والماوس. التضحية
- ماوس واحدة في وقت واحد بالتفسخ عنق الرحم وقطع الرأس. سرعة إزالة الدماغ كما هو موضح في القسم 1-2. كذلك إجراء تشريح فورا.
- باستخدام مصفوفة الدماغ، تشريح شريحة الاكليلية 3 مم من المخطط تليها الدقيقة الثنائية تشريح بريدًا ودستر مع تثقيب. انظر الشكل 3 لناحية لكمه. نقل الأنسجة إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب
- ووضع بسرعة على الثلج الجاف. وزن الأنسجة ووضعه مرة أخرى على الجليد الجاف فورا.
ملاحظة: وزن الأنسجة مهم لحساب تركيز لاحقاً.
4.1.1-4.1.4 - تكرار الخطوات مع الماوس المقبل.
ملاحظة: وضع الأنسجة في 80 س ج حتى مزيد من المعالجة أو تشرع فورا في معالجة الأنسجة.
5. إعداد الأنسجة
- بدوره على أجهزة الطرد المركزي للسماح لها لتبرد قبل إلى 4 درجة مئوية
- تعد الحل التجانس (بيرتشلوريك N 0.1 حمض (هكلو 4))، والحفاظ على مدت
- استخدام تجانس الحل، إعداد معيار طازجة 0.1 pmol/ميكروليتر دوبامين من حل أسهم 1 مم (إضعاف 10,000 x)-
ملاحظة: تعد الحل الأسهم تذويب الدوبامين في المخزن المؤقت للتجانس إلى تركز أسهم 1 ملم، والتي يمكن أن تبقى في 20 درجة مئوية لمدة شهر تقريبا. إذا كانت مناطق أخرى من الدماغ للفائدة، وسيكون تركيز المعيار إلى تعديل، منذ مناطق الدماغ الأخرى بما في ذلك قشرة بريفرونترال، الحصين والرمادية في الدماغ ومنطقة تيجمينتال البطني تمتلك دا يصل إلى 100 مرة أقل مقارنة بالمخطط-
إضافة 500 ميكروليتر التجانس الحل لكل عينة (أي سي بريدًا ودستر الأنسجة؛ الفرع 4-1) - وتجانسه العينات باستخدام الترا-الخالطون على السرعة الكاملة لإبقاء حوالي 30 س. العينة في الماء المثلج أثناء التجانس. بين كل عينة، الخالطون الترا مع المياه النظيفة (كامل السرعة لمدة 30 ثانية)-
- الطرد المركزي في نماذج لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية، 14,000 غ. س
- نقل ما يقرب من 200 ميكروليتر عينة إلى عامل تصفية ميكرومترات زجاج 0.22 (قطرها 1 سم) باستخدام المحاقن بلاستيكية 1 مل.
ملاحظة: استخدام المرشحات الزجاج غير هامة، طالما عوامل التصفية اختار 0.22 ميكرومتر لإزالة المواد المرتفعة الوزن الجزيئي. - تحليل العينات بكشف الكهروكيميائية (EC)-[هبلك] منهجية 18 كما هو موضح في القسم 6-
6. تحليل كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء
حل- تحضير التالية لمرحلة الجوال: خلات الصوديوم 55 مم، حمض أوكتانيسولفونيك 1 مم، غ 2 يدتا 0.1 ملم، الاسيتو الانيتريل 8%، حمض الخليك 0.1 M، درجة الحموضة = 3.2.
ملاحظة: ضبط الأس الهيدروجيني مع حمض الخليك 0.1 متر. من المهم أن يكون دقيقا مع درجة الحموضة. وينبغي أن يكون الحل ديجاسي(د) التي ديجاسير على الخط (جزءا لا يتجزأ من النظام [هبلك]). جعل L 2 المرحلة المتنقلة وتغييره عن مرة واحدة في شهر (تغييره عندما يحصل على الضجيج ملحوظ). بسبب التقلبات ويستغرق حوالي 24 ساعة لضبط بعد تغيير المرحلة المتنقلة- - إنشاء كاشف:
- مجموعة فولت الإخراج إلى 700 mV ودرجه حرارة 32 درجة مئوية في الفرن الكاشف؛ وهذا أمر مهم جداً. جعل برنامج نطاق باستخدام دليل على الإنترنت. راجع الدليل لمزيد من التفاصيل). إضافة البرنامج الوقت وفقا الجدول 2-
ملاحظة: في هذه الدراسة، تم تعيين البرنامج تغيير الحالي في الاحتفاظ بتعيين الأوقات، للحفاظ [هبلك] الحالية الأمثل وللحفاظ على قمم chromatogram كتوسيع نطاق ممكن، ولكن لا يزال داخل طريقة العرض تلقائياً. هذا وقد تم تحسين ل striatal الدماغ ليساتيس من الفئران.
- مجموعة فولت الإخراج إلى 700 mV ودرجه حرارة 32 درجة مئوية في الفرن الكاشف؛ وهذا أمر مهم جداً. جعل برنامج نطاق باستخدام دليل على الإنترنت. راجع الدليل لمزيد من التفاصيل). إضافة البرنامج الوقت وفقا الجدول 2-
- عندما تم إضافة البرنامج إلى الجهاز، جعل منحنى معايرة نقطة 3، وثلاث مرات بالحقن القياسية (5 و 10 و 15 ميكروليتر)-
ملاحظة: المعيار (10 ميكروليتر (ميكروليتر 10 × 0.1 pmol/ميكروليتر = 1 بمول دا)) ينبغي أن يكون حقن كل عينة العاشرة، والعينات معايرة مستوى أقرب. غرامة ضبط النظام السابق اليوم بتعديل المعيار 3-نقطة، والتحقق إذا كان يخرج chromatogram ضمن النطاق المتوقع. إذا كان من الملاحظ ضوضاء كبيرة، تغيير المرحلة المتنقلة. إذا ذروة أعلى من 990 أم ثم إعادة حقن العينة في حجم أقل، أو جعل برنامج مجموعة جديدة ومنحني قياسي جديد. يتم قياس حدود الكشف عن 3 مرات قيمة الضوضاء في المتوسط إلى أقل قيمة الذروة لحقن لكل معيار (NA، دوباك، دا، 5-حياة، هبا، 3-طن و 5-HT).- نظام الإنشاء بفتح الحل LC وتفعيل التحليل 1؛ وهذا يبدأ في وضع الاتصال. اكتب معرف المستخدم وكلمة المرور، ثم انقر فوق موافق. انتظر الحل LC للاتصال للصكوك. انتقل إلى جدول الدفعات وملء البيانات والمعلومات (مثلاً، نوع العينة: غير معروف للأمراض المنقولة جنسياً وعينات لنوع التحليل القياسي،: "أنه كيو تي"، حجم inj: 10، ISTD التونسيين: يخدع المستوى 1). احفظ الملف (الذهاب إلى ملف--> حفظ الملف الدفعي ك-> حفظ)-
- جعل النظام يقوم بحقن العينة الأولى بالضغط على ' "بدء الدفعية" '. هذا سيؤدي إلى ضخ 10 ميكروليتر عينة من أوتوسامبلير مع وحدة نمطية لإيصال المذيبات.
ملاحظة: استخدم معدل تدفق مضخة 0.15 مل/دقيقة وعمود C18 بعكس المرحلة. واستخدمت هنا كشف أمبيروميتريك لكشف الكهروكيميائية. يجب تعيين مسرى الكربون زجاجي إلى 0.8 الخامس مع قطب مرجعي Ag/AgCl. من أجل الاعتداء الدوبامين، استخدم 3 اللوني μ C18 (3) المواد المستنفدة للأوزون (دا 2 مم × 100 مم، الجسيمات حجم 3 ميكرومتر) تحقيق الفصل الكروماتوغرافي. - استخراج مجالات ذروة مسجل ومحسوب.
- الذهاب للحصول على البيانات لمتابعة في chromatogram عند الانتهاء من العينات. انتقل إلى وظيفة تشغيل تحليل-Lc > اختيار اسم الملف (سيتم فتح chromatogram)-> انقر فوق عرض. شريط التكامل اليدوي، إضافة كافة قمم تكون متكاملة-> انتقل إلى تقرير البيانات وطباعتها في القراءة-
ملاحظة: هنا استخدمت البرمجيات الحل LC لمراقبة النظام وتحليل البيانات-
- الذهاب للحصول على البيانات لمتابعة في chromatogram عند الانتهاء من العينات. انتقل إلى وظيفة تشغيل تحليل-Lc > اختيار اسم الملف (سيتم فتح chromatogram)-> انقر فوق عرض. شريط التكامل اليدوي، إضافة كافة قمم تكون متكاملة-> انتقل إلى تقرير البيانات وطباعتها في القراءة-
- من المناطق الذروة، حساب تركيز الدوبامين في عينة، على النحو التالي باستخدام تركيز القياسية المعروفة:
- استخدام منطقة الذروة المعيار (يساوي 1 pmol) للحصول على عامل ألف
- استخدام عامل للحصول على تركيز العينات.
تركيز العينة (في بمول الواحدة 10 ميكروليتر) = معامل A × ذروة مجال العينة - باستخدام هذه الصيغة للحصول على تركيز العينة في الحرس الوطني-
عينة تركيز pmol/10 ميليلتر ميليلتر x 500 x MW الدوبامين = تركيز العينة في الحرس الوطني
عينة تركيز (بالحرس الوطني) = تركيز العينة (في بمول الواحدة 10 ميكروليتر) × 500 ميكروليتر x MW الدوبامين - استخدام تركيز العينة في الحرس الوطني للحصول على تي أنه نموذج التركيز في أنسجة جزء من الغرام/غرام (عينة تركز في جزء من الغرام/ز الأنسجة = الأنسجة pg/g).
- استخدام منطقة الذروة المعيار (يساوي 1 pmol) للحصول على عامل ألف
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويشمل البروتوكول امتصاص دا الحالية (الشكل 1) جميع الخطوات اللازمة لتقييم الأداء الوظيفي لدات في سينابتوسوميس من الفئران. لدينا بيانات تمثيلية لأسلوب امتصاص دا (الشكل 2) يصور منحنى تشبع مع البيانات غير المعدلة (الشكل 2B) وتعديل البيانات (الشكل 2A). ويبين منحنى التشبع الإقبال من الفئران البرية نوع. عادة ما تكون واحدة سيجعل الإقبال دا للمقارنة مع ماوس متحولة، مما سيؤدي إلى منحنى تشبع لكل الوراثي5. وفي هذه الحالة، يمكن تفسير الاختلافات بين نوع البرية والفئران المسخ في 2 ألف و 2 باء بعوامل متعددة. دقيق أكثر المجرب في أعقاب كل خطوة من البروتوكول، والفرق أقل سيكون هناك بين تصور الخام (2B) وبيانات البروتين المعدلة (2 أ). The most أسباب واضحة للاختلافات ط) وزنها من الأنسجة في خطوة 1.2.6، ثانيا) فقدان الأنسجة أثناء نقل من الزجاج التجانس في الخطوة 1.2.8-1.2.10 ودقيق وثالثاً) عدم الدقة أثناء نقل المادة طافية في خطوة 1.2.13 و إزالة المادة طافية في خطوة 1.2.14. نوصي بإجراء تجربة أولية في الفئران البرية نوع للدقة أفضل.
الدوبامين EC-[هبلك] أسلوب (الشكل 3) يشمل جميع الخطوات اللازمة لتقويم المبلغ دا في دستر وبريدا للفئران. لدينا بيانات تمثيلية (الشكل 4 و الجدول 3) تصور نتائج تجربة أجريت على الفئران نوع البرية.
رقم 1: تجربة سير العمل التخطيطي تصور الخطوات المختلفة في امتصاص دا سينابتوسومال البروتوكول. هو التضحية بالماوس بعنق الرحم التفكك متبوعاً بتشريح الدماغ ووضعها في مصفوفة الدماغ. يتم تشريح شريحة 3 مم الاكليلية سميكة من الدماغ، وتشريح غرامة يؤديها لكمه ثنائية من منطقة صغيرة تحت كالوسوم الإحضار فورا. هو تجانس المخطط الظهرية في المخزن المؤقت لتجانس 1 مل من اضطراب ميكانيكي متبوعاً بالطرد المركزي 10 دقيقة على سرعة منخفضة. المادة طافية نقله إلى أنبوب نظيفة وفصل في سرعة عالية لمدة 20 دقيقة. بيليه، التي تحتوي على سينابتوسوميس، حراكه وجاهزة لاستيعاب التجربة. يتم امتصاص عن طريق إضافة تريبليكاتيس مختلفة [3ح]-تركيزات دا، بدءاً من تركيز نهائي ل 0.031 إلى 1 ميكرومتر. وبالإضافة إلى ذلك، تتم إضافة تركيزات متفاوتة دا تريتياتيد لنموذج تحكم التي تحتوي على 500 ميكرومتر الكوكايين. العينات التي يتم حسابها في عداد بيتا وأخيراً، وهو إجراء تحليل البيانات الكشف عن منحنى التشبع دات الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الممثل ناتجة عن تجربة امتصاص دا سينابتوسومال من الفئران البرية نوع C57Bl/6 أربعة من سلالة ماوس Drd1a-cre. (أ) بيانات تمثيلية تصور منحنى التشبع لامتصاص دا عن طريق DAT الاستعدادات سينابتوسومال من الفئران البرية نوع (n = 4). النقاط السوداء هي القيم للفئران الأربعة تظهر بشكل منفصل، المنحنى الأخضر يبين كيف عادة يصور البيانات عن طريق الجمع بين البيانات من الفئران 4-6 كل مجموعة. هذا الرسم البياني يجمع البيانات من الفئران الأربعة. (ب) تشبع الرسم البياني للبيانات الخام، دون تعديل لتركيز البروتين الفعلية للعينات. أساسا، هو النسخة غير المعدلة للبيانات الواردة في (أ) (ج) عنصر تحكم البيانات. يوضح هذا الرسم البياني التهم من العينات التي تحتوي على الكوكايين، التي تستخدم لطرح الخلفية من استيعاب البيانات. عنصر التحكم هذا ضروري لتحديد موثوقية البيانات الامتصاص، ولكن نادراً ما يظهر في المقالات. إذا لا تظهر هذه البيانات لسبب الخطي، يشير إلى قضية بالغة الأهمية مع الإعداد، التي يلزم تحديدها وحلها للاستدلال على أي شيء من البيانات. R للتربيع: n1 = 0.9852، n2 = 0.9584، n3 = 0.9606، n4 = 0.9913. (د) الرسم البياني يظهر قدرة امتصاص دات (VMAX). VMAX = ± 3.2 43.13 فمول/min/ميكروغرام البروتين). وترد بيانات كمتوسط ± sem. (ﻫ) الرسم البياني عرض كم لدات إلى 0.1 ميكرو ± 0.03 المقابلة جيدا للأسلوب فولتاميتري القرص الدورية التي تصور القيم كم من دات 0.6 ميكرومتر19. قيمة KM 0.1 ميكرو يقابل أيضا جيدا لقيم كم 0.22 ميكرومتر التي تم الحصول عليها من نماذج التحفيز لحفز تجاوز دا في المخطط20،21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: سير العمل التخطيطي تصور الخطوات المختلفة في البروتوكول كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء- هو التضحية بالماوس بعنق الرحم التفكك متبوعاً بتشريح الدماغ ووضعها في مصفوفة الدماغ. يتم تشريح شريحة 3 مم الاكليلية سميكة من الدماغ، ويتم إجراء تشريح غرامة باللكم على الصعيد الثنائي مجالين أصغر، تقسيم المخطط دستر وائتلاف البرنامج الجديد. هو تجانس الأنسجة، متبوعاً بالطرد المركزي بسرعة. يتم تشغيل معيار مع تركيزات دا المعروفة فضلا عن سوبيرناتانتس من العينات في [هبلك]، إنتاج تشروماتوجرامس. مجالات قمم مختلفة تستخدم لحساب تركيز دا في العينات التي صورت في الرسم بياني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الممثل نتائج تجربة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء- تشروماتوجرام (A) [هبلك] 10 ميكروليتر عينة من دستر حقن إلى C18 عمود (2 مم × 100 مم) المستخدمة للجزيئات الصغيرة. مرات الاحتفاظ بها؛ 3.7 دقيقة نورادرينالين (NA)، 6.7 دقيقة لحمض ديهيدروكسيفينيلاسيتيك (دوباك)، 8.3 دقيقة دا، مين 10.7 لحمض 5-هيدروكسييندوليسيتيك (حياة) ودقيقة 18.8 ل 3-ميثوكسيتياميني (3-MT) ودقيقة 15.3 لحمض هوموفانيليك (هبا) 20.8 دقيقة ل 5-هيدروكستريبتاميني (5-HT). يتم حساب القيم فقط لقمم دا في هذه الدراسة. (ب) الرسم البياني يظهر تركيز دا في ائتلاف البرنامج الجديد ودستر استناداً إلى تشروماتروجرام. [هبلك] تحليل المجالات سترياتال بما في ذلك دستر والفئران NAc C57BL/6 (n = 7). وترد البيانات كمتوسط± Sem. 
يشير إلى تغيير في المقاومة، وقد أضيفت إلى chromatogram يدوياً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 + مدونة قواعد السلوك | مدونة قواعد السلوك 5 + | 2.5 + مدونة قواعد السلوك | 1.25 + مدونة قواعد السلوك | 0.62 + مدونة قواعد السلوك | 0.31 + مدونة قواعد السلوك |
الجدول 1: تخطيط أنبوب ميكروسينتريفوجي لإعداد سينابتوسومال.
| الوقت | النطاق | عامل التصفية | صمام | السيارات صفر | الإزاحة | خلية ه |
| 0 | 1nA | 0.5 هرتز | تحميل | لا | 30% | 0.7 V |
| 0.2 | 1nA | 0.5 هرتز | تحميل | تعيين | 30% | 0.7 V |
| 5 | 500pA | 0.5 هرتز | تحميل | لا | 30% | 0.7 V |
| 5.2 | 500pA | 0.5 هرتز | تحميل | تعيين | 30% | 0.7 V |
| 9.4 | 200pA | 0.5 هرتز | تحميل | لا | 30% | 0.7 V |
| 9.6 | 200pA | 0.5 هرتز | تحميل | تعيين | 30% | 0.7 V |
| 12 | 100pA | 0.5 هرتز | تحميل | لا | 30% | 0.7 V |
| 12.2 | 100pA | 0.5 هرتز | تحميل | تعيين | 30% | 0.7 V |
| 16.2 | 50pA | 0.5 هرتز | تحميل | لا | 30% | 0.7 V |
| 16.4 | 50pA | 0.5 هرتز | تحميل | تعيين | 30% | 0.7 V |
| نهاية الوقت 25 دقيقة | ||||||
الجدول 2: [هبلك] وقت البرنامج المستخدم في هذه الدراسة.
| # الذروة | الوقت متقاعد | المنطقة | الارتفاع | المنطقة % | % الارتفاع |
| 1 | 3,745 | 230451 | 18500 | 0.299 | 0.626 |
| 2 | 6,691 | 5573485 | 382143 | 7,228 | 12,922 |
| 3 | 8,336 | 13209342 | 510378 | 17,131 | 17,258 |
| 4 | 10,760 | 16443198 | 831182 | 21,325 | 28,106 |
| 5 | 15,344 | 7129795 | 282473 | 9,247 | 9,552 |
| 6 | 18,830 | 11279424 | 346248 | 14,628 | 11,708 |
| 7 | 20,846 | 23241754 | 586419 | 30,142 | 19,829 |
| المجموع | 77107450 | 2957344 | 100,000 | 100,000 |
الجدول 3: تحليل ذروة عرض المنطقة وارتفاع قمم المختلفة المستخدمة لحساب التركيزات التي تظهر في الشكل 4B .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذه المخطوطة البروتوكولات التجريبية مفيدة لتحديد التوازن دا في أي نموذج الماوس للاختيار. نحن توفير بروتوكولات مفصلة لقياس مستويات دا في أنسجة المخ من الفئران باستخدام [هبلك]، وامتصاص دا سينابتوسومال لتقييم النقل دا الوظيفية عن طريق دات. وسيتم وضع الإجراءات والبروتوكولات وحدود للتجربة [هبلك] ومقايسة الامتصاص دا سينابتوسومال أدناه.
البروتوكول امتصاص سينابتوسومال يمكن أن توفر نظرة متعمقة مفيدة لوظيفة dat. المجمعة مع تجربة بيوتينيليشن سطحية13، يمكن الحصول على المعرفة بشأن المبلغ الإجمالي، مستوى السطح، والأداء الوظيفي لدات. نظراً للدور الرئيسي دات وتأثيره على انتقال دا ومشاركتها في مختلف الأمراض، لقد كان هدفا رئيسيا إنشاء الاختبارات التي يمكن نموذج دالة دات. واحدة من مزايا التجربة امتصاص دا سينابتوسومال أنها يمكن أن تكون الوظيفة المؤداة في فيفو التلاعب كما هو الحال عند التلاعب تشيموجينيتيك تماما كما تختلف في فيفو علاجات العقاقير أو السلوكية في التدريب بالإضافة إلى التحقيقات في الفئران المعدلة وراثيا. العلاج من تعاطي المخدرات يمكن أن يؤديها بعد إعداد سينابتوسومال، بدلاً من في فيفو إذا فضلت، مما يجعل من الممكن لاختبار أثر المخدرات على دات مباشرة22.
بدائل لأداء سينابتوسومال دا الإقبال، هو القيام بتجارب الإقبال على الثقافات الخلية transfected دات أو في الثقافات العصبية بطبيعة الحال معربا عن الناقل. خلية ثقافة فحوصات قد يكون المفضل للتحقيقات الأولية في إدخال تعديلات مختلفة على دات23، بينما الثقافات الخلايا العصبية الأولية مع الناقل الذاتية قد تقدم صورة جديرة بثقة أكثر من الناحية الفسيولوجية للناقل الدالة في فيفو. على الرغم من أن الثقافات العصبية تتم مباشرة من الحيوانات، وهناك مزايا استخدام سينابتوسوميس بدلاً من ذلك. وعادة ما تقدم الثقافات الخلايا العصبية من الخلايا العصبية قبل الولادة أو غير ناضجة، التي قد تؤثر على وظيفة والتعبير عن دات، بينما تمثل الاستعدادات سينابتوسومال الاستعدادات الفسيولوجية التي يمكن الحصول عليها من الحيوانات الكبار وحتى القديمة دون الصعوبات6،14.
وهناك العديد من المزايا لاستخدام التجربة امتصاص سينابتوسومال للتحقيق في وظيفة DAT، ولكن القيود هامة يجب أن تؤخذ. سينابتوسوميس محدودة الجدوى6. إبقائها على الجليد أمر ضروري للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها مع وجود اختلافات قليلة. إذا أبقى على الجليد، وتوفير المغذيات اللازمة، سينابتوسوميس المنقي قابلة للتطبيق لمدة ساعة وتناول والإفراج عن العصبية في كفاءة15. فمن الممكن لتجميد سينابتوسوميس، ولكن طريقة تجميد15من أهمية كبيرة. الاختلافات الصغيرة في الإجراء التجريبي يمكن أن تؤدي إلى اختلافات واسعة في النتيجة. ولذلك، ينبغي أن يكون الأمثل البروتوكولات التجريبية في ظروف نوع البرية (مثل نوع البرية الفئران) حتى يتم الحصول على النتائج استنساخه ومن ثم يمكن إجراء مقارنات بعد التلاعبات الجينية أو الدوائية المختلفة. مقايسة الامتصاص دا سينابتوسومال أداة تجريبية سهلة وموثوق بها وصالحة للحصول على البيانات القابلة لإعادة الإنشاء مع تباين منخفض جداً في معلمة أساسية في التوازن دا، دات وظيفة (الشكل 2A). القيود بشدة تفوقها بمزايا تمكنها من إجراء التجربة على النهايات العصبية المحفوظة من الفئران الكبار6.
الأساليب المستخدمة حاليا لتحليل مستويات دا في الأنسجة التي تدعمها histochemical الأساليب المتقدمة في عام 1950. أهمية تطوير أساليب مثل [هبلك] لقياس مستويات دا، كان واضحا منذ اكتشاف انخفاض كبير دا ganglia القاعدية لمرضى باركنسون، وبالتالي تأسيس المبدأ لعلاج المرضى الذين يعانون من باركنسون مع لدوبا24. منذ هذا الاكتشاف، تم تطوير تقنيات أكثر تقدما لتحليل الأنسجة من مستويات دا، ولكن كأي تقنيات أخرى أن هناك عثرات. من المزالق الرئيسية من هذه التقنيات هو الطبيعة غير المستقرة ل monoamines (الدوبامين، نورادرينالين والسيروتونين). قد ناقشت كيفية إعداد بشكل صحيح إعداد الأنسجة لتجنب فقدان monoamines بقدر كبير من التفصيل Atack et al. 25 ولن تناقش مرة أخرى في هذه المادة، باستثناء التشديد على أهمية وضع الأنسجة في الثلج الجاف مباشرة بعد التشريح وعدم إضافة الحل التجانس حتى قبل مباشرة التحليل [هبلك]. ومن تجربتنا، يمكن الاحتفاظ الأنسجة في-80 سج لمدة تصل إلى شهر واحد دون أي تدهور دا إذا تم إضافة أي حل. Atack وآخرون مناقشة إعداد الأنسجة لأساليب تتراوح بين الأسلوب والمطيافيه مخفضات أساليب متقدمة [هبلك] السماح بمهلة كشف وصولاً إلى 3 نانوغرام/مليلتر الأنسجة25. ويستند الأسلوب يصف لنا في هذه الورقة على نفس المبادئ. تمكين التكنولوجيات المتقدمة الحالية أدق التحاليل والكشف عن مستويات دا عند تركيزات فمول. باستخدام تقنية [هبلك] نيون، حتى أقوى مونوأمين تحليل يمكن الحصول على26. نظراً لمتانة الأسلوب، [هبلك] يستخدم على نطاق واسع للحصول على معلومات حول التغييرات في مستويات monoamines والسلائف ونواتج الأيض في مناطق مختلفة في الدماغ، مثل القرود دا في المخطط، للتحقق من صحة نماذج مرض باركنسون في الفئران، و 28،مينيبيجس،من2729. هنا، نحن إجراء التجربة على الأنسجة من دستر وائتلاف البرنامج الجديد، ولكن الأسلوب أيضا مناسبة للمجالات الأخرى معصب دا المخ، مثل قشرة بريفرونترال والحصين، والرمادية في الدماغ ومنطقة تيجمينتال البطني 30. في هذه المجالات، سيكون من الضروري لتحديد مستويات دا السليم عينة قياسية أكثر مخففة. تحليلنا لمحتوى دا تظهر مستويات أعلى في سوبكومبارتمينتس سترياتال مقارنة بالتحقيقات السابقة، ولكن يمكن تفسير ذلك تجريبيا. أولاً، أننا قد تشريح جزأين من المخطط (NAc ودستر) بدلاً من التحقيق في المخطط كله، مما قد يفسر الفرق مقارنة بالتقارير السابقة12،31. وسيكون القياسات striatal مستويات دا أقل مقارنة بالقياسات في دستر الصرفة، نظراً لمستويات في ائتلاف البرنامج الجديد إلى حد كبير أقل مقارنة دستر. ولدينا أيضا الدراسات السابقة تؤكد لنا مستويات دا5.
كل مقايسة لها حدودها. يتم تطوير فحوصات في محاولة للنموذج وتقديم معلومات عن جوانب محددة من عملية الخلوية، وأنهم قد ترك التفاصيل الهامة الممكنة أو تقديم صورة عامة جداً لعملية العالم الحقيقي. قيداً هاما في الاعتبار عند اختيار [هبلك]، أنها لا تقدم سوى لمحة سريعة عن مستويات الناقل العصبي. ومع ذلك، مستويات الناقل العصبي المعرضة تتقلب أكثر اليوم أو الأسبوع أو الشهر32،33، الذي يشدد على ضرورة الحصول على عينات في إطار زمني ضيق، بدلاً من مقارنة عينات أخذت ساعات، أيام أو شهور وبصرف النظر على الرغم من أنها اتخذت في نفس الساعة. ومع ذلك، يمكن تقديم معلومات مفيدة بشأن محتوى دا البيانات [هبلك] وتكشف عن مستويات غيرت الشاذة مثل تلك أظهرت دات-كو والماوس المعدلة وراثيا دينار كويتي دات خطوط، حيث حذف الوراثية أو تدق لأسفل من دات يؤثر إلى حد كبير التوازن دا مقاومة امتصاص دا. هذه البيانات فورثيرموري تثبت أن striatal دا تجمعات تتألف أساسا دا المنحاة بدلاً من تصنيعه نوفو دي دا وأن التجديد من برك دا سترياتال داخل الخلايا اعتماداً كبيرا على12،عملية امتصاص34. شرك مهمة واحدة للنظر أن تشريح الأنسجة قد تحد من وصف المحتوى دا في منطقة الدماغ أكثر تحديداً ودقة في أي وقت من الأوقات. التباين في تركيز دا في مناطق مختلفة من الدماغ تختلف إلى حد كبير. ولذلك، دقة تشريح أهمية كبيرة، ويمكن تحسينه بتشريح مناطق أصغر التأكد فقط من الأنسجة من مجال الاهتمام من تضمين.
تدبير أكثر وظيفية من حمامات دا الذاتية يمكن تحليلها باستخدام ميكرودياليسيس. هذا وقد وضعت وبادرت أونجيرستيدت et al. استخدام المسبار الرأسي ميكرودياليسيس35. تقنية ميكرودياليسيس يجعل من الممكن لقياس تركيزات مونوأمين في الدماغ من الانتقال بحرية الحيوانات وهياكل الدماغ المختلفة. ميزة أخرى لهذه التقنية ميكرودياليسيس على عينات الأنسجة من خلال [هبلك] هو الخيار لقياس ومتابعة التغييرات مونوأمين عبر نافذة كبيرة من الوقت. هذا هو ميزة كبيرة مقارنة بأخذ عينات أنسجة المخ حيث من الممكن للحيوان كما هو الحال في البروتوكول [هبلك] الواحد نقطة مرة واحدة فقط. بينما، ميكرودياليسيس يمكن أن توفر نظرة ثاقبة إلى الإفراج عن دا، عينات الأنسجة التي تليها [هبلك] بدلاً من ذلك سوف تكشف عن تغييرات في برك الذاتية وحويصليه da. للحصول على معلومات في الوقت الحقيقي على حركية الإصدار دا في مختلف مناطق الدماغ، وأساليب مثل المسح السريع فولتاميتري دوري36،37 أو38 من تشرونوامبيروميتري عالية السرعة يمكن أن تنفذ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمه التميز برنامج عام 2016 أوكف (عنوان، أ. ر.، K.J.)، ومؤسسة Lundbeck (محمد) مركز مؤسسة Lundbeck بيوميمبرانيس في "لطب النانوي" (عنوان)، الوطني معهد للصحة منح P01 DA 12408 (عنوان)، الدانمرك مجلس للبحوث المستقلة-العلوم الطبية (عنوان).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
References
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
- Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
- Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
- Hornykiewicz, O.
- Schultz, W.
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
- Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
- Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Whittaker, V. P.
- Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D.
- Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
- Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
- Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
- Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
- Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
- Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
- Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
- Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
- Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
- Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
- Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
- Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
- Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
- Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
- Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
- Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
- Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).
