Summary
Assorbimento della dopamina sinaptosomiali e strumenti sperimentali rappresentano di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni per indagare l'omeostasi della dopamina nei topi valutando la funzione del trasportatore della dopamina e livelli della dopamina in tessuto striatal, rispettivamente. Qui presentiamo i protocolli per misurare il contenuto di tessuto di dopamina e di valutare la funzionalità del trasportatore della dopamina.
Abstract
Dopamina (DA) è un neurotrasmettitore modulatory controllo attività motoria, i processi di ricompensa e funzione conoscitiva. Danno della neurotrasmissione dopaminergica (DAergic) è fortemente associato con diverse malattie del sistema nervoso centrale-collegata come morbo di Parkinson, disordine di iperattività di deficit di attenzione e farmaco dipendenza1,2 ,3,4. Delineare meccanismi di malattie riguardanti lo squilibrio DA è dipende criticamente su modelli animali di imitare gli aspetti delle malattie, e quindi sono importanti per fornire nuove conoscenze e terapeutiche possibili protocolli che valutano le parti specifiche di omeostasi DA obiettivi per queste malattie.
Qui, vi presentiamo due protocolli sperimentali utili che quando combinati forniscono una lettura funzionale del sistema DAergica in topi. I parametri biochimici e funzionali su DA omeostasi sono ottenuti attraverso la valutazione dei livelli di DA e della dopamina (DAT) trasportatore funzionalità5. Quando si esamina il sistema DA, la capacità di misurare in modo affidabile i livelli endogeni di DA del cervello adulto è essenziale. Pertanto, vi presentiamo come eseguire cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) sul tessuto cerebrale dai topi per determinare i livelli di DA. Eseguiamo l'esperimento sul tessuto da striato dorsale (dStr) e nucleo accumbens (NAc), ma il metodo è adatto per altre aree cerebrali innervati DA anche.
DAT è essenziale per la ricaptazione della DA nel terminale presinaptico, controllando così l'attività temporale e spaziale di DA. rilasciato Nel valutare l'omeostasi DA conoscere i livelli e funzionalità di DAT nello striato è di grande importanza. Qui, forniamo un protocollo che consente contemporaneamente dedurre informazioni sui livelli di superficie e funzione usando un'analisi di assorbimento sinaptosomiale6 DA.
Attuali metodi combinati con protocolli standard immunoblotting forniscono il ricercatore con opportuni strumenti per caratterizzare il sistema DAergica.
Introduction
Dopamina (DA) è un neurotrasmettitore modulatory critico per il comportamento del motore, la ricompensa e la funzione conoscitiva1,7,8,9. Squilibri nell'omeostasi DA sono implicati in diverse patologie neuropsichiatriche come disordine di iperattività di deficit di attenzione, tossicodipendenza, depressione e morbo di Parkinson1. DA viene rilasciato dal neurone presinaptico nella fessura sinaptica, dove lega a ed attiva i recettori sulla membrana pre- e postsinaptico, trasporto così ulteriormente il segnale. Il livello di DA nella sinapsi dopo il rilascio è controllato da DAT3,10, spazialmente e temporalmente. Il trasportatore sequestra dallo spazio extracellulare e così sostiene la fisiologica DA livelli3,11. Rimozione genetica di DAT nei topi provoca un fenotipo di hyperdopaminergic caratterizzato dai livelli elevati DA sinaptica, deplezione intracellulare DA piscine e profondi cambiamenti nella postsinaptica DAergica segnalazione10,12.
Qui, vengono presentati due protocolli separati, un metodo di misura DA contenuto del tessuto e l'altro per valutare la funzionalità del DAT. combinata con l'analisi di superficie biotinylation descritto da Gabriel et al.13 questi due metodi forniscono informazioni su DA livelli di contenuto e funzionali di DAT per una valutazione approfondita dell'omeostasi DA. Con questi metodi DA omeostasi dei vari modelli di malattia o topi transgenici può essere caratterizzato e descritto. Questi strumenti sono stati implementati e ottimizzati e sono uso standard nei nostri laboratori. Saggi di corrente hanno servito per studiare le conseguenze sull'omeostasi DA alterare il C-terminale di DAT14 o esprimendo la Cre ricombinasi sotto la tirosina idrossilasi (TH) promotore 5.
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Protocol
le linee guida dell'Ispettorato di sperimentazione animale danese (numero di autorizzazione: 2017-15-0201-01160) è stata seguita e gli esperimenti effettuati in una struttura completamente AAALAC accreditato sotto la supervisione di un locale benessere degli animali Comitato.
1. sinaptosomiali assorbimento della dopamina (metodo 1)
Nota: questo protocollo è per la valutazione parallela dei due cervelli, ma può essere utilizzato con successo per eseguire esperimenti di assorbimento DA sinaptosomiali con quattro cervelli in parallela.
- Preparati
- etichetta 48 mL 1,5 micro-centrifuga tubi per tabella 1 (24 per ogni cervello). Utilizzare colori diversi per i tubi appartenendo a ogni cervello per evitare confusione tra i campioni
- etichetta 51 scintillazione tubi #1-51.
- Posto tampone fosfato (PBS) sul ghiaccio. Questo verrà utilizzato per mantenere il cervello refrigerati.
- Attivare la centrifuga per consentire pre-raffreddare a 4 ° C.
- Pre-pesare due provette da micro-centrifuga per ottenere il peso esatto del tessuto durante la preparazione sinaptosomiale (punto 2.6). Buffer di
- Prepare omogeneizzazione mescolando 4 mM HEPES e 0,32 M saccarosio. Regolare il pH a 7,4 e tenere il ghiaccio
Nota: Omogeneizzazione buffer può essere mantenuto in aliquote a-20 ° C e scongelato il giorno dell'esperimento.
Buffer di assorbimento - preparare combinando le seguenti: 25mm HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 millimetro di acido ascorbico (0,194 g/L), 5 mM D-glucosio (0,991 g/L). Regolare il pH a 7.4 con NaOH (conduce a una concentrazione di sodio di circa 130 mM) e tenere il ghiaccio
Nota: Per 2 cervelli, preparare 1500 mL di tampone per l'assorbimento. Preparare il tampone di assorbimento come un 10 x soluzione di riserva senza acido ascorbico e glucosio conservato a 4 ° C. rendere 1 x soluzione di lavoro appena il giorno, un'integrazione con acido ascorbico e del glucosio. Regolare il pH con NaOH 7.4. - Preparare l'assorbimento buffer + ligando combinando le seguenti: 25mm HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaC l2, 1,2 mM MgSO 4, 1 millimetro di acido ascorbico (0,194 g/L), 5 mM D-glucosio (0,991 g/L), 1 μM pargyline, desipramina nM 100, 10 nM Inibitore della catecol-O-metil-transferasi (COMT). Regolare il pH 7.4 con NaOH e tenere il ghiaccio
Nota: Utilizzare 50 mL di tampone per l'assorbimento e aggiungere ligando. Pargyline è aggiunto per aiutare a prevenire la degradazione di DA ossidazione attraverso della monoamina ossidasi (MAO). Inibitore COMT (RO-41-0960) viene aggiunto a prevenire il degrado di DA (catecolamine in generale) attraverso COMT. Desipramina è aggiunto per inibire l'assorbimento attraverso i trasportatori di serotonina e noradrenalina e quindi rendere i risultati di assorbimento specifico per DAT. - Preparare l'assorbimento buffer + ligando + cocaina combinando le seguenti: 25mm HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 millimetro di acido ascorbico (0,194 g/L), 5 mM D-glucosio (0,991 g/L), 1 μM pargyline, desipramina nM 100 , 10 nM COMT inibitore, cocaina 500 μM. Regolare il pH a 7.4 con NaOH e tenere il ghiaccio
Nota: Utilizzare 7 mL di tampone di assorbimento + ligando e aggiungere la cocaina. Cocaina è aggiunto per ottenere una misurazione di sfondo dell'assorbimento DA non specifici per sottrarre dai dati, lasciando solo l'assorbimento di DAT-specifici (poiché SERT e NET sono inibiti da desipramina, come descritto sopra). In alternativa, un inibitore altamente potente e specifico di DAT GBR-12935, può essere utilizzato invece.
Importante: Tenere tutto su ghiaccio d'ora in .
- Sinaptosomiali preparazione
- sacrificare un mouse in un momento di dislocazione cervicale e decapitazione.
- Tagliare la pelle con le forbici per rivelare il cranio e tagliare qualsiasi tessuto in eccesso posteriore di sinistra del cranio da decapitazione. Tagliare il cranio con piccole Forbici rette lungo la sutura ed anteriormente possibile finire.
- Mettere le punte di due forbici in ogni occhio del mouse e tagliare attraverso il cranio per rimuovere il resto del cranio e il cervello intatto. Rimuovere il cervello e inserirlo nella gelida PBS rapidamente. Ciò manterrà freddo, mentre il secondo cervello è dissecato.
- Utilizzando una matrice di cervello, sezionare una fetta della corona 3 mm dello striato (anteriore-posteriore: +1,5 mm a-1,50 mm) seguita da una dissezione più fine con un perforatore. Vedere la Figura 1 per punzone area.
- Mantenere il tessuto sul ghiaccio a tutte le volte andare avanti.
- Trasferire il tessuto in una provetta da 1,5 mL micro-centrifuga per la pesatura.
Nota: Questo peso verrà utilizzato nel passaggio 1.2.14. - 1.2.1-1.2.6 passaggio ripetere per il secondo cervello.
- Una volta che il peso è stata ottenuta per entrambi i cervelli, trasferire il tessuto a un bicchiere di omogeneizzazione contenente 1 mL di tampone di omogeneizzazione ghiacciata.
- Omogeneizzare il tessuto con un pestello guidato motore a 800 giri/min, 10 colpi anche.
Nota: Un colpo è uguale a uno su e giù per azione, il primo colpo dovrebbe essere circa 5 s, quanto segue: 3-4 s. omogeneizzazione in mezzo isotonico è importante per prevenire la rottura dei sinaptosomi 6. Utilizzando la forza appropriata e mezzo isotonico permetterà i terminali presinaptici reseal inclusione citoplasma, vescicole sinaptiche, i mitocondri e citoscheletro 15. - Trasferire l'omogeneizzato a una micro-centrifuga da 1,5 mL e raccogliere l'omogenato rimanente dal vetro omogeneizzazione risciacquando con 0,5 mL di tampone di omogeneizzazione ulteriori.
- Tenere il campione sul ghiaccio mentre il tessuto da altri cervello è omogeneizzato. Eseguire i due cervelli in parallelo in passaggi 1.2.12-1.2.13.
- Pellet di nuclei e delle cellule di detriti da centrifugazione (1.000 x g, 10 min, 4° C).
- Trasferire il surnatante (S1) (contenente le membrane cellulari ed il citoplasma) al nuovo per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 16.000 x g per 20 min a 4 ° C.
- Scartare il surnatante (contenente citoplasma) e risospendere il pellet (P2) (contenente grezze sinaptosomi) nel buffer di omogeneizzazione 40 μL / tessuto di mg (in base al peso ottenuto nel passaggio 1.2.6). Risospendere delicatamente la frazione sinaptosomiale grezza con una pipetta p1000 come troppa forza si romperà i sinaptosomi.
Nota: È importante finire con almeno 280 μL. In caso contrario, sarà necessario diluire con più di 40 µ l per mg. 1.2.1-1.2.13 passaggi devono essere eseguiti più velocemente possibile e tutto deve essere tenuta su ghiaccio. Appena synaptosomes grezzo sono stati risospesi in buffer di omogeneizzazione sono abbastanza stabili, finché sono tenute il ghiaccio 6 , 15 , 16.
2. Esperimento di assorbimento
- aggiungere 440 μL assorbimento buffer + ligando + cocaina per l'area 12 per microcentrifuga da 1,5 mL e 440 μL assorbimento buffer + ligando a 36 restanti provette per microcentrifuga da 1,5 mL (Vedi tabella 1 per il layout).
Nota: Rimuovere dal ghiaccio 15 min prima dell'inizio dell'esperimento a portarli a temperatura ambiente, ma tenere il ghiaccio fino a quando poi per conservare gli inibitori. - Preparare la curva di saturazione (dopamina (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H della dopamina) (91,1 IC/mmol) alle varie concentrazioni finali (0.031, 0,0625, 0.125, 0.25, 0.5 e 1.0 μM)).
- Etichetta sei microcentrifuga 2 mL come 10, 5, 2.5, 1.25, 0,62 e 0,31.
- Aggiungere 750 μL assorbimento buffer + ligando nelle 5 provette microcentrifuga con numero più basso.
- Aggiungere 1,455.4 μL assorbimento buffer + ligando, 14,6 dopamina μL (1 mM), 30 µ l-dopamina 3-H (11 μM) nella provetta etichettata 10.
- Trasferire 750 μL dal tubo etichettati 10 nella provetta etichettata 5. Mescolare bene e trasferire 750 μL da questo tubo al tubo 2,5. Ripetere questa diluizione con i rimanenti tubi.
- Pre-sciacquare i filtri in microfibra di vetro con 4 mL di tampone di assorbimento dopo la loro immissione su un secchio di filtro ben 12.
- Aggiungere 10 μL della sospensione sinaptosomiali della membrana per le prime 24 mL 1,5 micro-Centrifugare le provette (Vedi tabella 1 per il layout) contenente tampone μL 440. Vortice attentamente e spin giù poco per assicurare che i sinaptosomi sono sommersi nel buffer. 37 o C per 10 min. di lasciare
Nota: È importante essere esatti sui tempi durante l'esperimento di assorbimento per un confronto equo tra cervelli. Utilizzare un cronometro per precisione.
Dopamina - aggiungere 50 μL di concentrazione 10 e 5 μM (sezione 2.2) per i primi due colonne e lasciare a 37 o C per 5 minuti con agitazione. Dopo esattamente 5 minuti, fermare la reazione aggiungendo 1 mL di tampone di assorbimento ghiacciata. Fare lo stesso con concentrazione 2.5 e 1,25 μM (par. 2.2) e poi con concentrazione 0,62 e 0,31 μM.
- Aggiungere i campioni per i filtri di pre-risciacquata in microfibra e lavare con 5 x 4 mL di tampone di assorbimento ghiacciata. Quando i primi 12 campioni sono stati aggiunti ai filtri, è possibile spostare i filtri ai tubi di scintillazione. Ripetere questa operazione per i prossimi 12 campioni.
- Ripetere il punto 2.4-2.6 per il prossimo cervello.
- Preparare 3 max-conteggio tubi posizionando un filtro in microfibra nella parte inferiore dei tubi di scintillazione 49-51 e aggiungendo 25 µ l della concentrazione di dopamina massima sulla parte superiore (10 μM).
- Lasciare tutti i 51 scintillazione tubi in una cappa per 1 h.
- Aggiungere 3 mL di liquido scintillazione per ogni tubo di scintillazione e agitare vigoroso su un agitatore per 1 h.
- Conteggio [3 H]-DA in un beta counter per 1 min.
- Aprire il programma e scegliere: etichetta: H-3, piastra/filtro: flaconcino da 4 mL, 4 x 6, tipo di dosaggio: normale e tempo di conteggio: 1 min.
Nota: Questo passaggio può essere eseguito il giorno seguente se più conveniente. Lasciare i campioni ricoperti con carta stagnola tutta la notte.
- Aprire il programma e scegliere: etichetta: H-3, piastra/filtro: flaconcino da 4 mL, 4 x 6, tipo di dosaggio: normale e tempo di conteggio: 1 min.
- Determinazione della proteina
- utilizzare un kit di analisi della proteina di BCA standard per determinare le concentrazioni di proteina di sinaptosomi di adeguamento da conteggi al minuto (cpm) per fmol/min/μg e per un corretto confronto dell'assorbimento tra i campioni.
3. Analisi dei dati
- uso i dati dall'assorbimento esperimento per rendere una saturazione della curva per ciascun gruppo e calcolare il tasso di reazione (V max) e la costante di Michaelis Menten (M. K).
Nota: Il valore di K M riflette la concentrazione di substrato necessaria per raggiungere la metà del V max. Di conseguenza, V max riflette direttamente la funzione di DAT (capacità di assorbimento massima), che dipende dal numero di DAT sulla superficie e su come la sua attività potrebbe essere modulata da modifiche di posttranslational e/o proteine interagenti, così come il alterazioni in gradienti ionici. Il valore di K M è una misura indiretta di affinità del substrato per il trasportatore che, cosa importante anche può essere modulata da proteine interagenti e/o di modifiche di posttranslational. Per valutare appieno i cambiamenti funzionali è pertanto importante determinare direttamente i livelli di espressione di superficie da per esempio un'analisi di superficie biotinylation. Una descrizione di reuptake della dopamina e un'elaborazione sul significato dei valori max K M e V sono state esaminate da Schmitz et al 17.
4. Cromatografia liquida ad alte prestazioni (metodo 2)
- dissezione cerebrale
- Label e pesare microcentrifuga; uno per ogni regione per topo.
- Sacrificare un mouse in un momento di decapitazione e dislocazione cervicale. Rimuovere velocemente il cervello come descritto nella sezione 1.2. Eseguire ulteriori dissezione immediatamente.
- Utilizzando una matrice di cervello, sezionare una fetta della corona 3 mm dello striato seguita da più fine una dissezione bilaterale di NAc e dStr con un perforatore. Vedere la Figura 3 per punzone area.
- Trasferire il tessuto per provette per microcentrifuga da 1,5 mL e posizionare rapidamente il ghiaccio secco. Pesare il tessuto e posizionarlo immediatamente indietro sul ghiaccio a secco.
Nota: Il peso del tessuto è importante per il calcolo della concentrazione più tardi.
4.1.1-4.1.4 - ripetere le operazioni con il mouse successivo.
Nota: Posizionare il tessuto a 80 o C fino a ulteriore elaborazione o immediatamente procedere all'elaborazione del tessuto.
5. Preparazione dei tessuti
- centrifuga per consentirgli di effettuare la pre-raffreddare a 4 ° C, attivare
- preparare la soluzione di omogeneizzazione (0,1 N perclorico Acido (HClO 4)) e tenere il ghiaccio.
- Soluzione di omogeneizzazione Using, preparare standard fresco 0,1 pmol/μL dopamina da una soluzione madre (una diluizione 10.000 x) di 1 mM.
Nota: La soluzione madre è preparata sciogliendo dopamina nel buffer di omogeneizzazione ad una concentrazione stock di 1 mM, che può essere mantenuto a 20 ° C per circa un mese. Se altre aree del cervello sono di interesse, concentrazione dello standard devono essere modificate, da altre zone del cervello compreso prefrontral corteccia, ippocampo, nigra di substantia e area tegmentale ventrale possiedono fino a 100 volte inferiore DA rispetto al corpo striato. - Aggiungere 500 μL di soluzione di omogeneizzazione per ogni campione (cioè del tessuto di NAc e dStr; sezione 4.1) e omogeneizzare campioni usando un ultra-omogeneizzatore in piena velocità per circa 30 s. tenere il campione in acqua ghiacciata durante l'omogeneizzazione. Tra ogni campione, pulire l'omogeneizzatore ultra con acqua (piena velocità per 30 s).
- Centrifugare i campioni per 30 min a 4 ° C, 14.000 x g.
- Trasferimento circa 200 μL di campione a un filtro di vetro 0.22 μm (1 cm di diametro) utilizzando una siringa di plastica da 1 mL.
Nota: L'uso di filtri di vetro non è importante, come i filtri scelti sono 0.22 μm per rimuovere le sostanze ad alto peso molecolare. - Analizzare campioni tramite rilevazione elettrochimica (CE)-HPLC metodologia 18 come descritto nella sezione 6.
6. Analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni
- preparare la seguente soluzione per fase mobile: acetato di sodio 55mm, acido octanesulfonic 1 mM, Na 2 EDTA 0,1 mM, acetonitrile 8%, acido acetico 0,1 M, pH = 3.2.
Nota: Regolare il pH con acido acetico 0,1 M. È importante essere precisi con il pH. La soluzione deve essere degasseRe del degassificatore on-line (parte integrante del sistema HPLC). Fare 2 L della fase mobile e cambiarlo una volta al mese (cambiarlo quando il rumore diventa evidente). A causa di fluttuazioni ci vogliono circa 24 h per regolare dopo la modifica la fase mobile. - Set-up del rivelatore:
- Set volt uscita a 700 mV e temperatura di 32 ° C il forno rivelatore; questo è molto importante. Fare un programma di intervallo utilizzando il manuale online. Consultare il manuale per ulteriori dettagli). Aggiungere il programma di tempo secondo la tabella 2.
Nota: In questo studio, il programma è impostato per modificare automaticamente la corrente in tempi di ritenzione set, per mantenere l'HPLC alla corrente ottima e per mantenere i picchi del cromatogramma come ampliato come possibile, ma ancora all'interno di vista. Questo è stato ottimizzato per striatal cervello lisati da topi.
- Set volt uscita a 700 mV e temperatura di 32 ° C il forno rivelatore; questo è molto importante. Fare un programma di intervallo utilizzando il manuale online. Consultare il manuale per ulteriori dettagli). Aggiungere il programma di tempo secondo la tabella 2.
- Quando il programma è stato aggiunto al rivelatore, fare una curva di calibrazione del punto 3, iniettando lo standard tre volte (5, 10 e 15 μL).
Nota: Standard (10 μL (μL 10 x 0,1 pmol/μL = 1 pmol DA)) deve essere iniettato ogni decimo campione e campioni tarati allo standard più vicina. Sintonia fine il sistema il giorno prima lo standard di 3 punti di regolazione, e controllando se il cromatogramma esce nell'intervallo previsto. Se si osserva un notevole rumore, cambiare la fase mobile. Se un picco è superiore a 990 mV poi re-iniettare il campione in un volume più basso, o fare un nuovo programma di gamma e una nuova curva standard. Il limite di rilevamento è misurato come 3 volte il valore di rumore in sistemi mV per il più basso valore di picco iniettato per ogni standard (NA, DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT e 5-HT).- Sistema di set-up aprendo la soluzione di LC e attivazione inizia a 1; questa analisi in modalità in linea. Digitare l'ID utente e la password e fare clic su ok. Attesa per la soluzione di LC per connettersi agli strumenti. Vai alla tabella batch e compilare dati informazioni (ad esempio, tipo di campione: sconosciuto per campioni e std per il tipo di analisi standard,: esso QT, inj volume: 10, ISTD amt: livello 1 con). Salvare il file (andare su File - > salvare il file Batch come - > salvare).
- Rendere il sistema iniettare il campione primo premendo ' Start Batch '. Ciò comporta l'iniezione di 10 μL di campione di autocampionatore con un modulo di dosaggio del solvente.
Nota: Utilizzare una pompa portata di 0,15 mL/min e una colonna C18 con fase di inversione. Qui è stato usato un rivelatore amperometrico per rilevazione elettrochimica. L'elettrodo a carbone vetroso deve essere impostata a 0,8 V con un elettrodo di riferimento Ag/AgCl. Al fine di analizzare campioni di dopamina, utilizzare cromatografia 3 µ ODS C18 (3) (DA 2 mm x 100 mm, particella 3 µm) per realizzare la separazione cromatografica. - Estrarre le aree dei picchi registrati e calcolati.
- Vai all'acquisizione dati per seguire il cromatogramma quando i campioni hanno finito. Vai al post eseguire analisi - Lc > ha scelto il nome del file (il cromatogramma si aprirà) - > fare clic su Visualizza. Sulla barra degli strumenti di integrazione manuale, aggiungere tutte le cime per essere integrato - > Vai al report di dati e stampare la lettura.
Nota: Qui il software solution LC è stato usato per controllo di sistema e all'analisi di dati.
- Vai all'acquisizione dati per seguire il cromatogramma quando i campioni hanno finito. Vai al post eseguire analisi - Lc > ha scelto il nome del file (il cromatogramma si aprirà) - > fare clic su Visualizza. Sulla barra degli strumenti di integrazione manuale, aggiungere tutte le cime per essere integrato - > Vai al report di dati e stampare la lettura.
- Delle aree di picco, calcolare la concentrazione di dopamina in un campione, come indicato di seguito utilizzando la concentrazione nota dello standard:
- utilizzare l'area del picco dello standard (è uguale a 1 pmol) per acquisire il fattore r.
- utilizzare il fattore A per ottenere la concentrazione dei campioni.
Concentrazione del campione (in pmol a 10 μL) = area del picco × fattore di A del campione - utilizzare questa formula per ottenere la concentrazione del campione in ng.
Campione concentrazione pmol / 10 µ l x 500 µ l x MW di dopamina = concentrazione del campione in ng
campione di concentrazione (in ng) = concentrazione del campione (in pmol a 10 μL) x 500 μL x MW di dopamina - utilizzare la concentrazione del campione in ng per ottenere t egli campione concentrazione nel tessuto di pg/g (campione di concentrazione in pg / g di tessuto = tessuto pg/g).
- utilizzare l'area del picco dello standard (è uguale a 1 pmol) per acquisire il fattore r.
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Representative Results
Protocollo di corrente DA assorbimento (Figura 1) include tutti i passaggi necessari per valutare la funzionalità del DAT in sinaptosomi dai topi. I nostri dati rappresentativi del metodo DA assorbimento (Figura 2) raffigura una curva di saturazione con dati non rettificati (Figura 2B) e regolato dati (Figura 2A). La curva di saturazione Mostra l'assorbimento da topi wild type. Solitamente uno farebbe nell'assorbimento del DA per il confronto con un topo mutante, che condurrebbe ad una curva di saturazione per ciascun genotipo5. In tal caso, le differenze tra wild type e topi mutanti in 2A e 2B possono essere spiegate da fattori multipli. Più approfondita lo sperimentatore è in seguito ogni passo del protocollo, la meno differenza c'è tra raffigurante crudo (2B) e dati di proteina regolata (2A). Le ovvie ragioni per le differenze sono i) peso del tessuto nel passaggio 1.2.6, ii) perdita di tessuto durante il trasferimento da vetro di omogeneizzazione in fase 1.2.8-1.2.10 e imprecisi e iii) imprecisione durante il trasferimento del surnatante nel passaggio 1.2.13 e rimozione di surnatante nel passaggio 1.2.14. Si consiglia di eseguire un esperimento preliminare in topi wild type per maggiore precisione.
La dopamina metodo CE-HPLC (Figura 3) comprende tutti i passaggi necessari per quantità di asini di DA in dStr e NAc dei topi. I nostri dati rappresentativi (Figura 4 e tabella 3) rappresentano il risultato di un esperimento condotto su topi wild type.
Figura 1: flusso di lavoro schematico raffigurante le diverse fasi nell'assorbimento sinaptosomiale DA sperimentare protocollo. Il mouse è sacrificato dalla dislocazione cervicale, seguita da dissezione cerebrale e posizionamento in una matrice di cervello. Una fetta della corona spessa 3 mm viene sezionata dal cervello, e bene dissezione viene eseguita da un pugno bilaterale di una piccola area immediatamente di sotto del corpo calloso. Striato dorsale è omogeneizzato in 1 mL di tampone di omogeneizzazione di rottura meccanica seguita da 10 min di centrifugazione a bassa velocità. Surnatante viene trasferito in una provetta pulita e centrifugato ad alta velocità per 20 min. Il pellet, contenenti i sinaptosomi, è sedimento e pronto per l'esperimento di assorbimento. L'assorbimento avviene aggiungendo triplici copie dei differenti [3H]-DA concentrazioni, che variano da una concentrazione finale di 0,031 a 1 μM. Inoltre, la variazione delle concentrazioni di contenente tritio DA vengono aggiunti ad un campione di controllo contenente cocaina di 500 μM. Infine, i campioni vengono conteggiati in un beta-counter e analisi dei dati viene eseguita rivelando la curva di saturazione di DAT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rappresentante risultati da un esperimento di assorbimento DA sinaptosomiale di quattro topi wild type di C57Bl/6 da un ceppo di topo Drd1a-cre. (A) dati rappresentativi raffigurante la curva di saturazione della captazione DA attraverso il DAT di preparazioni sinaptosomiali da topi wild type (n = 4). Punti neri sono i valori dei quattro topi indicati separatamente, che la curva verde Mostra come dati normalmente sarebbero essere raffigurati combinando i dati dai topi di 4-6 per ogni gruppo. Questo grafico combina dati da quattro topi. (B) il grafico di saturazione dei dati grezzi, senza regolazione per concentrazione di proteina effettivo dei campioni. In sostanza, è la versione non rettificata dei dati nei dati di a. (C) controllo. Questo grafico mostra i conteggi dai campioni contenenti cocaina, che sono usati per sottrarre sfondo dai dati di assorbimento. Questo controllo è essenziale per determinare l'affidabilità dei dati di assorbimento, ma raramente è indicato negli articoli. Se questi dati per qualche motivo non mostrano linearità, indica un problema critico con il set-up, che deve essere identificato e risolto per dedurre nulla dai dati. R al quadrato: n1 = 0.9852, n2 = 0.9584, n3 = 0.9606, n4 = 0.9913. (D) istogramma che mostra la capacità di assorbimento del DAT (VMAX). VMAX = proteina di fmol/min/μg 43,13 ± 3.2). I dati vengono visualizzati come media ± SEM. (E) istogramma che mostra KM per DAT essere 0,1 μM ± 0.03 corrisponde bene al metodo voltammetria disco rotante raffigurante i valori di KM del DAT di essere 0,6 μM19. Un valore di KM 0.1 μm corrisponde anche bene per i valori di KM di 0.22 μM che sono stati ottenuti da modelli di stimolazione di stimolata DA overflow in striatum20,21. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: flusso di lavoro schematico raffigurante le diverse fasi del protocollo di cromatografia liquida ad alte prestazioni. Il mouse è sacrificato dalla dislocazione cervicale, seguita da dissezione cerebrale e posizionamento nella matrice di cervello. Una fetta della corona spessa 3 mm viene sezionata dal cervello, e la dissezione bene è realizzata perforando bilateralmente due aree più piccole, dividendo il corpo striato nel dStr e CNA. Tessuto è omogeneizzato, seguita da centrifugazione veloce. Standard con noti DA concentrazioni così come i surnatanti dai campioni vengono eseguiti in HPLC, producendo cromatogrammi. Le aree dei picchi diversi vengono utilizzate per calcolare la concentrazione di DA nei campioni rappresentati in un istogramma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: risultati rappresentativi di un esperimento di cromatografia liquida ad alte prestazioni. (A) HPLC cromatogramma per 10 μL di campione da dStr iniettato un C18 colonna (2 x 100 mm) utilizzata per piccole molecole. Tempi di ritenzione; 3,7 min per noradrenalina (NA), 6,7 min per acido dihydroxyphenylacetic (DOPAC), 8,3 min per DA, min 10,7 per acido hydroxyindoleacetic 5 (HIAA), 15,3 min per acido homovanillic (HVA), 18,8 min per 3-methoxytyamine (3-MT) e 20,8 min per 5-hydroxtryptamine (5-HT). Solo i valori per le cime DA sono calcolati in questo studio. (B) istogramma che mostra la concentrazione di DA nel NAc e dStr basato su chromatrogram. Analisi HPLC di striatal aree tra cui dStr e topi NAc di C57BL/6 (n = 7). I dati sono mostrati come media± SEM. 
indica un cambiamento nella resistenza ed è stato aggiunto manualmente al cromatogramma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 + coc | 5 + coc | 2.5 + coc | 1.25 + coc | 0,62 + coc | 0,31 + coc |
Tabella 1: Layout di tubo del Microcentrifuge per sinaptosomiali preparazione.
| Tempo | Gamma | Filtro | Valvola | Azzeramento automatico | Offset | Cella E |
| 0 | 1NA | 0,5 Hz | carico | non | 30% | 0,7 V |
| 0.2 | 1NA | 0,5 Hz | carico | impostare | 30% | 0,7 V |
| 5 | 500pA | 0,5 Hz | carico | non | 30% | 0,7 V |
| 5.2 | 500pA | 0,5 Hz | carico | impostare | 30% | 0,7 V |
| 9.4 | 200pA | 0,5 Hz | carico | non | 30% | 0,7 V |
| 9.6 | 200pA | 0,5 Hz | carico | impostare | 30% | 0,7 V |
| 12 | 100Pa | 0,5 Hz | carico | non | 30% | 0,7 V |
| 12,2 | 100Pa | 0,5 Hz | carico | impostare | 30% | 0,7 V |
| 16,2 | 50pA | 0,5 Hz | carico | non | 30% | 0,7 V |
| 16,4 | 50pA | 0,5 Hz | carico | impostare | 30% | 0,7 V |
| Fine tempo 25 min | ||||||
Tabella 2: Programma di tempo HPLC utilizzato in questo studio.
| # Picco | Tempo di RET. | Zona | Altezza | Area % | Altezza % |
| 1 | 3.745 | 230451 | 18500 | 0,299 | 0.626 |
| 2 | 6.691 | 5573485 | 382143 | 7.228 | 12.922 |
| 3 | 8.336 | 13209342 | 510378 | 17.131 | 17.258 |
| 4 | 10.760 | 16443198 | 831182 | 21.325 | 28.106 |
| 5 | 15.344 | 7129795 | 282473 | 9.247 | 9.552 |
| 6 | 18.830 | 11279424 | 346248 | 14.628 | 11.708 |
| 7 | 20.846 | 23241754 | 586419 | 30.142 | 19.829 |
| Totale | 77107450 | 2957344 | 100.000 | 100.000 |
Tabella 3: analisi di picco mostrando la zona e l'altezza dei picchi differenti utilizzati per calcolare le concentrazioni mostrate Figura 4B .
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Discussion
Questo manoscritto descrive i protocolli sperimentali utili per delineare DA omeostasi in qualsiasi modello del mouse di scelta. Forniamo protocolli dettagliati per misura i livelli di DA nel tessuto cerebrale da topi con HPLC e sinaptosomiali DA assorbimento per valutare funzionale DA trasporto attraverso DAT. Saranno elaborati le procedure, protocolli e i limiti per l'esperimento di HPLC e analisi di assorbimento sinaptosomiale DA sotto.
Il protocollo di assorbimento sinaptosomiale in grado di fornire informazioni utili per la funzionalità di DAT. Combined con una superficie biotinylation esperimento13, conoscenza sul importo totale, a livello della superficie e funzionalità di DAT può essere ottenuta. Dato il ruolo fondamentale del DAT e la sua influenza sulla trasmissione Daergica e la sua partecipazione in varie malattie, è stato degli obiettivi principali per stabilire le analisi che possono modello DAT funzioni. Uno dei vantaggi dell'esperimento di assorbimento DA sinaptosomiali è che può essere eseguita post in vivo manipolazioni come sopra chemogenetic manipolazione come sia le diverse in vivo i trattamenti farmacologici o comportamentali di formazione oltre a indagini su topi geneticamente modificati. Trattamento farmacologico può essere eseguita dopo preparazione sinaptosomiali, invece di in vivo se si preferisce, che permette di testare l'effetto dei farmaci su DAT direttamente22.
Alternative all'esecuzione sinaptosomiali nell'assorbimento del DA, consiste nell'eseguire esperimenti di assorbimento in colture neuronali naturalmente esprimendo il trasportatore o colture di cellule transfettate DAT. Saggi di cultura cellulare potrebbero essere preferiti per le indagini iniziali in diverse modifiche di DAT23, mentre colture neuronali primarie con il trasportatore endogeno possono fornire un'immagine più fisiologicamente affidabile del trasportatore funzione in vivo. Anche se colture neuronali sono fatte direttamente dagli animali, ci sono vantaggi dell'utilizzo di sinaptosomi invece. Colture neuronali sono fatte solitamente da neuroni prenatali o immaturi, che possono influenzare la funzione e l'espressione di DAT, mentre preparazioni sinaptosomiali rappresentano preparazioni fisiologiche che possono essere ottenute da animali adulti ed anche anziani senza Difficoltà6,14.
Ci sono diversi vantaggi di usando l'esperimento di assorbimento sinaptosomiale per studiare la funzione di DAT, ma importanti limitazioni devono essere considerati. Synaptosomes hanno limitato la redditività6. Tenerli sul ghiaccio è essenziale per ottenere risultati affidabili con basse variazioni. Se tenuta su ghiaccio e fornito le sostanze nutritive necessarie, sinaptosomi purificati sono vitali per ore, prenda e rilasciare neurotrasmettitori in modo efficiente15. È possibile congelare sinaptosomi, ma il metodo di congelamento è di grande importanza15. Piccole variazioni nella procedura sperimentale possono portare ad ampie variazioni nel risultato. Di conseguenza, dovrebbero essere ottimizzati protocolli sperimentali sulle condizioni di tipo selvaggio (es. topi wild type) fino a quando non si ottengono risultati riproducibili e quindi il confronto può essere fatto seguendo varie manipolazioni genetiche o farmacologiche. Analisi di assorbimento sinaptosomiale DA è un semplice, affidabile e valido strumento sperimentale per acquisire dati riproducibili con una variazione molto bassa in un parametro chiave nell'omeostasi del DA, funzionalità DAT (Figura 2A). Le limitazioni sono pesantemente superate dai vantaggi di essere in grado di eseguire l'esperimento sulle terminazioni nervose conservati da topi adulti6.
I metodi attualmente utilizzati per analizzare i livelli di DA nel tessuto sono supportati dai metodi istochimici sviluppati negli anni cinquanta. L'importanza di sviluppare metodi come HPLC per misurare i livelli di DA, è stato evidente dal scoprendo la diminuzione notevole di DA nei gangli basali dei pazienti di Parkinson, fondando così il principio di cura dei pazienti affetti da morbo di Parkinson con l-dopa24. Dopo questa scoperta, sono state sviluppate tecniche più avanzate per l'analisi del tessuto DA livelli, ma come con qualsiasi altra tecnica ci sono insidie. Una delle pecche principali di queste tecniche è la natura instabile di monoamine (dopamina, noradrenalina e serotonina). Come preparare correttamente la preparazione del tessuto per evitare la perdita delle monoamine è stato discusso in dettaglio da Atack et al. 25 e non sarà discusso ulteriormente in questo articolo, tranne al sottolineare l'importanza di immissione il tessuto sul ghiaccio secco direttamente dopo la dissezione e non aggiungendo soluzione omogeneizzazione fino a immediatamente prima l'analisi HPLC. Dalla nostra esperienza, tessuto può essere mantenuto a-80 oC fino ad un mese senza alcuna degradazione di DA se nessuna soluzione è stata aggiunta. Atack et al discutere di preparazione di tessuti per metodi che vanno dal metodo spettrometria di fluoro ai metodi avanzati di HPLC permettendo un limite di rilevazione fino a 3 ng/mL tessuto25. Il metodo che descriviamo in questo articolo si basa sugli stessi principi. Attuali tecnologie avanzate consentono più raffinata analisi e rilevamento dei livelli DA a fmol concentrazioni. Utilizzando una tecnica HPLC fluorescente, analisi della monoamina ancora più robusto possono essere ottenuto26. Per la robustezza del metodo HPLC è ampiamente usato per ottenere informazioni sui cambiamenti nei livelli delle monoamine e precursori e metaboliti in varie regioni del cervello, come il bis nel corpo striato, convalida dei modelli di malattia di Parkinson in topi, scimmie e minipig27,28,29. Qui, eseguiamo l'esperimento sul tessuto da dStr e NAc, ma il metodo è anche adatto per altre zone del cervello innervati DA, ad esempio prefrontral corteccia, ippocampo, nigra di substantia e area tegmentale ventrale 30. In queste aree, un campione standard più diluito sarà necessario per la corretta determinazione dei livelli di DA. La nostra analisi del contenuto DA mostrare i livelli elevati in striatal S6K rispetto alle precedenti indagini, ma questo può essere spiegato sperimentalmente. In primo luogo, noi abbiamo dissecato due parti del corpo striato (NAc e dStr) al contrario di indagare l'intero corpo striato, che potrebbe rappresentare la differenza rispetto al precedente report12,31. Misurazioni di striatal avrà livelli DA inferiori rispetto alle misurazioni in puro dStr, in quanto livelli in NAc sono sostanzialmente inferiori rispetto a dStr. Ci sono anche gli studi precedenti, confermando i nostri livelli DA5.
Ogni test ha i suoi limiti. Saggi sono sviluppati nel tentativo di modellare e fornire informazioni su aspetti specifici di un processo cellulare, e potrebbero tralasciare dettagli importanti possibili o fornire un quadro troppo generalizzato del processo di mondo reale. Una limitazione importante da considerare nella scelta di HPLC, è che esso fornisce solo un'istantanea dei livelli del neurotrasmettitore. Tuttavia, i livelli del neurotrasmettitore sono inclini a fluttuare sopra un giorno, settimana o mese32,33, che dà risalto alla necessità per ottenere campioni in una finestra di tempo stretto, anziché confrontare i campioni prelevati in ore, giorni o mesi come anche se sono state scattate all'interno di una stessa ora. Tuttavia, dati HPLC possono fornire utili informazioni sul contenuto DA e rivelano livelli alterati aberranti come quelli hanno dimostrato dal DAT-KO e topo transgenico DAT-KD linee, dove delezione genetica o knock-down del DAT influenza significativamente DA omeostasi di ricaptazione DA perturbante. Fu questi datirthermore dimostrano che piscine DA striatale sono costituiti principalmente DA sequestrato piuttosto che de-novo sintetizzato DA e quel rifornimento delle piscine DA striatal intracellulare dipende criticamente il reuptake processo12,34. Un problema importante da considerare è che la dissezione del tessuto può limitare una descrizione più specifica e accurata del contenuto DA un'area del cervello in un dato momento. La variazione nella concentrazione DA zone differenti del cervello varia notevolmente. Pertanto, la precisione della dissezione è di grande importanza, che può essere migliorato da piccole aree per garantire soltanto il tessuto dall'area di interesse è incluso di dissezione.
Una misura più funzionale delle piscine DA endogena possa essere analizzata usando il microdialysis. Questo è stato sviluppato e introdotto da Ungerstedt et al. utilizzando la sonda verticale microdialysis35. La tecnica della microdialisi rende possibile misurare le concentrazioni di monoamine nel cervello di animali liberi di muoversi e nelle strutture differenti del cervello. Un altro vantaggio della tecnica microdialysis sopra il campionamento del tessuto attraverso HPLC è la possibilità di misurare e seguire monoamina modifiche su una grande finestra di tempo. Si tratta di un notevole vantaggio rispetto al campionamento del tessuto cerebrale, dove un solo punto nel tempo è possibile per animale come il protocollo HPLC. Mentre, il microdialysis può fornire la comprensione nella release di DA, campioni tissutali seguita da HPLC rivelerà invece cambiamenti nelle piscine endogene e la vescicolare DA. Per ottenere informazioni in tempo reale sulla cinetica di rilascio DA in varie aree cerebrali, metodi come fast-scansione ciclovoltammetria36,37 o ad alta velocità cronoamperometria38 può essere implementato.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla UCPH 2016 programma d'eccellenza (U.G., A.R., K.J.), la Fondazione di Lundbeck (M.R.) la Fondazione Lundbeck Center for biomembrane in nanomedicina (U.G.), l'Istituto nazionale di salute sovvenzioni P01 DA 12408 (U.G.), danese Consiglio per la ricerca indipendente - scienze mediche (U.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
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