Summary
Synaptosomal dopamin upptag och högpresterande vätskekromatografi analys utgör experimentella verktyg att undersöka dopamin homeostas i möss genom att bedöma funktionen av dopamintransportörer och nivåerna av dopamin i striatum vävnad, respektive. Här presenterar vi protokoll för att mäta dopamin vävnad innehåll och utvärdera funktionaliteten i dopamintransportörer.
Abstract
Dopamin (DA) är en immunmodulerande signalsubstans styr motorisk aktivitet, belöning processer och kognitiv funktion. Nedskrivning av dopaminerga (DAergic) neurotransmission är starkt förknippad med flera centrala nervsystemet-associerade sjukdomar såsom Parkinsons sjukdom, attention-deficit-hyperactivity disorder och drog missbruk1,2 ,3,4. Avgränsar sjukdomsmekanismer som involverar DA obalans är kritiskt beroende av djurmodeller att efterlikna aspekter av sjukdomar, och därmed protokoll som bedöma specifika delar av DA homeostas är viktigt att ge nya insikter och eventuella terapeutiska mål för dessa sjukdomar.
Här presenterar vi två användbara experimentella protokoll som i kombination ger en funktionell avläsning av systemets DAergic i möss. Biokemiska och funktionella parametrar på DA homeostas erhålls genom bedömning av DA nivåer och dopamin transportör (DAT) funktionalitet5. När du undersöker DA systemet, är förmågan att tillförlitligt mäta endogena nivåerna av DA från vuxna hjärnan viktigt. Därför presenterar vi hur du utför högpresterande vätskekromatografi (HPLC) på hjärnvävnad från möss att fastställa nivåer da. Vi utför experimentet på vävnad från dorsala striatum (dStr) och nucleus accumbens (NAc), men metoden är även lämplig för andra DA-innerveras hjärnområden.
DAT är viktigt för återupptaget av DA i presynaptiska terminal, därmed styra aktiviteten tidsmässiga och rumsliga släppt da. Att veta nivåer och funktionalitet av DAT i striatum är av stor betydelse vid bedömningen av DA homeostas. Här, tillhandahåller vi ett protokoll som tillåter samtidigt härleda information om ytan nivåer och funktion med hjälp av en synaptosomal6 DA upptag assay.
Nuvarande metoder kombinerat med standard immunoblotting protokoll ger forskaren med relevanta verktyg för att karakterisera DAergic systemet.
Introduction
Dopamin (DA) är en immunmodulerande signalsubstans som är kritiska för motoriska beteende, belöning och kognitiv funktion1,7,8,9. Obalanser i DA homeostas är inblandade i flera neuropsykiatriska sjukdomar såsom attention deficit hyperactivity disorder, narkotikamissbruk, depression och Parkinsons sjukdom1. DA släpps ut från presynaptiska neuron i den synaptiska spalten, där den binder till och aktiverar receptorer på pre- och postsynaptiska membranet, vilket ytterligare förmedlar signalen. Nivån av DA i synapsen efter release spatialt och temporalt kontrolleras av DAT3,10. Transportören sequesters DA från det extracellulära utrymmet, och således upprätthåller fysiologiska DA nivåer3,11. Genetiska avlägsnande av DAT i möss orsakar en hyperdopaminergic fenotyp kännetecknas av förhöjda synaptic DA, utarmning av intracellulära DA pooler och djupgående förändringar i postsynaptiska DAergic signalering10,12.
Här presenteras två separata protokoll, en metod för att mäta DA vävnad innehåll och en annan för att utvärdera funktionaliteten i DAT. kombinerat med surface biotinylation analys beskrivs av Gabriel et al.13 dessa två metoder ger information om DA innehåll och funktionella nivåer av DAT för en grundlig bedömning av DA homeostas. Med dessa metoder kan DA homeostas av olika transgena möss eller sjukdomsmodeller kännetecknas och beskrivs. Dessa verktyg har genomförts och optimerad och är standard användning i våra laboratorier. Aktuella analyser har tjänat till att undersöka konsekvenserna på DA homeostas av att ändra C-terminalen DAT14 eller uttrycker Cre recombinase under tyrosin hydroxylas (TH) arrangören 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
riktlinjerna i danska djur experiment inspektionsorganet (tillstånd nummer: 2017-15-0201-01160) följdes och experiment utförs i en fullt AAALAC ackrediterade anläggning under överinseende av en lokal djurskydd kommittén.
1. synaptosomal dopamin upptag (metod 1)
Obs: detta protokoll är för parallell utvärdering av två hjärnor, men kan användas framgångsrikt för att utföra synaptosomal DA upptag experiment med fyra hjärnor i parallell.
- Preparat
- etikett 48 1,5 mL mikro-centrifug rör per tabell 1 (24 för varje hjärna). Använda olika färger för rören som hör till varje hjärna för att förhindra förväxling av prover
- etikett 51 scintillation rör #1-51.
- Plats fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på is. Detta kommer att användas att hålla hjärnor kyld.
- Slå på centrifugen att låta svalna före till 4 ° C.
- Pre väger två micro-centrifugrör för att få den exakta vävnad vikten under synaptosomal beredning (avsnitt 2.6).
- Förbered homogenisering buffert genom att blanda 4 mM HEPES och 0.32 M sackaros. Justera pH till 7,4 och hålla på ice.
Obs: Homogenisering buffert kan förvaras i alikvoter vid-20 ° C och tinade dagen i experimentet. - Förbered upptag buffert genom att kombinera följande: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM askorbinsyra (0,194 g/L), 5 mM D-glukos (0.991 g/L). Justera pH till 7,4 med NaOH (leder till en natriumhalt cirka 130 mm) och hålla på ice.
Obs: För 2 hjärnor, förbereda 1500 mL upptag buffert. Förbereda upptag buffert som en 10 x stamlösning utan askorbinsyra och glukos förvaras vid 4 ° C. Make 1 x arbetslösning nymalen på dagen, komplettera med askorbinsyra och glukos. Justera pH med NaOH till 7,4. - Förbered upptag buffert + ligand genom att kombinera följande: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaC l2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM askorbinsyra (0,194 g/L), 5 mM D-glukos (0.991 g/L), 1 μM pargyline, 100 nM desipramin, 10 nM Katekol-O--metyltransferas (COMT) hämmare. Justera till pH 7,4 med NaOH och hålla på ice.
Obs: Använd 50 mL upptag buffert och tillsätt ligand. Pargyline är till för att förhindra nedbrytning av DA genom oxidation genom monoaminoxidas (MAO). COMT-hämmare (RO-41-0960) läggs till förhindra nedbrytning av DA (katekolaminer i allmänhet) genom COMT. Desipramin läggs till hämma upptag genom noradrenalin och serotonin transportörerna, och därmed göra upptag resultaten specifika för DAT. - Förbered upptag buffert + ligand + kokain genom att kombinera följande: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM askorbinsyra (0,194 g/L), 5 mM D-glukos (0.991 g/L), 1 μM pargyline 100 nM desipramin , 10 nM COMT-hämmare, 500 μM kokain. Justera pH till 7,4 med NaOH och hålla på ice.
Obs: Använd 7 mL upptag buffert + ligand och lägga till kokain. Kokain läggs till få en bakgrund mätning av icke-specifika DA upptag att subtrahera från data, lämnar bara DAT-specifika upptaget (eftersom SERT och NET hämmas av desipramin som beskrivs ovan). Alternativt, en mycket potent och specifik DAT hämmare GBR-12935, kan användas i stället.
Viktigt: Hålla allt på isen från nu på .
- Synaptosomal beredning
- offra en mus i en tid av cervikal dislokation och halshuggning.
- Skära huden med hjälp av sax att avslöja skallen och skär bort någon överflödig vävnad bakre delen av skallen vänster från halshuggning. Skär skallen med liten rak sax längs den sutura sagittalis hamna så anteriorly som möjligt.
- Placera två sax i varje öga av musen och skära igenom skallen till avlägsna återstoden av skallen och intakt hjärnan. Snabbt ta bort hjärnan och placera den i iskall PBS. Detta kommer att hålla det kallt, medan andra hjärnan är dissekeras.
- Med en hjärna-matris, dissekera en 3 mm koronalt bit av striatum (anterior-posterior: + 1,5 mm till -1,5 mm) följt av finare dissektion med ett hålslag. Se figur 1 för punch område.
- Hålla vävnaden på is på alla gånger framåt.
- Överföra vävnaden till ett 1,5 mL mikro-centrifugrör för vägning.
Obs: Denna vikt kommer att användas i steg 1.2.14. - Upprepa steg 1.2.1-1.2.6 för andra hjärnan.
- När vikt har erhållits för båda hjärnor, överföra vävnad till en homogenisering glas innehållande 1 mL iskallt homogenisering buffert.
- Homogenisera vävnaderna med hjälp av en motor driven mortelstöt vid 800 rpm, 10 även slag.
Obs: Ett slag är lika med en upp och ner åtgärd, första stroke bör vara ungefär 5 s, följande 3-4 s. homogenisering i isoton medium är viktigt för att förhindra bristning av synaptosomes 6. Genom att använda lämplig kraft och isoton medium kan de presynaptiska terminalerna till återförslut omslutande cytoplasman, synaptiska vesikler, mitokondrier och cytoskelettet 15. - Överföra Homogenatet till ett 1,5 mL mikro-centrifugrör och samla återstående Homogenatet från homogenisering glaset genom att skölja med 0,5 mL ytterligare homogenisering buffert.
- Håller provet på is medan vävnad från andra hjärnan är homogeniserad. Kör två hjärnor parallellt i steg 1.2.12-1.2.13.
- Pellet atomkärnor och cell skräp genom centrifugering (1 000 x g, 10 min, 4° C).
- Överför supernatanten (S1) (innehållande cellmembran och cytoplasman) till nya 1,5 mL mikrocentrifugrör och centrifugera vid 16 000 x g i 20 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten (innehållande cytoplasman) och återsuspendera pelleten (P2) (innehållande rå synaptosomes) i 40 μl homogenisering buffert / mg vävnad (baserat på den vikt som erhölls i steg 1.2.6). Försiktigt Omsuspendera den rå synaptosomal fraktionen med p1000 pipett som alltför mycket kraft kommer att bryta synaptosomes.
Obs: Det är viktigt att sluta med minst 280 μL. Om så inte är fallet, att späda med mer än 40 μl per mg blir nödvändigt. Steg 1.2.1-1.2.13 måste utföras så snabbt som möjligt och allt måste hållas på is. Så snart de rå synaptosomes har varit resuspended i homogenisering buffert de är ganska stabila så länge de hålls på ice 6 , 15 , 16.
2. Upptag Experiment
- lägga till 440 μL upptag buffert + ligand + kokain till de utsedda 12 1,5 mL mikrocentrifugrör och 440 μL upptag buffert + ligand till de 36 resterande 1,5 mL mikrocentrifugrör (se tabell 1 för layouten).
Obs: Ta bort dem från is 15 min före start av försöket att placera dem i rumstemperatur, men hålla på is tills sedan att bevara hämmare. - Förbered mättnad kurva (dopamin (2, 5, 6-[3H]-DA) (3 H dopamin) (91,1 Ci/mmol) vid olika slutliga koncentrationer (0,031, 0.0625, 0,125, 0,25, 0,5 och 1,0 μM)).
- Märka sex 2 mL mikrocentrifugrör som 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 och 0,31.
- Lägg till 750 μL upptag buffert + ligand till de 5 mikrocentrifugrör med lägsta numret.
- Lägga till 1,455.4 μL upptag buffert + ligand, 14,6 μL dopamin (1 mM), 30 μl 3 H dopamin (11 μM) till röret märkt 10.
- Överföra 750 μL från röret märkt 10 till röret märkas 5. Blanda väl och överföra 750 μL från denna tube till 2,5-röret. Upprepa denna utspädning med resterande rör.
- Före skölj glas mikrofiber filtren med 4 mL upptag buffert efter att placera dem på en 12 väl filter hink.
- Lägg till 10 μl av synaptosomal membran suspensionen till första 24 1,5 mL mikro-centrifug rör (se tabell 1 för layouten) innehållande 440 μL buffert. Vortex försiktigt och snurra ner inom kort för att säkerställa att synaptosomes är nedsänkt i bufferten. Lämna på 37 o C i 10 min.
Obs: Det är viktigt att vara exakt på tider under upptag experimentet för rättvis jämförelse mellan hjärnor. Använda ett stoppur för precision. - Tillsätt 50 μL dopamin koncentration 10 och 5 μm (avsnitt 2.2) till de första två kolumnerna och lämna vid 37 o C i 5 minuter med skakningar. Efter exakt 5 min, stoppa reaktionen genom att tillsätta 1 mL iskallt upptag buffert. Gör samma sak med koncentration 2.5 och 1,25 μM (avsnitt 2.2) och sedan med koncentration 0,62 och 0,31 μM.
- Lägg till proven till pre sköljda microfiber filter och tvätta med 5 x 4 mL iskallt upptag buffert. När de första 12 proverna har lagts till filter, flytta filtren till scintillation rör. Upprepa detta med nästa 12 prover.
- Upprepa steg 2.4-2.6 för nästa hjärnan.
- Förbereda 3 max-räkna rör genom att placera ett microfiber filter i botten av scintillation rör 49-51 och lägga 25 µL av den maximala dopamin koncentrationen på topp (10 μM).
- Lämna alla 51 scintillation rör i ett dragskåp för 1 h.
- Lägga till 3 mL scintillation vätska till varje scintillation tube och skaka kraftfulla på en shaker för 1 h.
- Count [3 H]-DA i en beta-räknare för 1 min.
- Öppna programmet och välj: etikett: h-3, plattan/Filter: injektionsflaska med 4 mL, 4 av 6, Assay typ: Normal och räknar tid: 1 min.
Obs: Kan detta steg utföras följande dag om bekvämare. Lämna prover täckt med aluminiumfolie över natten.
- Öppna programmet och välj: etikett: h-3, plattan/Filter: injektionsflaska med 4 mL, 4 av 6, Assay typ: Normal och räknar tid: 1 min.
- Protein beslutsamhet
- använda en standard BCA Protein-analyssats för att fastställa protein koncentrationer av synaptosomes för justeringar från räknas per minut (cpm) till fmol/min/μg och korrekt jämförelse av upptag mellan prover.
3. Dataanalys
- Använd data från upptaget experiment att göra en mättnad kurvan för varje grupp och beräkna graden av reaktion (V max) och konstanten Michaelis Menten (K M).
Obs: K M värdet återspeglar substrat koncentrationen krävs för att nå hälften av V max. Följaktligen, V max direkt återspeglar funktionen av DAT (maximalt upptag kapacitet), vilket beror på antalet DAT på ytan och på hur verksamheten kan moduleras av posttranslationell modifieringar och/eller samverkande proteiner samt på förändringar i ion övertoningar. K M värdet är ett indirekt mått på substrat affinitet för transportören som, framför allt också kan moduleras av posttranslationell modifieringar och/eller samverkande proteiner. För att fullt ut bedöma funktionella förändringar är det därför viktigt att direkt fastställa ytan uttryck nivåer av till exempel en yta biotinylation analys. En beskrivning av dopamin serotoninåterupptagshämmare och en vidareutveckling på innebörden av K M och V max värden har granskats av Schmitz et al. 17.
4. Högpresterande vätskekromatografi (metod 2)
- hjärnan dissektion
- etikett och väga mikrocentrifugrör; en per region per mus.
- Offra en mus i en tid av cervikal dislokation och halshuggning. Ta snabbt bort hjärnan som beskrivs i avsnitt 1.2. Utföra ytterligare dissektion omedelbart.
- Med en hjärna-matris, dissekera en 3 mm koronalt bit av striatum följt av finare bilaterala dissekering av NAc och dStr med ett hålslag. Se figur 3 för punch område.
- Överföra vävnaden till 1,5 mL mikrocentrifugrör och placera snabbt torris. Väga vävnaden och placera den tillbaka på torris omedelbart.
Obs: Vävnad vikten är viktig för koncentrationen beräkning senare. - Upprepa steg 4.1.1-4.1.4 med nästa musen.
Obs: Placera vävnaden på 80 o C tills vidare bearbetning eller genast fortsätta till vävnad behandling.
5. Vävnad förberedelse
- slå på centrifug att låta det svalna före till 4 ° C
- bereda homogenisering lösning (0,1 N perklorsyra (HClO 4)) och hålla på ice.
- Använda homogenisering lösning, förbereda en färsk 0,1 pmol/μL dopamin standard från 1 mM stamlösning (en 10.000 x spädning).
Obs: Stamlösning bereds genom att lösa upp dopamin i homogenisering buffert en lager koncentration på 1 mM, som kan hållas vid 20 ° C i ca en månad. Om andra områden av hjärnan som är av intresse, koncentration av standarden kommer att ändras, sedan andra hjärnområden inklusive prefrontral cortex, hippocampus, substantia nigra och ventral tegmental area äger upp till 100 gånger mindre DA jämfört striatum. - Lägga till 500 μL homogenisering lösning till varje prov (dvs NAc och dStr vävnad; avsnitt 4.1) och homogenisera prover med hjälp av en ultra-Homogenisatorer på full fart för cirka 30 s. hålla provet i isvatten under homogenisering. Mellan varje prov, rengör den ultra homogenisatorn med vatten (full fart för 30 s).
- Centrifugera proverna för 30 minuter vid 4 ° C, 14.000 x g.
- Överföring ungefär 200 μL prov till ett glas 0,22 μm filter (1 cm diameter) med en 1 mL Plastspruta.
Obs: Användning av glas filter är inte viktig, så länge de filter som valt är 0,22 μm till de höga molekylvikten ämnena tas bort. - Analysera prover med elektrokemisk detektion (EG)-HPLC metodik 18 som beskrivs i avsnitt 6.
6. Högpresterande Liquid Chromatography analys
- förbereda följande lösning för mobil fas: natriumacetat 55 mM, octanesulfonic syra 1 mM, Na 2 EDTA 0,1 mM, acetonitril 8%, ättiksyra 0,1 M, pH = 3.2.
Obs: Justera pH med 0,1 M ättiksyra. Det är viktigt att vara exakt med pH. Lösningen ska vara degassed av den on-line degasser (integrerad del av systemet för HPLC). Göra 2 L av Rörlig fas och ändra den en gång i månaden (ändra det när bullret blir märkbar). På grund av fluktuationer tar det ca 24 h att justera efter omväxlar den mobila fasen. - Set-up av detektor:
- Set volt utgång till 700 mV och temperatur för 32 ° C på detektorn ugnen; detta är mycket viktigt. Gör en rad program använder Onlinehandbok. Se manualen för ytterligare information). Lägga till tid programmet enligt tabell 2.
Obs: I denna studie, programmet är sätta till automatisk ändra nuvarande på set retentionstiderna, att hålla HPLC med optimal aktuella och att hålla topparna av kromatogrammet som förstorade som möjligt, men ändå inom Visa. Detta har optimerats för striatum hjärnan lysates från möss.
- Set volt utgång till 700 mV och temperatur för 32 ° C på detektorn ugnen; detta är mycket viktigt. Gör en rad program använder Onlinehandbok. Se manualen för ytterligare information). Lägga till tid programmet enligt tabell 2.
- När programmet har lagts till detektorn, göra en 3 punkt kalibreringskurva, genom att injicera standarden tre gånger (5, 10 och 15 μL).
Obs: Standard (10 μL (10 μL x 0,1 pmol/μL = 1 pmol DA)) ska injiceras varje tionde prov, och prov kalibrerad till närmaste standard. Finjustera systemet dag föregående genom att justera standarden 3-punkt, och kontrollera om kromatogrammet kommer ut inom det förväntade intervallet. Om betydande buller observeras, ändra den mobila fasen. Om en topp är högre än 990 mV sedan åter injicera provet i en lägre volym, eller göra ett nytt urval program och en ny standardkurva. Detektionsgränsen mäts som 3 gånger buller värdet i mV till lägsta toppvärdet injiceras för varje standard (NA, DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT och 5-HT).- Set-up systemet genom att öppna LC lösningen och aktivera analys 1, detta börjar i online-läge. Ange användar-ID och lösenord och klicka på ok. Vänta på LC lösande till förbinda till instrument. Gå till batchregistret och fylla i informationen (t.ex., Provtyp: okänd för prover och std för standard, analystyp: det QT, inj volym: 10, ISTD amt: nivå 1 con). Spara filen (gå till Arkiv - > Spara kommandofil som - > sparar).
- Göra systemet injicera det första provet genom att trycka på ' starta Batch '. Detta kommer att resultera i injektion av 10 μL prov av autosampler med ett lösningsmedel leverans modul.
Obs: Använd en pump flödeshastighet av 0,15 mL/min och en C18 kolumn med omvänd fas. Här användes en amperometrisk detektor för elektrokemisk detektion. Glasartad kol elektroden ska anges till 0,8 V med en Ag/Granulatfyllda referenselektrod. För att analysen dopamin, använda kromatografi 3 µ ODS (3) C18 (DA 2 mm x 100 mm, partikel storlek 3 µm) att uppnå kromatografisk separation. - Extrahera de inspelade och beräknade peak områdena.
- Gå till datainsamling att följa kromatogrammet när proverna är klar. Gå till Lc inlägget kör analys - > valde namnet (kromatogrammet öppnar) - > Klicka på Visa. Lägg till alla topparna integreras - på baren manuell integration, > gå till data rapport och ut Läs.
Obs: Här programvaran LC lösning användes för data analys och system kontroll.
- Gå till datainsamling att följa kromatogrammet när proverna är klar. Gå till Lc inlägget kör analys - > valde namnet (kromatogrammet öppnar) - > Klicka på Visa. Lägg till alla topparna integreras - på baren manuell integration, > gå till data rapport och ut Läs.
- Från peak områden, beräkna koncentrationen av dopamin i ett prov, som följer med känd koncentration av standard:
- använda topparean för standarden (motsvarar 1 pmol) att förvärva faktor A.
- använda faktor A för att få koncentrationen av proverna.
Koncentrationen av provet (i pmol per 10 μL) = faktor A × topparea för provet - använder denna formel för att få provet koncentrationen i ng.
Provets koncentration pmol / 10 µL x 500 µL x MW av dopamin = provets koncentration i ng
prova koncentration (i ng) = provets koncentration (i pmol per 10 μL) x 500 μL x MW av dopamin - använda prov koncentrationen i ng för att få t Han prova koncentration i pg/g vävnad (prova koncentration i pg / vävnad g = pg/g vävnad).
- använda topparean för standarden (motsvarar 1 pmol) att förvärva faktor A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nuvarande DA upptag protokollet (figur 1) omfattar alla steg krävs för att utvärdera funktionaliteten i DAT i synaptosomes från möss. Våra representativa uppgifter av DA upptag metoden (figur 2) skildrar en mättnad kurva med ojusterade data (figur 2B) och justerat data (figur 2A). Mättnad kurvan visar upptag från vildtyp möss. Man skulle vanligtvis göra DA upptag för jämförelse med en mutant mus, vilket skulle leda till en mättnad kurva för varje genotyp5. I så fall kan skillnaderna mellan vildtyp och muterade möss i 2A och 2B förklaras av flera faktorer. Ju grundligare experimenter är efter varje steg av protokollet, mindre skillnaden finns mellan föreställande raw (2B) och protein justeras (2A) data. The Most uppenbara skäl för skillnader är i) otydliga vägning av vävnaden i steg 1.2.6, ii) förlust av vävnad medan överföringen till och från homogenisering glas i steg 1.2.8-1.2.10 och iii) vaghet när du överför supernatanten i steg 1.2.13 och ta bort supernatanten i steg 1.2.14. Vi rekommederar en förberedande experiment i vildtyp möss för bättre precision.
Dopamin EG-HPLC-metoden (figur 3) omfattar alla steg som krävs för att bedöma mängden DA i dStr och NAc av möss. Våra representativa data (figur 4 och tabell 3) skildrar resultatet av ett experiment som utförs på vildtyp möss.
Figur 1: Schematisk arbetsflöde som skildrar de olika stegen i synaptosomal DA upptaget experimentera protokollet. Musen offras av cervikal dislokation följt av hjärnan dissektion och placering i en hjärna-matris. En 3 mm tjock koronalt skiva är dissekeras från hjärnan, och fina dissektion utförs av en bilateral punch av ett litet område omedelbart under corpus callosum. Dorsala striatum är homogeniseras i 1 mL homogenisering buffert av mekaniska störningar följt av 10 min centrifugering vid låg hastighet. Supernatanten överförs till en ren slang och centrifugeras vid hög hastighet i 20 min. Pelleten, som innehåller synaptosomes, är återsuspenderade och redo för upptag experimentet. Upptagning utförs genom att lägga till exemplar av olika [3H]-DA koncentrationer, alltifrån en slutlig koncentration av 0,031 till 1 μM. Dessutom läggs de varierande koncentrationerna av tritiummärkt DA till ett kontrollprov innehållande 500 μM kokain. Slutligen, proverna räknas i en beta-räknare och analys av data utförs avslöjar mättnad kurvan för DAT. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa resultat från en synaptosomal DA upptag experiment av fyra C57Bl/6 vildtyp möss från en Drd1a-cre mus stam. (A) representativa uppgifter som skildrar mättnad kurvan av DA upptag genom DAT synaptosomal preparat från vildtyp möss (n = 4). Svarta prickar är värdena för fyra möss visas separat, den gröna kurvan visar hur data skulle normalt vara skildras genom att kombinera data från 4-6 möss per grupp. Denna graf kombinerar data från fyra möss. (B) mättnad grafen av rådata, utan att justera för faktiska proteinkoncentration av proverna. Huvudsak är det den ojusterade versionen av data i A. (C) kontrollera data. Denna graf visar räkningarna från kokain-innehållande proven, som används för att subtrahera bakgrunden från upptag data. Denna kontroll är nödvändigt att avgöra tillförlitligheten i uppgifterna som upptag, men sällan visas i artiklar. Om informationen av någon anledning inte visar linjäritet, anger ett kritiskt problem med utformningen, som behöver identifieras och lösas för att härleda allt från data. R kvadrat: n1 = 0.9852, n2 = 0.9584, n3 = 0.9606, n4 = 0.9913. (D) Histogram visar upptag kapacitet av DAT (VMAX). VMAX = 43,13 ± 3.2 fmol/min/μg protein). Data visas som medelvärde ± SEM. (E) Histogram visar KM för DAT vara 0,1 ± 0,03 μM väl motsvarar den roterande disk voltametri metod som skildrar KM värden av DAT vara 0.6 μM19. KM värdet 0,1 μM också motsvarar väl det KM 0,22 μm som har erhållits genom stimulering modeller av stimuleras DA spill i striatum20,21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk arbetsflöde som skildrar de olika stegen i protokollet högpresterande vätskekromatografi. Musen offras av cervikal dislokation följt av hjärnan dissektion och placering i hjärnan matris. En 3 mm tjock koronalt skiva är dissekeras från hjärnan, och fina dissektion utförs genom bilateralt stansning två mindre områden, att dela striatum i dStr och NAc. Vävnad är homogeniserad, följt av snabb centrifugering. En standard med kända DA koncentrationer samt supernatanterna prover körs i HPLC, producerar kromatogrammen. Områdena av de olika topparna används för att beräkna koncentrationen av DA i de prover som skildras i ett histogram. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat av högpresterande vätskekromatografi experiment. (A), HPLC kromatogrammet för 10 μL prov från dStr injiceras en C18 (2 x 100 mm) kolumn som används för små molekyler. Retentionstiderna; 3.7 min för noradrenalin (NA), 6,7 min för dihydroxyphenylacetic syra (DOPAC), 8,3 min för DA, 10,7 min för 5-hydroxyindoleacetic acid (HIAA), 15,3 min för homovanillic acid (HVA), 18,8 min för 3-methoxytyamine (3-MT) och 20,8 min för 5-hydroxtryptamine (5-HT). Endast värden för DA topparna beräknas i denna studie. (B) Histogram visar koncentrationen av DA i NAc och dStr baserat på chromatrogram. HPLC-analysen av striatum områden inklusive dStr och NAc i C57BL/6 möss (n = 7). Data visas som medelvärdet± SEM. 
indikerar en ändring i motstånd och har lagts till kromatogrammet manuellt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 10 | 5 | 2.5 | 1,25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1,25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1,25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 + coc | 5 + coc | 2.5 + coc | 1.25 + coc | 0,62 + coc | 0,31 + coc |
Tabell 1: Mikrocentrifug rör layout för synaptosomal beredning.
| Tid | Utbud | Filtret | Ventil | Auto zero | Offset | E-cellen |
| 0 | 1nA | 0,5 Hz | Ladda | inte | 30% | 0,7 V |
| 0,2 | 1nA | 0,5 Hz | Ladda | ställa in | 30% | 0,7 V |
| 5 | 500pA | 0,5 Hz | Ladda | inte | 30% | 0,7 V |
| 5.2 | 500pA | 0,5 Hz | Ladda | ställa in | 30% | 0,7 V |
| 9,4 | 200pA | 0,5 Hz | Ladda | inte | 30% | 0,7 V |
| 9,6 | 200pA | 0,5 Hz | Ladda | ställa in | 30% | 0,7 V |
| 12 | 100pA | 0,5 Hz | Ladda | inte | 30% | 0,7 V |
| 12.2 | 100pA | 0,5 Hz | Ladda | ställa in | 30% | 0,7 V |
| 16.2 | 50pA | 0,5 Hz | Ladda | inte | 30% | 0,7 V |
| 16,4 | 50pA | 0,5 Hz | Ladda | ställa in | 30% | 0,7 V |
| Sluttid 25 min | ||||||
Tabell 2: HPLC tid program används i denna studie.
| Topp # | Ret. tid | Område | Höjd | Området % | Höjd % |
| 1 | 3 745 | 230451 | 18500 | 0.299 | 0.626 |
| 2 | 6,691 | 5573485 | 382143 | 7,228 | 12,922 |
| 3 | 8,336 | 13209342 | 510378 | 17,131 | 17,258 |
| 4 | 10,760 | 16443198 | 831182 | 21,325 | 28,106 |
| 5 | 15 344 | 7129795 | 282473 | 9 247 | 9,552 |
| 6 | 18,830 | 11279424 | 346248 | 14,628 | 11,708 |
| 7 | 20,846 | 23241754 | 586419 | 30,142 | 19,829 |
| Totalt | 77107450 | 2957344 | 100 000 | 100 000 |
Tabell 3: Peak analys visar området och höjden på de olika topparna som används för att beräkna de koncentrationer som visas i Figur 4B .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver användbar experimentella protokoll för att avgränsa DA homeostas i någon musmodell av val. Vi tillhandahåller detaljerade protokoll för mäta nivåer av DA i hjärnvävnad från möss med HPLC och synaptosomal DA upptag för att bedöma funktionella DA transport genom DAT. Procedurer, protokoll och gränser för HPLC experiment och synaptosomal DA upptag analys kommer att utarbetas nedan.
Protokollet synaptosomal upptag kan ge användbar insikt att funktionaliteten i DAT. kombinerat med en surface biotinylation experiment13, kunskap om det totala beloppet, till markytan och funktionalitet av DAT kan erhållas. Tanke på den stora rollen DAT och dess påverkan på DA överföring och sitt deltagande i olika sjukdomar, har det varit ett viktigt mål att upprätta analyser som kan modellera DAT funktion. En av fördelarna med synaptosomal DA upptag experimentet är att det kan vara utförda inlägg i vivo manipulationer som vid chemogenetic manipulation som olika i vivo läkemedelsbehandlingar eller beteendevetenskaplig utbildning utöver utredningar på genetiskt modifierade möss. Missbruksbehandling kan utföras efter synaptosomal förberedelse, i stället för i vivo om program, vilket gör det möjligt att testa effekten av läkemedel på DAT direkt22.
Alternativ till utföra synaptosomal DA upptaget, är att utföra upptag experiment på DAT transfekterade cellkulturer eller i neuronala kulturer naturligtvis uttrycka transportören. Cell kultur analyser kan vara att föredra för inledande utredningar av olika modifieringar av DAT23, neuronala primära kulturer med endogena transporter får föreskriva en mer fysiologiskt trovärdig bild av transportören funktion i vivo. Även om neuronala kulturer görs direkt från djur, finns det fördelar med att använda synaptosomes istället. Neuronala kulturer är oftast gjorda av prenatal eller omogna nervceller, som kan påverka funktion och uttryck för DAT, synaptosomal preparat utgör fysiologiska preparat som kan erhållas från vuxna och även gamla djur utan svårigheter6,14.
Det finns flera fördelar med att använda det synaptosomal upptag experimentet för att undersöka funktionen av DAT, men viktiga begränsningar måste beaktas. Synaptosomes har begränsad bärkraft6. Att hålla dem på is är viktigt att få pålitliga resultat med låga variationer. Om hållit på is och bidragit med nödvändiga näringsämnen, renat synaptosomes är livskraftig i timmar och ta upp och frigöra signalsubstanser effektivt15. Det är möjligt att frysa synaptosomes, men metoden för frysning är av stor vikt15. Små variationer i experimentella förfarandet kan leda till omfattande variationer i resultatet. Därför, experimentella protokoll bör optimeras på vildtyp villkorar (e.g. vildtyp möss) tills reproducerbara resultat och sedan jämförelser kan göras efter olika genetiska eller farmakologiska manipulationer. Synaptosomal DA upptag-analysen är ett enkelt, pålitligt och giltigt experimentella verktyg att förvärva reproducerbara data med en mycket låg variation i en viktig parameter i DA homeostas, DAT funktionalitet (figur 2A). Begränsningarna är kraftigt uppvägs av fördelarna med att kunna utföra experimentet på bevarade nervändar från vuxna möss6.
De för närvarande används metoderna för att analysera DA nivåer i vävnad stöds av histochemical metoder utvecklats på 1950-talet. Betydelsen av att utveckla metoder som HPLC att mäta DA, har varit uppenbart sedan upptäcka betydande minskningen av DA i de basala ganglierna av Parkinson-patienter, därmed grundandet principen om att behandla patienter som lider av Parkinson med L-DOPA24. Sedan denna upptäckt, mer avancerade tekniker för vävnadsanalys av DA nivåer har utvecklats, men som med alla andra tekniker finns det fallgropar. En av de stora fallgroparna av dessa tekniker är instabil arten av monoaminer (dopamin, noradrenalin och serotonin). Hur man korrekt förbereda vävnad preparatet att undvika förlust av monoaminer har diskuterats i detalj av Atack o.a. 25 och kommer inte att diskuteras vidare i denna artikel, utom att betona vikten av att placera vävnaden på torris direkt efter dissekering och inte lägga homogenisering lösning förrän omedelbart innan HPLC-analysen. Från vår erfarenhet, kan vävnad förvaras vid-80 oC i upp till en månad utan försämring av DA om ingen lösning har lagts till. Atack et al diskutera vävnad förberedelse för metoder alltifrån fluoro spektrometriska metoden till avancerade HPLC-metoder som tillåter en detektionsgränsen ner till 3 ng/mL vävnad25. Den metod som vi beskriver i detta dokument är baserad på samma principer. Dagens avancerade teknik möjliggör mer förfinade analyser och upptäckt av DA nivåer vid fmol koncentrationer. Med hjälp av en fluorescerande HPLC-teknik, kan ännu mer robust Mao analys erhållas26. På grund av robustheten av metod, HPLC används allmänt att få information om förändringar i nivåer av monoaminer och prekursorer och metaboliter i olika regioner av hjärnan, såsom DA i striatum, att validera sjukdomsmodeller för Parkinson i möss, apor och minigrisar27,28,29. Här, vi utför experimentet på vävnad från dStr och NAc, men metoden är även lämplig för andra DA-innerveras hjärnområden, såsom prefrontral cortex, hippocampus, substantia nigra och ventral tegmental area 30. I dessa områden blir en mer utspädda standardprov nödvändiga för korrekt fastställande av DA nivåer. Vår analys av DA innehåll visar högre nivåer i striatum subcompartments jämfört med tidigare undersökningar, men detta kan förklaras experimentellt. Först har vi dissekerade två delar av striatum (NAc och dStr) i motsats till undersöka hela striatum, som kan redovisa skillnaden jämfört med tidigare rapporter12,31. Striatum mätningar kommer att ha lägre DA nivåer jämfört med mätningarna i ren dStr, eftersom nivåer i NAc är betydligt lägre än dStr. Vi har även tidigare studier bekräftar vår DA nivåer5.
Varje test har sina begränsningar. Analyser utvecklas i ett försök att modellera och ge information om specifika aspekter av en cellulär process, och de kan lämna ut möjliga viktiga detaljer eller ge en alltför generaliserad bild av den verkliga processen. En viktig begränsning att överväga när du väljer HPLC, är att det bara ger en ögonblicksbild av signalsubstansen nivåer. Dock är signalsubstansen nivåer benägna att fluktuera under en dag, vecka eller månad32,33, vilket understryker behovet av att erhålla prover på ett snävt tidsfönster, istället för att jämföra proverna timmar, dagar eller månader isär som även om de togs inom samma timme. Dock kan HPLC data ge värdefull information om DA innehåll och avslöja avvikande förändrade nivåer såsom de framgår av de DAT-KO och DAT-KD transgena möss linjer, där genetiska radering eller knock-down av DAT kraftigt påverkar DA homeostas av störande DA återupptaget. Dessa data furthermore Visa att striatum DA pooler utgörs främst av beslagtagna DA snarare än de-novo syntetiseras DA och att påfyllning av intracellulära striatum DA pooler är kritiskt beroende på återupptaget processen12,34. En viktig fallgrop att överväga är att vävnad dissektion kan begränsa en mer specifik och korrekt beskrivning av DA innehåll i ett hjärnområde vid varje given tidpunkt. Variationen i DA koncentration i olika hjärnområden varierar kraftigt. Riktigheten av dissektion är därför av stor betydelse, som kan förbättras genom att dissekera mindre områden för att säkerställa att endast vävnad från området av intresse ingår.
En mer funktionell åtgärd av endogena DA pooler kan analyseras med mikrodialys. Detta har utvecklats och pionjärer av Ungerstedt et al. använda vertikala mikrodialys sonden35. Mikrodialysteknik gör det möjligt att mäta Mao koncentrationer i hjärnan av fritt rörliga djur och i olika hjärnstrukturer. En annan fördel med mikrodialysteknik över vävnad provtagning genom HPLC är möjligheten att mäta och följa Mao förändringar över ett stort fönster tid. Detta är en stor fördel jämfört med provtagning av hjärnvävnad där endast en tidpunkt är möjlig per djur som i protokollet HPLC. Medan, mikrodialys kan ge insikt i utgivningen av DA, kommer att vävnad provtagning följt av HPLC istället avslöja förändringar i endogena pooler och vesikulär DA. För att få information i realtid om DA release kinetics i olika områden i hjärnan, metoder som snabbt-scan cyklisk voltametri36,37 eller höghastighets kronoamperometri38 kan genomföras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av det UCPH 2016 Program of Excellence (U.G., A.R., K.J.), den Lundbeck Foundation (M.R.) Lundbeck stiftelsen centrum för Biomembranes i nanomedicin (U.G.), nationella institutet för hälsa bidrag P01 DA 12408 (U.G.), danskan Rådet för oberoende forskning - medicinska vetenskaper (U.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
References
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
- Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
- Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
- Hornykiewicz, O.
- Schultz, W.
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
- Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
- Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Whittaker, V. P.
- Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D.
- Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
- Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
- Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
- Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
- Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
- Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
- Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
- Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
- Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
- Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
- Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
- Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
- Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
- Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
- Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
- Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
- Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).
