Summary
Synaptosomal Dopamin Aufnahme und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie dar experimentelle Analysetools, Dopamin Homöostase bei Mäusen durch die Beurteilung der Funktion der Dopamin-Transporter und Dopamin-Spiegel in striatalen Gewebe zu untersuchen, bzw.. Hier präsentieren wir Protokolle zur Messung Dopamin Gewebe Inhalt und die Funktionalität der Dopamin-Transporter zu beurteilen.
Abstract
Dopamin (DA) ist eine modulierende Neurotransmitter, die Steuerung der Motorik, Belohnung Prozesse und kognitive Funktion. Wertminderung (DAergic) dopaminergen Neurotransmission ist stark verbunden mit mehreren zentralen Nervensystems-assoziierten Erkrankungen wie Morbus Parkinson, Aufmerksamkeit-Defizit-Hyperaktivitäts-Störung und Drogensucht1,2 ,3,4. Abgrenzung von Krankheitsmechanismen, bei denen DA Ungleichgewicht hängt entscheidend von Tiermodellen, Aspekte der Krankheiten imitieren und somit Protokolle, die bestimmte Teile der DA Homöostase zu beurteilen sind wichtig, damit die neue Einblicke und mögliche therapeutische Ziele für diese Krankheiten.
Hier präsentieren wir zwei nützliche experimentelle Protokolle, die in Kombination bieten eine funktionale Auslesung des DAergic Systems bei Mäusen. Biochemische und funktionelle Parameter auf DA Homöostase werden durch Bewertung der DA Ebenen und Dopamin-Transporter (DAT) Funktionalität5gewonnen. Bei der Untersuchung von DA-System ist die Fähigkeit, zuverlässig endogenen DA von Erwachsenen Gehirn messen unerlässlich. Deshalb präsentieren wir Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ausführen auf Gehirngewebe von Mäusen zu ermitteln der DA. Wir führen das Experiment auf Gewebe aus dorsalen Striatum (dStr) und Nucleus Accumbens (NAc), aber die Methode ist auch geeignet für andere DA innerviert Hirnareale.
DAT ist essentiell für Reuptake von DA in die präsynaptischen Terminal, dadurch Steuerung der zeitlichen und räumlichen Aktivität von freigegebenen DA. Zu wissen, die Ebenen und die Funktionalität der DAT im Striatum ist von großer Bedeutung bei der Beurteilung DA Homöostase. Hier bieten wir ein Protokoll, das ermöglicht, gleichzeitig Informationen über Ebenen Oberfläche und Funktion mit einem synaptosomal6 DA Aufnahme Assay abzuleiten.
Aktuelle Methoden in Verbindung mit standard Immunoblotting Protokolle geben die Forscher mit entsprechenden Tools zur Charakterisierung des DAergic-Systems.
Introduction
Dopamin (DA) ist eine modulierende Neurotransmitter für motor Verhalten, Belohnung und kognitive Funktion1,7,8,9von entscheidender Bedeutung. Ungleichgewichte in DA Homöostase sind in mehreren neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Aufmerksamkeits-Defizit-Hyperaktivitäts-Störung, Drogensucht, Depressionen und Parkinson-Erkrankung1verwickelt. DA erscheint aus der präsynaptischen Neuron in den synaptischen Spalt, wo er bindet an und aktiviert Rezeptoren auf der Prä- und postsynaptischen Membran, dadurch weiter vermitteln das Signal. Das Niveau der DA in der Synapse nach Veröffentlichung räumlich und zeitlich gesteuert DAT3,10. Der Transporter Sequester DA aus dem extrazellulären Raum und trägt somit physiologische DA Level3,11. Genetischer Entfernung von DAT bei Mäusen verursacht einen Hyperdopaminergic Phänotyp gekennzeichnet durch erhöhte synaptische DA, Abbau der intrazellulären DA Pools und tief greifende Veränderungen im postsynaptischen DAergic Signalisierung10,12.
Hier zwei getrennte Protokolle werden vorgestellt, eine Methode zu messen DA Gewebe Inhalten und anderen zu beurteilen, die Funktionalität der DAT.-kombinierte mit der Oberfläche Biotinylierungen Assay von Gabriel Et Al.13 beschrieben diese beiden Methoden geben Auskunft über DA Inhalte und funktionalen Ebenen der DAT für eine gründliche Bewertung der DA Homöostase. Mit diesen Methoden kann DA Homöostase der verschiedenen transgenen Mäusen oder Krankheitsmodelle charakterisiert und beschrieben werden. Diese Werkzeuge wurden implementiert und optimiert und sind standard in unseren Labors. Aktuelle Tests dienten dazu, die Konsequenzen auf die DA Homöostase der Änderung der C-terminalen DAT14 oder mit dem Ausdruck Cre-Rekombinase unter die Tyrosin-Hydroxylase (TH) Veranstalter 5zu untersuchen.
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Protocol
die Richtlinien des dänischen Tier Experimente Inspectorate (Erlaubnis Zahl: 2017-15-0201-01160) folgte und Experimente durchgeführt, in einer voll AAALAC akkreditierten Einrichtung unter der Aufsicht von einem lokalen Tierschutz Ausschusses.
1. Synaptosomal Dopamin-Aufnahme (Methode 1)
Hinweis: dieses Protokoll ist für parallele Bewertung der beiden Gehirne, aber synaptosomal DA Aufnahme Experimente mit vier Gehirne in erfolgreich einsetzbar parallele.
- Röhren Vorbereitungen
- Label 48 1,5 mL Mikro-Zentrifuge pro Tabelle 1 (24 für jedes Gehirn). Verwenden Sie unterschiedliche Farben für die Röhren gehören zu jedem Gehirn um Verwechslungen zwischen den Proben zu vermeiden
- Label 51 funkeln Röhren #1-51.
- Ort-Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf Eis. Dies wird verwendet, um die Gehirne gekühlt zu halten.
- Schalten Sie die Zentrifuge zu 4 vorher abkühlen lassen ° C.
- Pre wiegen zwei Mikro-Zentrifuge-Rohre, um die genaue Gewebe Gewicht während der synaptosomal Vorbereitung (Abschnitt 2.6) bekommen.
- Vorbereiten Homogenisierung Puffer durch das Mischen von 4 mM HEPES und 0,32 M Saccharose. Den pH-Wert 7,4 einstellen und halten auf Ice
Hinweis: Homogenisierung Puffer kann in Aliquote bei-20 ° C aufbewahrt und am Tag des Experiments aufgetaut. - Vorbereiten-Aufnahme-Puffer durch die Kombination der folgenden: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 5 mM 1 mM Ascorbinsäure (0,194 g/L), 5 mM D-Glukose (0,991 g/L). PH auf 7,4 mit NaOH (führt zu einer Natriumkonzentration von ca. 130 mM) einstellen und halten auf Ice
Hinweis: Für 2 Gehirne, bereiten Sie 1500 mL-Aufnahme-Puffer. Bereiten Sie Aufnahme-Puffer als einem 10-fach Stammlösung ohne Ascorbinsäure und Glukose gehalten bei 4 ° C. Make 1 x Arbeitslösung frisch am Tag, Ergänzung mit Ascorbinsäure und Glukose. PH mit NaOH auf 7,4 einstellen. - -Prepare-Aufnahme-Puffer + Liganden durch die Kombination der folgenden: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 5 mM 1,2 mM CaC l2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM Ascorbinsäure (0,194 g/L), 5 mM D-Glukose (0,991 g/L), 1 μM Pargyline, 100 nM Desipramin, 10 nM Brenzcatechins-O-Methyl-Transferase (COMT)-Hemmer. Auf pH 7.4 mit NaOH einstellen und halten Sie auf Ice
Hinweis: Verwenden Sie 50 mL-Aufnahme-Puffer und fügen Sie Liganden hinzu. Pargyline wird hinzugefügt, um zu verhindern, Abbau von DA durch Oxidation durch Monoamin-Oxidase (MAO). COMT-Hemmer (RO-41-0960) wird hinzugefügt, um Abbau von DA (Katecholamine im Allgemeinen) durch COMT zu verhindern. Desipramin wird hinzugefügt, Aufnahme durch die Noradrenalin und Serotonin-Transporter zu hemmen, und damit die Aufnahme Ergebnisse spezifische für DAT - -Prepare-Aufnahme-Puffer + Ligand + Kokain durch die Kombination der folgenden: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM Ascorbinsäure (0,194 g/L), 5 mM D-Glukose (0,991 g/L), 5 mM 1 μM Pargyline 100 nM Desipramin , 10 nM COMT-Hemmer, 500 μM Kokain. PH auf 7,4 mit NaOH einstellen und halten auf Ice
Hinweis: Verwenden Sie 7 mL-Aufnahme-Puffer + Ligand und fügen Sie Kokain hinzu. Kokain wird hinzugefügt, erhalten eine Hintergrundmessung unspezifische DA Aufnahme subtrahieren aus den Daten verlassen nur die DAT-spezifische Aufnahme (da SERT und NET durch Desipramin gehemmt werden, wie oben beschrieben). Alternativ kann ein sehr potenter und spezifische DAT Inhibitor GBR-12935, stattdessen verwendet werden.
Wichtig: Halten Sie alles auf Eis von nun an .
- Synaptosomal Vorbereitung
- Opfern, eine Maus zu einem Zeitpunkt durch zervikale Dislokation und Enthauptung.
- Schneiden Sie die Haut mit einer Schere zu offenbaren den Schädel und überschüssige Gewebe Posterior der Schädel links von Enthauptung abgeschnitten. Schneiden Sie den Schädel mit kleinen geraden Schere entlang die Sutura Sagittalis anterior wie möglich landen.
- Legen Sie die beiden Scheren-Tipps in jedes Auge der Maus und schneiden durch Schädel, den Rest des Schädels und der intakten Gehirn zu entfernen. Schnell entfernen Sie das Gehirn zu und legen Sie sie in eiskaltem PBS. Dies wird es kalt zu halten, während die zweite Gehirn seziert.
- Mit einer Matrix Gehirn sezieren ein 3 mm koronalen Stück des Striatums (anterior-Posterior: +1,5 mm bis-1,50 mm) gefolgt von feiner Dissektion mit einem Puncher. Siehe Abbildung 1 für Punsch Bereich.
- Halten das Gewebe auf dem Eis zu allen Zeiten voran.
- Übertragen die Gewebe auf eine 1,5 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen zum Wiegen von.
Hinweis: Das Gewicht wird in Schritt 1.2.14 verwendet werden. - Wiederholen Schritt 1.2.1-1.2.6 für das zweite Gehirn.
- Nach Gewicht für beide Gehirne erteilt worden ist, das Gewebe auf eine Homogenisierung Glas mit 1 mL eiskaltes Homogenisierung Puffer übertragen.
- Homogenisieren des Gewebes mit einem motor angetriebenen Stößel bei 800 u/min, 10 sogar Anschläge.
Hinweis: Einen Streich gleich eins rauf und runter handeln, des ersten Strichs sollte ca. 5 s, die folgenden 3-4 S. Homogenisierung in isotonischen Medium wichtig ist, zu verhindern, Platzen der Synaptosomes 6. Mit entsprechenden Kraft und isotonischen Medium ermöglicht es den präsynaptischen Terminals zu versiegeln einschließenden Zytoplasma, synaptischen Vesikel, Mitochondrien und Cytoskelett 15. - Übertragen die Homogenat auf 1,5 mL-Mikro-Zentrifugenröhrchen und sammeln die restlichen Homogenat aus dem Glas Homogenisierung durch Spülen mit 0,5 mL zusätzliche Homogenisierung Puffer.
- Halten die Probe auf Eis, während Gewebe aus dem anderen Gehirn homogenisiert wird. Laufen die beiden Gehirne parallel in Schritten 1.2.12-1.2.13.
- Pellet-die Kerne und Zellen Ablagerungen durch Zentrifugieren (1.000 x g, 10 min, 4° C).
- Transfer den überstand (S1) (mit Zellmembranen und Zytoplasma) zum neuen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 16.000 x g für 20 min bei 4 ° c
- (Mit Zytoplasma) überstand verwerfen und Aufschwemmen Pellet (P2) (mit groben Synaptosomes) in 40 μl Homogenisierung Puffer / mg Gewebe (bezogen auf das Gewicht bezogen im Schritt 1.2.6). Sanft den rohen synaptosomal Bruch mit einer Pipette p1000 aufzuwirbeln, da zuviel Kraft der Synaptosomes brechen wird.
Hinweis: Es ist wichtig, am Ende mit mindestens 280 μL. Wenn dies nicht der Fall ist, verdünnen mit mehr als 40 μl pro mg wird notwendig sein. Schritte 1.2.1-1.2.13 muss so schnell wie möglich durchgeführt werden, und alles, was auf Eis gehalten werden muss. Sobald die grobe Synaptosomes in Homogenisierung Puffer Nukleinsäuretablette wurden haben sie sind recht stabil, solange sie am Eis 6 , 15 , 16 gehalten werden.
2. Aufnahme-Experiment
Liganden- Hinzufügen 440 μl Aufnahme-Puffer + Kokain in die dafür vorgesehenen 12 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und 440 μl-Aufnahme-Puffer + Liganden an die verbleibenden 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Tabelle 1 für das Layout) 36.
Hinweis: Entfernen sie aus Eis 15 min vor Beginn des Experiments zu auf Raumtemperatur bringen, aber halten Sie auf Eis, bis dann, Inhibitoren zu sparen. - Prepare Sättigungskurve (Dopamin (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H Dopamin) (91.1 Ci/Mmol) bei verschiedenen Endkonzentrationen (0.031, 0,0625 0,125, 0,25, 0,5 und 1,0 μM)).
- Label sechs 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen als 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 und 0,31.
- Fügen Sie 750 μl Aufnahme Puffer + Liganden an 5 Mikrozentrifugenröhrchen mit der niedrigsten Nummer.
- Fügen 1,455.4 μL Aufnahme Puffer + Liganden, 14,6 μL Dopamin (1 mM), 30 µl 3-H Dopamin (11 μM) am Rohr gekennzeichnet 10.
- Transfer 750 μl aus der Tube gekennzeichnet 10 in das Röhrchen 5 gekennzeichnet. Gut mischen und 750 μl von dieser Röhre auf 2,5 Rohr übertragen. Wiederholen Sie diese Verdünnung mit den restlichen Rohren.
- Vorspülen Mikrofaser Glasfilter mit 4 mL-Aufnahme-Puffer nach, indem sie auf eine 12 gut Filterkorb.
- Fügen Sie 10 μL der synaptosomal Membran Aussetzung zu den ersten 24 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren (siehe Tabelle 1 für das Layout) mit 440 μl Puffer. Vortex sorgfältig und spin-down kurz um sicherzustellen, dass die Synaptosomes im Puffer untergetaucht sind. Lassen Sie 37 o C für 10 min.
Hinweis: Es ist wichtig, genau auf die Zeiten während der Aufnahme-Experiment für fairen Vergleich zwischen Gehirn zu sein. Verwenden Sie eine Stoppuhr für Präzision. - Fügen Sie 50 μL Dopamin der Konzentration 10 und 5 μM (Abschnitt 2.2), die ersten zwei Spalten und lassen bei 37 o C für 5 min mit schütteln. Halten Sie nach genau 5 min die Reaktion durch Zugabe von 1 mL eiskaltes Aufnahme-Puffer. Machen Sie dasselbe mit Konzentration 2,5 und 1,25 μM (Abschnitt 2.2) und dann mit Konzentration 0,62 und 0,31 μM.
- Proben, die vorher gespült Mikrofaser-Filter hinzufügen und mit 5 x 4 mL eiskaltes Aufnahme-Puffer waschen. Wenn die ersten 12 Proben wurden hinzugefügt, um die Filter, die Filter zu funkeln Rohre bewegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem nächsten 12 Proben.
- Wiederholen Sie Schritt 2.4-2.6 für das nächste Gehirn.
- Vorbereiten 3 Max-zählen Rohre indem ein Mikrofaser-Filter in der Unterseite des funkeln Röhren 49-51 und Hinzufügen von 25 µL der maximale Dopamin-Konzentration an der Spitze (10 μM).
- Lassen Sie alle 51 funkeln Röhren in einer Dampfhaube für 1 h.
- Add 3 mL funkeln Flüssigkeit jedes funkeln Tube und schütteln kräftig auf einen Shaker für 1 h.
- Graf [3 H]-DA in einem Beta-Zähler für 1 min.
- , Öffnen Sie das Programm und wählen Sie: Label: h-3, Platte/Filter: 4 mL Fläschchen, 4 x 6, Assay Typ: Normal und Zählzeit: 1 min.
Hinweis: Dieser Schritt kann am Folgetag wenn bequemer durchgeführt werden. Proben mit Alufolie bedeckt, über Nacht zu verlassen.
- , Öffnen Sie das Programm und wählen Sie: Label: h-3, Platte/Filter: 4 mL Fläschchen, 4 x 6, Assay Typ: Normal und Zählzeit: 1 min.
- Proteinbestimmung
- verwenden ein Standardpaket BCA Protein Assay Proteinkonzentrationen von Synaptosomes für die Anpassung von Zählungen pro min (cpm) Fmol/min/μg und für den richtigen Vergleich der Aufnahme bestimmen zwischen beiden Stichproben.
3. Analyse der Daten
- Verwendung der Daten aus der Aufnahme Experiment zu einer Sättigung Kurve für jede Gruppe und berechnen Sie die Rate der Reaktion (V max) und die Michaelis Menten-Konstante (K M).
Hinweis: Die K-M-Wert spiegelt die Substratkonzentration erforderlich, um die Hälfte der V-max zu erreichen. Entsprechend gibt V max direkt die Funktion des DAT-Version (maximale Aufnahme Kapazität), richtet sich nach der Anzahl der DAT auf der Oberfläche und wie seine Aktivität moduliert werden kann durch posttranslationale Modifikationen und/oder interagierenden Proteine sowie auf Änderungen in Ionen-Gradienten. Der K-M-Wert ist ein indirektes Maß der Substrat-Affinität für die Transporter, die vor allem auch kann durch posttranslationale Modifikationen und/oder interagierenden Proteine moduliert werden. Um voll funktionale Änderungen zu beurteilen ist es daher wichtig, direkt durch zum Beispiel eine Oberfläche Biotinylierungen Assay Oberflächenexpression ermitteln. Eine Beschreibung des Dopamin Reuptake und eine Ausarbeitung über Bedeutung der K-M und V max Werte wurden überprüft, Schmitz Et Al. 17.
4. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (Methode 2)
- Gehirn Dissektion
- Label und wiegen Mikrozentrifugenröhrchen; eine pro Region per Mausklick.
- Opfer eine Maus zu einem Zeitpunkt durch zervikale Dislokation und Enthauptung. Schnell das Gehirn zu entfernen, wie in Kapitel 1.2 beschrieben. Führen Sie weitere Dissektion sofort.
- Mit einer Gehirn-Matrix, eine 3 mm koronalen Scheibe des Striatums gefolgt von feiner bilateralen Dissektion der NAK und dStr mit einem Puncher sezieren. Siehe Abbildung 3 für Punsch Bereich.
- Das Gewebe auf 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und schnell auf Trockeneis. Wiegen Sie das Gewebe und setzen Sie es sofort wieder auf das Trockeneis.
Hinweis: Das Gewebe Gewicht ist wichtig für die Konzentration Berechnung später.
Wiederholen Sie die Schritte - 4.1.1-4.1.4 mit der nächsten Maus.
Hinweis: Legen Sie das Gewebe auf 80 o C bis Weiterverarbeitung oder gehen Sie sofort zum Gewebe Verarbeitung.
5. Gewebe-Vorbereitung
- einschalten Zentrifuge bis 4 ° C Vorkühlen lassen
- bereiten Sie die Homogenisierung-Lösung (0,1 N Perchlorsäure (HClO 4)) und halten Sie auf Eis.
- Using Homogenisierung Lösung, bereiten Sie einen frisch 0.1 Pmol/μL Dopamin-Standard aus einem 1 mM-Stammlösung (10.000 X Verdünnung).
Hinweis: Der Stammlösung wird vorbereitet durch Auflösen von Dopamin im Homogenisierung Puffer Lager Konzentration von 1 mM, was etwa einen Monat lang bei 20 ° C gehalten werden kann. Wenn andere Bereiche des Gehirns von Interesse sind, Konzentration des Standards müssen geändert werden, da andere Hirnareale einschließlich prefrontral Kortex, Hippocampus, Substantia Nigra und ventralen Haubengebiet besitzen bis zu 100 mal weniger DA im Vergleich zum Striatum. - Jede Probe (d.h. NAc und dStr Gewebe, Abschnitt 4.1) 500 μL Homogenisierung Lösung hinzu und Proben mit einer Ultra-Homogenisator auf Hochtouren für ca. 30 S. halten während der Homogenisierung die Probe im Eiswasser zu homogenisieren. Zwischen jeder Probe ultra Homogenisator mit Wasser zu reinigen (mit voller Geschwindigkeit für 30 s).
- Zentrifugieren Sie Proben für 30 min bei 4 ° C, 14.000 x g.
- Transfer ca. 200 μl Probe zu einem Glas 0,22 μm-Filter (1 cm Durchmesser) mit einer 1 mL Kunststoffspritze.
Hinweis: Die Verwendung von Glasfilter ist nicht wichtig, solange die gewählte Filter 0,22 μm, hochmolekularen Substanzen zu entfernen sind. - Proben von elektrochemischen Detektion (EG) analysieren-HPLC Methode 18 wie in Abschnitt 6 beschrieben.
6. High Performance Liquid Chromatography Analyse
- bereiten die folgende Lösung für die mobile Phase: Natriumacetat 55 mM, Octanesulfonic Säure 1 mM, Na 2 EDTA 0,1 mM, Acetonitril 8 % Essigsäure 0,1 M, pH = 3.2.
Hinweis: Stellen Sie den pH-Wert mit 0,1 M Essigsäure. Es ist wichtig, genauer gesagt mit dem pH. Die Lösung sollte Degasse sein.d durch die Online-Degasser (integrierter Bestandteil der HPLC-Anlage). 2 L der mobilen Phase zu machen und etwa einmal im Monat zu ändern (ändern Sie es, wenn der Lärm bemerkbar wird). Aufgrund der schwankenden dauert es ca. 24 h nach dem Ändern der mobilen Phase anpassen. - Aufbau des Detektors:
- Satz Volt Ausgang für 700 mV und Temperatur 32 ° c auf den Detektor Ofen; Dies ist sehr wichtig. Machen Sie eine Angebot-Programm über das Online-Handbuch. Siehe das Handbuch für weitere Details). Hinzufügen des Zeitprogramms gem. Tabelle 2.
Hinweis: In dieser Studie soll das Programm sich automatisch die aktuelle am Set Retentionszeiten der HPLC auf den optimalen Strom zu halten und die Gipfeln der das Chromatogramm zu halten, da wie möglich, aber immer noch in Sichtweite erweitert ändern. Dies wurde optimiert für striatale Gehirn Lysates von Mäusen.
- Satz Volt Ausgang für 700 mV und Temperatur 32 ° c auf den Detektor Ofen; Dies ist sehr wichtig. Machen Sie eine Angebot-Programm über das Online-Handbuch. Siehe das Handbuch für weitere Details). Hinzufügen des Zeitprogramms gem. Tabelle 2.
- Wenn der Detektor das Programm hinzugefügt wurde, machen eine 3-Punkt-Eichkurve, dreimal durch die Injektion des Standards (5, 10 und 15 μl).
Hinweis: Standard (10 μl (10 μL x 0.1 Pmol/μl = 1 Pmol DA)) sollte jeden zehnten Muster und Proben auf die nächste Standard kalibriert injiziert werden. Feinabstimmung des Systems dem vor durch Anpassung des 3-Punkt-Standards, und überprüft, ob das Chromatogramm innerhalb des erwarteten Bereichs herauskommt. Bei erheblichen Lärm beobachtet wird, ändern Sie die mobile Phase. Wenn ein Peak ist höher als 990 mV dann wieder injizieren der Probe in einer geringeren Lautstärke oder machen ein neues Sortiment-Programm und eine neue standard-Kurve. Die Nachweisgrenze wird als 3-Mal den Rauschwert in mV zu den niedrigsten Spitzenwert injiziert für jeden Standard gemessen (NA, DOPAC, DA 5-HIES, HVA, 3-MT und 5-HT).- Set-up System durch Öffnen der LC-Lösung und Analyse 1; Diese beginnt in den Online-Modus zu aktivieren. Geben Sie Benutzer-ID und Kennwort, und klicken Sie auf ok. LC-Lösung zum Herstellen einer Instrumente warten. Gehen Sie auf die Batchtabelle und Dateninformationen eingeben (z.B., Probentyp: für Proben und std für standard, Analysetyp unbekannt: es QT, Inj Volumen: 10, ISTD Amt: Level 1 Con). Datei speichern (gehen Sie zu Datei - > speichern Batch-Datei als - > speichern).
- Machen das System durch drücken die ersten Probe injizieren ' Batch starten '. Dadurch wird die Injektion von 10 μl Probe durch den Autosampler mit einem Lösungsmittel Entbindungs-Modul.
Hinweis: Verwenden Sie eine Pumpenförderstrom 0,15 mL/min und einer C18-Spalte mit Umkehr-Phase. Hier wurde ein amperometrischen Detektor für elektrochemische Detektion verwendet. Die gläsernen Kohlenstoffelektrode sollte auf 0,8 V mit einer Ag/AgCl-Referenzelektrode festgelegt werden. Um Dopamin zu bestimmen, verwenden Sie Chromatographie 3 µ ODS (3) C18 (DA 2 mm x 100 mm, Partikel Größe 3 µm), chromatographische Trennung zu erreichen. - Auszug der aufgezeichneten und berechnete Peakflächen.
- Go, Datenerfassung, das Chromatogramm zu folgen, wenn die Proben beendet haben. Weiter zur post laufen Analyse - Lc > wählte den Namen der Datei (das Chromatogramm wird geöffnet) - > klicken Sie auf Ansicht. Auf der manuellen Integration-Leiste hinzufügen alle Gipfel integriert werden - > zum Datenreport und lesen ausdrucken.
Hinweis: Hier die LC-Solution-Software wurde verwendet für Daten-Analyse und Systemsteuerung.
- Go, Datenerfassung, das Chromatogramm zu folgen, wenn die Proben beendet haben. Weiter zur post laufen Analyse - Lc > wählte den Namen der Datei (das Chromatogramm wird geöffnet) - > klicken Sie auf Ansicht. Auf der manuellen Integration-Leiste hinzufügen alle Gipfel integriert werden - > zum Datenreport und lesen ausdrucken.
- Aus der Peakflächen, berechnen Sie die Konzentration von Dopamin in einer Stichprobe wie folgt mithilfe der bekannten Konzentration des Standards:
- die Peakfläche des Standards (entspricht 1 Pmol) verwenden, um Faktor A. erwerben
- verwenden Faktor A, um die Konzentration der Proben erhalten.
Konzentration der Probe (in Pmol pro 10 μL) = Faktor A × Peakfläche der Probe - diese Formel verwenden, um die Probenkonzentration in ng erhalten.
Probe Konzentration Pmol / 10 µL X 500 µL x MW von Dopamin = Probenkonzentration in ng
Probe Konzentration (in ng) = Probenkonzentration (in Pmol pro 10 μL) x 500 μL x MW von Dopamin - verwenden, die Probenkonzentration in ng um t er Probe Konzentration in Pg/g Gewebe (Probe Konzentration in Pg / g Gewebe = Pg/g Gewebe).
- die Peakfläche des Standards (entspricht 1 Pmol) verwenden, um Faktor A. erwerben
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Representative Results
Aktuelle DA Aufnahme Protokoll (Abbildung 1) beinhaltet alle notwendigen Schritte, um die Funktionalität der DAT in Synaptosomes von Mäusen zu beurteilen. Unsere repräsentativen Daten DA Aufnahme Methode (Abbildung 2) zeigt eine Sättigungskurve mit unbereinigten Daten (Abb. 2 b) und Daten (Abbildung 2A). Der Sättigungskurve zeigt Aufnahme von Wildtyp-Mäusen. In der Regel würde man DA Aufnahme für den Vergleich mit einer mutierten Maus, die zu einer Sättigungskurve für jede Genotyp5führen würde. In diesem Fall können Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutanten Mäusen in 2A und 2 b auf mehrere Faktoren zurückzuführen. Je gründlicher der Experimentator ist im Anschluss an jeden Schritt des Protokolls, der weniger Unterschied zwischen Darstellung roh (2 b) und Protein angepasst (2A) Daten. The most offensichtliche Gründe für Unterschiede sind i) ungenau wiegen des Gewebes im Schritt 1.2.6, Ii) Verlust von Gewebe während der Übertragung von und nach Homogenisierung Glas im Schritt 1.2.8-1.2.10 und Iii) Ungenauigkeit beim übertragen von überstand im Schritt 1.2.13 und Überstand entfernen in Schritt 1.2.14. Wir empfehlen einen Vorversuch in Wildtyp-Mäusen für bessere Präzision durchzuführen.
Das Dopamin EG-HPLC-Methode (Abbildung 3) umfasst alle notwendigen Schritte zur Esel Höhe der DA in dStr und NAc von Mäusen. Unsere repräsentativen Daten (Abbildung 4 und Tabelle 3) zeigen das Ergebnis eines Experiments mit Wildtyp-Mäusen durchgeführt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der verschiedenen Schritte der synaptosomal DA Aufnahme Workflow experimentieren Protokoll. Die Maus wird durch zervikale Dislokation, gefolgt von Gehirn sezieren und Platzierung in einer Gehirn-Matrix geopfert. Eine 3 mm Dicke koronalen Scheibe ist aus dem Gehirn seziert, und feine Präparation erfolgt durch einen bilateralen Schlag eines kleinen Bereichs unmittelbar unterhalb des Corpus Callosum. Dorsalen Striatum wird durch mechanische Störungen, gefolgt von 10 min Zentrifugation bei niedriger Drehzahl in 1 mL Homogenisierung Puffer homogenisiert. Überstand wird in ein sauberes Röhrchen übertragen und mit hoher Geschwindigkeit für 20 min zentrifugiert. Die Kugel, mit der Synaptosomes ist resuspendierte und bereit für den Aufnahme-Experiment. Aufnahme erfolgt durch Zugabe von Triplicates der verschiedenen [3H]-DA Konzentrationen, eine Endkonzentration von 0.031 bis 1 μM bis hin. Darüber hinaus werden die unterschiedlichen Konzentrationen von tritiumhaltigem DA eine Kontrollprobe mit 500 μM Kokain hinzugefügt. Zu guter Letzt werden die Proben in einem Beta-Zähler gezählt und Datenanalyse erfolgt offenbart der Sättigungskurve DAT. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Vertreter ergibt sich aus einem synaptosomal DA Aufnahme Experiment von vier C57Bl/6-Wildtyp-Mäusen aus einem Drd1a-Cre-Maus-Stamm. (A) repräsentative Daten Darstellung der Sättigungskurve DA Aufnahme durch die DAT synaptosomal Vorbereitungen von Wildtyp-Mäusen (n = 4). Schwarze Punkte sind die Werte der vier Mäuse ausgewiesen, die grüne Kurve zeigt, wie Daten normalerweise dargestellt werden würde, durch die Kombination von Daten aus 4-6 Mäuse pro Gruppe. Dieses Diagramm kombiniert Daten aus vier Mäuse. (B) die Sättigung Graph der raw-Daten, ohne Anpassung für tatsächliche Proteinkonzentration der Proben. Im Wesentlichen ist es die unbereinigte Version der Daten in A. (C) Steuerungsdaten. Dieses Diagramm zeigt die Grafen von Kokain-haltigen Proben, die verwendet werden, um Hintergrund aus den Aufnahme-Daten zu subtrahieren. Diese Kontrolle ist wichtig, um die Zuverlässigkeit der Aufnahme Daten festzustellen, aber wird selten in den Artikeln angezeigt. Wenn diese Daten aus irgendeinem Grund nicht Linearität angezeigt werden, bedeutet dies ein schwerwiegendes Problem mit der Einrichtung, die muss identifiziert und gelöst, um alles aus den Daten abzuleiten. R-Quadrat: n1 = 0.9852, n2 = 0.9584, n3 = 0.9606, n4 = 0.9913. (D) Histogramm zeigt die Aufnahme-Kapazität des DAT (VMAX). VMAX = 43.13 ± 3.2 Fmol/min/µg Protein). Daten sind als Mittelwert ± SEM (E) Histogramm zeigt die K-M für DAT 0,1 ± 0,03 μm entspricht der rotierenden Scheibe Voltammetrie Methode darstellen KM -Werte der DAT 0,6 μM19gut sein ausgewiesen. Ein K-M -Wert von 0,1 μM entspricht auch gut die KM -Werte von 0,22 μM, die durch Stimulation Modelle angeregt DA Überlauf im Striatum20,21gewonnen worden sein. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der verschiedenen Schritte im Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie Protokoll Workflow. Die Maus wird durch zervikale Dislokation, gefolgt von Gehirn sezieren und Platzierung im Gehirn Matrix geopfert. Eine 3 mm Dicke koronalen Scheibe ist aus dem Gehirn seziert, und feine Dissektion erfolgt durch zwei kleinere Bereiche unterteilen das Striatum in der dStr und der NAc bilateral Stanzen. Gewebe wird homogenisiert, gefolgt von schnellen Zentrifugation. Ein Standard mit bekannten DA Konzentrationen sowie Überstände aus den Proben laufen in der HPLC Chromatogramme produzieren. Die Bereiche der verschiedenen Peaks dienen zur Berechnung der Konzentration von DA in die Proben in einem Histogramm dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: repräsentative Ergebnisse eines Experiments Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie. (A) HPLC-Chromatogramm für 10 μl Probe aus dStr injiziert, eine C18 (2 x 100 mm)-Spalte, die für kleine Moleküle verwendet. Retentionszeiten; 3,7 min für Noradrenalin (NA), 6,7 min für Dihydroxyphenylacetic Säure (DOPAC), 8,3 min DA, 10,7 min für 5-Hydroxyindoleacetic Säure (HIAA), 15,3 min Homovanillic Säure (HVA), 18,8 min für 3-Methoxytyamine (3-MT) und 20,8 min für 5-Hydroxtryptamine (5-HT). Nur Werte für die DA-Gipfel werden in dieser Studie berechnet. (B) Histogramm zeigt die Konzentration von DA in NAc und dStr basierend auf Chromatrogram. HPLC-Analytik von striatalen Bereichen wie dStr und NAc C57BL/6 Mäusen (n = 7). Daten sind als Mittelwert dargestellt.± SEM 
weist auf eine Änderung im Widerstand und das Chromatogramm manuell hinzugefügt wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 + coc | 5 + coc | 2.5 + coc | 1.25 + coc | 0,62 + coc | 0,31 + coc |
Tabelle 1: Microcentrifuge Schlauch Layout für synaptosomal Vorbereitung.
| Zeit | Angebot | Filter | Ventil | Auto-zero | Ausgeglichen | E-Zelle |
| 0 | 1nA | 0,5 Hz | Laden | nicht | 30 % | 0,7 V |
| 0,2 | 1nA | 0,5 Hz | Laden | Satz | 30 % | 0,7 V |
| 5 | 500pA | 0,5 Hz | Laden | nicht | 30 % | 0,7 V |
| 5.2 | 500pA | 0,5 Hz | Laden | Satz | 30 % | 0,7 V |
| 9.4 | 200pA | 0,5 Hz | Laden | nicht | 30 % | 0,7 V |
| 9.6 | 200pA | 0,5 Hz | Laden | Satz | 30 % | 0,7 V |
| 12 | 100pA | 0,5 Hz | Laden | nicht | 30 % | 0,7 V |
| 12.2 | 100pA | 0,5 Hz | Laden | Satz | 30 % | 0,7 V |
| 16.2 | 50pA | 0,5 Hz | Laden | nicht | 30 % | 0,7 V |
| 16.4 | 50pA | 0,5 Hz | Laden | Satz | 30 % | 0,7 V |
| Ende Dauer 25 min | ||||||
Tabelle 2: HPLC Zeitprogramm in dieser Studie verwendet.
| Spitze # | I.r.-Zeit | Bereich | Höhe | Bereich % | Höhe % |
| 1 | 3.745 | 230451 | 18500 | 0,299 | 0.626 |
| 2 | 6.691 | 5573485 | 382143 | 7.228 | 12.922 |
| 3 | 8.336 | 13209342 | 510378 | 17.131 | 17.258 |
| 4 | 10.760 | 16443198 | 831182 | 21.325 | 28.106 |
| 5 | 15.344 | 7129795 | 282473 | 9.247 | 9.552 |
| 6 | 18.830 | 11279424 | 346248 | 14.628 | 11.708 |
| 7 | 20.846 | 23241754 | 586419 | 30.142 | 19.829 |
| Insgesamt | 77107450 | 2957344 | 100.000 | 100.000 |
Tabelle 3: Peak Analyse zeigt Fläche und Höhe der verschiedenen Gipfel zur Berechnung der Konzentrationen gezeigt Abbildung 4 b .
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Discussion
Dieses Manuskript beschreibt nützliche experimentelle Protokolle um DA Homöostase in jeder Maus-Modell der Wahl abzugrenzen. Wir bieten ausführliche Protokolle für Messhöhen DA im Gehirngewebe von Mäusen mit HPLC und synaptosomal DA Aufnahme um zu beurteilen, funktionale DA Transport durch DAT. Verfahren, Protokolle und Grenzwerte für die HPLC-Experiment und synaptosomal DA Aufnahme Assay werden unten ausgearbeitet.
Die synaptosomal Aufnahme Protokoll bieten nützliche Einblicke in die Funktionalität der DAT Combined mit Oberfläche Biotinylierungen Experiment13, wissen über den Gesamtbetrag, Oberfläche und Funktionalität der DAT erreicht werden. Angesichts der wichtige Rolle der DAT und ihren Einfluss auf DA Getriebe und seine Teilnahme an verschiedenen Krankheiten, war es ein wichtiges Ziel, Assays zu etablieren, die DAT-Funktion modelliert werden können. Einer der Vorteile des synaptosomal DA Aufnahme Experiments ist, dass es durchgeführten Post in Vivo Manipulationen wie z. B. auf Chemogenetic Manipulation als sowie verschiedene in-Vivo medikamentöse Behandlungen oder Verhaltensstörungen Ausbildung zusätzlich zu Untersuchungen an genetisch veränderten Mäusen. Medikamentöse Behandlung kann durchgeführt werden, nachdem synaptosomal Vorbereitung, anstelle von in Vivo falls gewünscht, die es ermöglichen, die Wirkung von Medikamenten auf DAT testen direkt22.
Alternativen zu synaptosomal DA Aufnahme durchführen soll Aufnahme Experimente an DAT transfiziert Zellkulturen oder in neuronalen Kulturen natürlich Ausdruck des Transporters. Zelle-Kultur-Assays für erste Untersuchungen in verschiedenen Modifikationen von DAT-23, bevorzugt möglicherweise, während neuronale Primärkulturen mit dem endogenen Transporter mehr physiologisch vertrauenswürdig Bild des Transporters vorsehen Funktion in Vivo. Auch wenn neuronale Kulturen direkt aus Tieren hergestellt werden, gibt es Vorteile bei der Verwendung von Synaptosomes statt. Neuronale Kulturen sind in der Regel aus pränatale oder unreife Neurone, die die Funktion und den Ausdruck der DAT, beeinflussen könnten, während synaptosomal Vorbereitungen physiologische Vorbereitungen darstellen, die von Erwachsenen und sogar alte Tiere ohne abgerufen werden kann Schwierigkeiten6,14.
Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung der synaptosomal Aufnahme-Experiment zur Funktion der DAT zu untersuchen, aber wichtige Einschränkungen müssen berücksichtigt werden. Die Synaptosomes haben Lebensfähigkeit6begrenzt. Halten sie auf dem Eis unbedingt zuverlässige Ergebnisse mit geringen Variationen zu erhalten. Wenn auf Eis gehalten und notwendigen Nährstoffe bereitgestellt, gereinigtes Synaptosomes Stunden lang lebensfähig sind und greifen und Neurotransmitter effizient lösen15. Es ist möglich, Synaptosomes Einfrieren, aber die Methode des Einfrierens ist von großer Bedeutung15. Kleine Abweichungen in der Versuchsdurchführung können zu umfangreichen Variationen im Ergebnis führen. Daher sollten experimentelle Protokolle auf Wildtyp Bedingungen (z. B. Wildtyp-Mäusen) optimiert werden bis reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden und dann Vergleiche angestellt werden können, nach verschiedenen genetischen oder pharmakologische Manipulationen. Synaptosomal DA-Aufnahme-Assay ist eine einfache, zuverlässige und gültige experimentelles Werkzeug, reproduzierbare Daten mit einer sehr geringen Variation einen wichtigen Parameter DA Homöostase, DAT-Funktionalität (Abbildung 2A) zu erwerben. Die Einschränkungen überwiegen stark die Vorteile, das Experiment auf die erhaltenen Nervenenden von Erwachsenen Mäusen6durchführen zu können.
Die derzeit verwendeten Methoden zu analysieren, DA Ebenen im Gewebe unterstützt histochemische Methoden, die in den 1950er Jahren entwickelt. Die Bedeutung der Entwicklung von Methoden wie HPLC, DA Pegel messen wurde offensichtlich seit der Entdeckung des erheblichen Rückgang von DA in den Basalganglien von Parkinson Patienten, damit das Prinzip der Behandlung von Patienten mit Parkinson Gründung mit l-Dopa24. Seit dieser Entdeckung fortgeschrittene Techniken für Gewebeanalysen DA Ebenen wurden entwickelt, aber wie bei anderen Techniken gibt es Fallstricke. Eine der großen Gefahren dieser Techniken ist die instabile Natur der Monoamine (Dopamin, Noradrenalin und Serotonin). Wie man richtig vorbereiten die Gewebe-Vorbereitung, Verlust der Monoamine zu vermeiden wurde ausführlich diskutiert von Atack Et al. 25 und nicht diskutiert werden in diesem Artikel, außer zu betonen, wie wichtig das Gewebe auf Trockeneis direkt nach Dissektion und Homogenisierung Lösung erst unmittelbar vor der HPLC-Analytik nicht hinzufügen weiter. Aus unserer Erfahrung kann Gewebe gehalten werden bei-80 oC für bis zu einem Monat ohne irgendeine Verminderung der DA keine Lösung hinzugefügt wurde. Atack Et al. diskutieren Gewebe Vorbereitung Methoden von der Fluoro spektrometrische Verfahren bis hin zu fortgeschrittenen HPLC-Methoden ermöglichen eine Nachweisgrenze bis 3 ng/mL Gewebe25. Die Methode, die wir in diesem Artikel beschreiben basiert auf den gleichen Prinzipien. Aktuelle Technologien ermöglichen verfeinerte Analyse und Erkennung von DA Ebenen bei Fmol Konzentrationen. Mit einer fluoreszierenden HPLC-Technik, erhalten Sie noch robuster Monoamin-Analyse26. Aufgrund der Robustheit der Methode HPLC ist weit verbreitet Informationen über Änderungen in der Höhe der Monoamine und Vorstufen und Metaboliten in verschiedenen Gehirnregionen wie Affen DA im Striatum, Krankheitsmodelle von Parkinson bei Mäusen, validieren und Minischweine27,28,29. Hier führen wir das Experiment auf Gewebe aus dStr und NAc, aber die Methode ist auch geeignet für andere DA innerviert Hirnareale, wie z. B. dem prefrontral Kortex, Hippocampus, Substantia Nigra und dem ventralen Haubengebiet 30. In diesen Bereichen wird eine mehr verdünnte Standardprobe notwendig für die korrekte Bestimmung der DA sein. Unsere Analyse der DA Inhalte zeigen höhere in striatalen Subcompartments im Vergleich zu früheren Untersuchungen, aber dies lässt sich experimentell. Erstens haben wir zwei Teile des Striatum (NAc und dStr) im Gegensatz zur Untersuchung der gesamten Striatums, das für den Unterschied im Vergleich zu früheren Berichten12,verantwortlich sein könnte31seziert. Striatalen Messungen müssen DA geringer im Vergleich zu Messungen in reinen dStr, da Ebenen in NAc sind wesentlich niedriger im Vergleich zu dStr. Wir haben auch frühere Studien bestätigen unsere DA Level5.
Jeder Test hat seine Grenzen. Assays werden in einem Versuch zu modellieren und geben Auskunft über bestimmte Aspekte der zellulärer Prozess entwickelt, und sie könnte möglich wichtige Details weglassen oder eine zu generalisierten Bild des realen Prozesses. Eine wichtige Einschränkung, die bei der HPLC, die Wahl ist, dass es nur eine Momentaufnahme der Neurotransmitter Ebenen bietet. Allerdings sind Neurotransmitter Ebenen über einen Tag, Woche oder Monat32,33, schwanken die Proben zu einem engen Zeitfenster, anstatt zu vergleichen Proben, Stunden, Tage oder Monate auseinander als erhalten betont anfällig Wenn sie innerhalb der gleichen Stunde aufgenommen wurden. HPLC-Daten können jedoch nützliche Informationen liefern, DA Inhalt und aberrante veränderte Ebenen zu offenbaren, so wie diejenigen die DAT-KO und DAT-KD transgenen Maus Linien, wo genetische Löschung oder Knock-down DAT DA Homöostase durch maßgeblich beeinflusst störenden DA Reuptake. Diese Daten-fuRthermore zeigen, dass striatalen DA Pools bestehen in erster Linie der abgesonderten DA anstatt de Novo synthetisiert DA und die Auffüllung der intrazellulären striatalen DA Pools hängt entscheidend von der Reuptake Prozess12,34. Eine wichtige Fallstrick zu berücksichtigen ist, dass Gewebe Dissektion eine spezifische und genaue Beschreibung des Inhalts in einem Hirnareal DA zu einem bestimmten Zeitpunkt begrenzen kann. Die Variation DA Konzentration in verschiedenen Gehirnregionen ist sehr unterschiedlich. Daher ist die Genauigkeit der Dissektion von großer Bedeutung, die verbessert werden können, durch sezieren kleinere Gebiete um sicherzustellen, dass nur Gewebe aus dem Bereich des Interesses enthalten ist.
Ein funktioneller Maß für die endogene DA Pools kann mit Mikrodialyse analysiert werden. Dies wurde entwickelt und Pionierarbeit von Ungerstedt Et Al. mit Hilfe der vertikalen Mikrodialyse Sonde35. Die Mikrodialyse-Technik macht es möglich, Monoamin-Konzentrationen im Gehirn von frei beweglichen Tieren und in verschiedenen Hirnstrukturen zu messen. Ein weiterer Vorteil der Mikrodialyse-Technik über die Gewebe-Probenahme durch HPLC ist die Möglichkeit, Messen und Monoamin-Änderungen über ein großes Fenster der Zeit folgen. Dies ist ein großer Vorteil im Vergleich zur Probenahme von Hirngewebe, wo nur ein Zeitpunkt pro Tier wie in der HPLC-Protokoll möglich ist. Während Mikrodialyse Einblick in die Freisetzung von DA zur Verfügung stellen können, wird Gewebe Probenahme gefolgt von HPLC stattdessen Veränderungen der endogenen Pools und vesikuläre DA. zeigen. Um in Echtzeit Auskunft über DA Freisetzungskinetik in verschiedenen Hirnarealen, Methoden wie schnell-Scan zyklischer Voltammetrie36,37 oder High-Speed-Chronoamperometry38 umgesetzt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die UCPH 2016 Program Of Excellence (UG, A.R, k.j.), die Lundbeck Foundation (m.r.) die Lundbeck-Stiftung Zentrum für Biomembranen in Nanomedizin (UG), die nationale Institute der Gesundheit Stipendien P01 DA 12408 (UG), die dänische Rat für unabhängige Forschung - medizinische Wissenschaften (UG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
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