Summary
Absorción de la dopamina Synaptosomal y cromatografía líquida de alto rendimiento representan experimental las herramientas de análisis para investigar la homeostasis de la dopamina en ratones mediante la evaluación de la función de transportador de la dopamina y los niveles de dopamina en el tejido estriado, respectivamente. Aquí presentamos los protocolos para medir contenido de tejido de dopamina y evaluar la funcionalidad del transportador de dopamina.
Abstract
Dopamina (DA) es un neurotransmisor modulador controla la actividad motora, los procesos de recompensa y la función cognitiva. Deterioro de la neurotransmisión dopaminérgica (DAergic) está fuertemente asociado con varias enfermedades asociadas del sistema nervioso central como la enfermedad de Parkinson, trastorno de hiperactividad de déficit de atención y adicción de drogas1,2 ,3,4. Delinear los mecanismos de la enfermedad que implica desequilibrio DA es críticamente dependiente de modelos animales para imitar los aspectos de las enfermedades, y así protocolos que evalúan las partes específicas de la homeostasis de la DA son importantes para proporcionar nuevos conocimientos y posible terapéutica objetivos para estas enfermedades.
Aquí, presentamos dos protocolos experimentales útiles que al combinarse proporcionan datos funcionales sobre el sistema de DAergic en ratones. Parámetros bioquímicos y funcionales en la homeostasis de la DA se obtienen a través de la evaluación de los niveles de DA y dopamina transportador (DAT) funcionalidad5. El sistema DA la investigación, la capacidad para medir confiablemente los niveles endógenos de DA del cerebro adulto es esencial. Por lo tanto, presentamos cómo realizar la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en tejido cerebral de los ratones para determinar niveles de DA. Realizamos el experimento en el tejido estriado dorsal (dStr) y Núcleo accumbens (NAc), pero el método es también adecuado para otras áreas del cerebro DA inervados.
DAT es esencial para la recaptación de DA en la terminal presináptica, así control de la actividad temporal y espacial de DA. liberado Conocer los niveles y funciones de DAT en el cuerpo estriado es de gran importancia cuando se evalúan DA homeostasis. Presentamos un protocolo que permite deducir simultáneamente información sobre niveles de superficie y la función usando un análisis de absorción de synaptosomal6 DA.
Los métodos actuales combinados con protocolos estándar immunoblotting proporcionan el investigador con las herramientas pertinentes para caracterizar el sistema de DAergic.
Introduction
Dopamina (DA) es un neurotransmisor modulador fundamental de comportamiento motor, recompensa y función cognitiva1,7,8,9. Los desequilibrios en la homeostasis de DA están implicados en varias enfermedades neuropsiquiátricas tales como trastorno por déficit de atención con hiperactividad, la adicción a las drogas, la depresión y la enfermedad de Parkinson1. DA se libera desde la neurona presináptica a la hendidura sináptica, donde ata a y activa los receptores en la membrana pre y postsináptica, transmitir aún más la señal. El nivel de DA en la sinapsis después de liberación es espacial y temporalmente controlada por DAT3,10. El transportador secuestra DA desde el espacio extracelular y así sostiene fisiológico DA niveles3,11. Supresión genética de DAT en ratones provoca un fenotipo de hiperdopaminérgicos caracterizado por elevados niveles de DA sinápticos, agotamiento de piscinas DA intracelulares y cambios profundos en postsynaptic DAergic señalización10,12.
Aquí, se presentan dos protocolos separados, un método a medida DA tejido contenido y otro para evaluar la funcionalidad de DAT. combinado con el ensayo de Biotinilación superficial descrito por Gabriel et al.13 estos dos métodos proporcionan información en DA niveles de contenido y funcionales de DAT para una evaluación cuidadosa de la homeostasis de la DA. Con estos métodos DA homeostasis de varios ratones transgénicos o modelos de la enfermedad puede ser caracterizada y descrita. Estas herramientas se han implementado y optimizado y son de uso estándar en nuestros laboratorios. Ensayos actuales han servido para investigar las consecuencias sobre la homeostasis de DA de alterar el C-terminal de DAT14 o expresando recombinase de Cre en la tirosina hidroxilasa (TH) promotor 5.
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Protocol
las directrices de la inspección de Experimentación Animal danés (número de autorización: 2017-15-0201-01160) fue seguido y experimentos realizados en un centro de acreditación de AAALAC completamente bajo la supervisión de un bienestar de los animales local Comité.
1. synaptosomal absorción de la dopamina (método 1)
Nota: este protocolo es para la evaluación paralela de dos cerebros, pero puede utilizarse con éxito para realizar experimentos de absorción de synaptosomal DA con cuatro cerebros en paralelo.
- Tubos de preparaciones
- etiqueta 48 microcentrífuga de 1.5 mL por cuadro 1 (24 en cada cerebro). Utilizar diferentes colores para los tubos de cada cerebro a evitar la confusión entre muestras
- centelleo etiqueta 51 tubos #1-51.
- Lugar fosfato tampón salino (PBS) en el hielo. Esto servirá para mantener cerebros fríos.
- Encender la centrifugadora permite para pre-enfriar a 4 ° C.
- Pesar los dos tubos de microcentrífuga para obtener el peso exacto del tejido durante la preparación synaptosomal (sección 2.6).
- Prepare homogeneización buffer mezclando 4 mM HEPES y 0,32 M de sacarosa. Ajustar el pH a 7,4 y mantener en hielo.
Nota: Buffer de homogeneización puede ser guardado en alícuotas a-20 ° C y descongelar el día del experimento. - Preparar buffer de absorción mediante la combinación de los siguientes: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM de MgSO 4, de 5 mM 1 mM ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM D-glucosa (0,991 g/L). Ajustar el pH a 7,4 con NaOH (conduce a una concentración de sodio de 130 mM aproximadamente) y mantener en hielo.
Nota: Para 2 cerebros, preparar 1500 mL de tampón de absorción. Preparar buffer de absorción como un 10 x solución sin ácido ascórbico y glucosa a 4 ° C. Haga 1 x solución de trabajo recién en el día, complementar con ácido ascórbico y glucosa. Ajustar el pH con NaOH a 7.4. - Preparar buffer de absorción + ligando mediante la combinación de los siguientes: 25 mM HEPES, NaCl, KCl, de 5 mM de 120 mM 1,2 mM CaC l2, 1,2 mM MgSO 4, ácido ascórbico de 1 mM (0,194 g/L), 5 mM D-glucosa (0,991 g/L), 1 μM Pargilina, desipramine 100 de nM, 10 nM Inhibidor de la catecol-O-metil-transferasa (COMT). Ajustar a pH 7,4 con NaOH y mantener en hielo.
Nota: Utilizar 50 mL de tampón de absorción y añadir ligando. Pargilina es añadido para ayudar a prevenir la degradación de DA por oxidación a través de la monoamino oxidasa (MAO). Inhibidor de la COMT (RO-41-0960) se añade para prevenir la degradación de la DA (catecolaminas en general) a través de la COMT. Desipramine se agrega al inhiben la captación a través de los transportadores de la norepinefrina y la serotonina y hacen los resultados de absorción específico para DAT. - Preparar buffer de absorción ligando + cocaína mediante la combinación de los siguientes: 25 mM HEPES, 120 mM de NaCl, KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, ácido ascórbico de 1 mM (0,194 g/L), 5 mM D-glucosa (0,991 g/L), de 5 mM 1 μM Pargilina, desipramina nM 100 , 10 inhibidor de la COMT nM, cocaína 500 μM. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH y mantener en hielo.
Nota: Use 7 mL de tampón de absorción + ligando y agregue cocaína. Cocaína se agrega para obtener una medida de fondo de absorción de DA no específicos para restar los datos, dejando sólo la absorción específica de la DAT (puesto que SERT y red son inhibidas por desipramina como se describe anteriormente). Alternativamente, puede utilizarse en lugar de otro un altamente potente y específico inhibidor de DAT GBR 12935,.
Importante: Mantener todo el hielo de ahora en .
- Preparación synaptosomal
- sacrificar un ratón a la vez por dislocación cervical y decapitación.
- Cortar la piel con unas tijeras para revelar el cráneo y cortar cualquier exceso de tejido posterior izquierda del cráneo de decapitación. Corte del cráneo con pequeñas tijeras recta a lo largo de la sutura sagittalis termina anterior posible.
- Coloque las puntas de la tijera de dos en cada ojo de ratón y corte a través del cráneo para extraer el resto del cráneo y el cerebro intacto. Rápidamente quitar el cerebro y colocarlo en PBS helado. Esto mantendrá frío, mientras que el segundo cerebro está diseccionado.
- Usando una matriz de cerebro, diseccionar una porción coronal de 3 mm del cuerpo estriado (antero-posterior: +1,5 mm a-1,50 mm) seguida por la disección más fina con un golpeador. Vea la figura 1 para el área de perforación.
- Mantener el tejido en el hielo en todo momento hacia adelante.
- Transferir el tejido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para pesaje.
Nota: Este peso será utilizado en el paso 1.2.14. - 1.2.1-1.2.6 de paso de repetir para el segundo cerebro.
- Una vez obtenido el peso de ambos cerebros, transferir el tejido a un vaso de homogeneización que contiene 1 mL de buffer de homogenización helada.
- Homogeneizar el tejido usando un mortero accionado motor a 800 rpm, 10 carreras incluso.
Nota: Un solo golpe es igual a uno arriba y abajo de acción, el primer movimiento debe ser alrededor de 5 s, los siguientes 3-4 s. homogeneización en medio isotónico es importante para evitar el estallido de los sinaptosomas 6. Uso de fuerza apropiado y medio isotónica permitirá los terminales presinápticos a citoplasma envolvente reseal, vesículas sinápticas, mitocondrias y citoesqueleto 15. - Transferir el homogenizado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y recoger el homogeneizado restantes de la Copa de homogeneización aclarando con 0,5 mL de tampón de homogeneización adicional.
- Mantener la muestra en hielo mientras se homogeneiza el tejido del cerebro de otros. Los dos cerebros se ejecutan en paralelo en pasos 1.2.12-1.2.13.
- Pellets de los núcleos y restos de células por centrifugación (1.000 x g, 10 min, 4° C).
- Transferir el sobrenadante (S1) (contiene las membranas celulares y el citoplasma) a nuevos tubos de microcentrífuga de 1.5 mL y centrifugar a 16.000 x g durante 20 min a 4 ° C.
- Descartar el sobrenadante (que contiene el citoplasma) y resuspender el precipitado (P2) (contiene sinaptosomas crudos) en buffer de homogeneización de 40 μL / mg de tejido (basado en el peso obtenido en el paso 1.2.6). Resuspender suavemente la fracción synaptosomal cruda con una pipeta p1000 como demasiada fuerza romperá los sinaptosomas.
Nota: Es importante acabar con al menos 280 μL. Si no, será necesario diluir con más de 40 μL por mg. 1.2.1-1.2.13 pasos deben realizarse tan rápido como sea posible y todo tiene que estar en el hielo. Tan pronto como los sinaptosomas crudos han sido suspendidas en buffer de homogeneización son estables mientras se mantienen en hielo 6 , 15 , 16.
2. Experimento de absorción
- 440 añadir μL tampón de absorción + ligando + cocaína el designado 12 tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y 440 tampón de absorción μL + ligando a los 36 restantes tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (ver tabla 1 para el diseño).
Nota: Quite de hielo 15 minutos antes del inicio del experimento a llevar a temperatura ambiente, pero mantener en hielo hasta entonces conservar inhibidores de. - Preparar curva de saturación (dopamina (2, 5, 6-[3H]-DA) (dopamina 3-H) (91,1 Ci/mmol) en diferentes concentraciones finales (0.031 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 y 1.0 μM)).
- Seis tubos de microcentrífuga de 2 mL de la etiqueta como 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 y 0.31.
- Tampón de absorción agregar 750 μL + ligando a los 5 tubos de microcentrífuga con número más bajo.
- Tampón de absorción 1,455.4 Añadir μL + ligando, dopamina 14,6 de μL (1 mM), 30 μl 3 H la dopamina (11 μM) al tubo etiquetado 10.
- Transferencia de 750 μL del tubo etiquetado 10 al tubo etiquetado 5. Mezclar bien y transferir 750 μL de este tubo al tubo de 2.5. Repita esta dilución con los tubos restantes.
- Pre-enjuague los filtros de microfibra de vidrio con 4 mL de tampón de absorción después de poner en un cubo de 12 filtro bien.
- Añadir 10 μL de la suspensión de membrana synaptosomal en las primeras 24 1,5 mL micro-centrifugar los tubos que contiene tampón μL 440 (ver tabla 1 para el diseño). Vortex con cuidado y desactivación brevemente para asegurar que los sinaptosomas son sumergidas en el búfer. Dejar a 37 o C durante 10 minutos
Nota: Es importante ser exactos los tiempos durante el experimento de absorción para la justa comparación entre cerebros. Utilizar un cronómetro de precisión.
Dopamina de - añadir 50 μL de concentración 10 y 5 μM (sección 2.2) para los primeros dos columnas y dejar a 37 o C por 5 min con agitación. Después de exactamente 5 minutos, detener la reacción agregando 1 mL de tampón de absorción helada. Hacer lo mismo con una concentración 1.25 y 2.5 μM (sección 2.2) y con concentración 0.62 y 0,31 μM.
- Añadir las muestras a los filtros de microfibra previamente enjuagada y lavar con tampón de absorción helada de 5 x 4 mL. Cuando el primero de 12 muestras se han agregado a los filtros, hacia los filtros de tubos de centelleo. Repetir este proceso con las 12 muestras.
- Repita el paso 2.4-2.6 para el cerebro siguiente.
- Recuento de max 3 preparar tubos colocando un filtro de microfibra en la parte inferior de los tubos de centelleo 49-51 y añadir 25 μl de la concentración de dopamina máxima en la parte superior (10 μM).
- Deja todos los tubos de centelleo 51 en una campana de humos de 1 h.
- 3 Añadir líquido de centelleo de mL a cada tubo de centelleo y la sacudida vigorosa en un agitador de 1 h.
- Conde [3 H]-DA en un contador beta durante 1 minuto
- Abrir el programa y elegir: etiqueta: H-3, filtro de la placa: vial de 4 mL, 4 por 6, ensayo tipo: Normal y el recuento de tiempo: 1 minuto
Nota: Este paso puede realizarse al día siguiente si es más conveniente. Dejar las muestras cubiertas con papel de aluminio durante la noche.
- Abrir el programa y elegir: etiqueta: H-3, filtro de la placa: vial de 4 mL, 4 por 6, ensayo tipo: Normal y el recuento de tiempo: 1 minuto
- Determinación de proteína
- usar un kit estándar de análisis de proteína BCA para determinar las concentraciones de proteína de los sinaptosomas de ajustes de cuentas por minuto (cpm) fmol/min/μg y para la adecuada comparación de la captación de entre las muestras.
3. Análisis de datos
experimento- uso los datos de la absorción para una saturación de la curva para cada grupo y calcular la tasa de la reacción (V max) y la constante de Michaelis Menten (K M).
Nota: El valor de K M refleja la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de V max. Por consiguiente, V max refleja directamente la función de DAT (capacidad de absorción máxima), que depende del número de DAT en la superficie y en cómo su actividad puede ser modulada por modificaciones postraduccionales o interacción de proteínas, así como en alteraciones en los gradientes de iones. El valor de K M es una medida indirecta de la afinidad del sustrato por el transportador que, lo importante es que también puede ser modulada por modificaciones postraduccionales o proteínas obran recíprocamente. Para evaluar completamente los cambios funcionales, por tanto, es importante determinar directamente los niveles de expresión superficial por ejemplo un análisis de Biotinilación superficial. Una descripción de la recaptación de dopamina y una elaboración sobre el significado de los valores máximos de K M y V han sido revisados por Schmitz et al. 17.
4. Cromatografía líquida de alto rendimiento (método 2)
- disección de cerebro
- tubos de microcentrífuga de etiqueta y pesaje, una por cada región por ratón.
- Sacrificio de un ratón a la vez por decapitación y dislocación cervical. Quitar rápidamente el cerebro como se describe en la sección 1.2. Realizar más disección inmediato.
- Usando una matriz de cerebro, diseccionar una porción coronal 3 mm de estriado seguido más fina bilateral disección de NAc y dStr con un golpeador. Vea la figura 3 para el área de perforación.
- Transferir el tejido a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y coloque rápidamente en hielo seco. Pesa el tejido y colóquelo inmediatamente en el hielo seco.
Nota: El peso del tejido es importante para el cálculo de la concentración más tarde.
4.1.1-4.1.4 - Repita los pasos con el ratón siguiente.
Nota: Coloque el tejido en 80 o C hasta la transformación posterior o inmediato proceda al tratamiento de tejido.
5. Preparación de tejido
- vuelta en la centrifugadora para pre-enfriar a 4 ° C
- (0.1 ácidos perclóricos de N (HClO 4)) de la solución de homogeneización y mantener en hielo.
- Usando solución de homogeneización, preparar un estándar fresco 0.1 dopamina pmol/μL de una solución stock de 1 mM (una dilución de 10.000 x).
Nota: La solución se prepara disolviendo dopamina en buffer de homogeneización a una concentración stock de 1 mM, que se puede mantener a 20 ° C durante aproximadamente un mes. Si otras áreas del cerebro son de interés, concentración de la norma tendrá que modificarse, desde otras áreas del cerebro incluyendo el córtex prefrontral, hipocampo, sustancia negra y área tegmental ventral poseen hasta 100 veces menos DA comparado con estriado. - Añadir solución de homogenización de 500 μL de cada muestra (es decir, tejido NAc y dStr; sección 4.1) y homogeneizar las muestras usando un homogeneizador ultra velocidad completo para aproximadamente 30 s. Mantenga la muestra en agua helada durante la homogeneización. Entre cada muestra, limpiar el homogenizador ultra con agua (toda velocidad de 30 s).
- Centrifugar las muestras durante 30 min a 4 ° C, 14.000 x g. Muestra de
- transferencia aproximadamente 200 μL a un vidrio de 0,22 μm filtro (1 cm de diámetro) utilizando una jeringa de plástico de 1 mL.
Nota: El uso de filtros de vidrio no es de importancia, como los filtros elegidos son 0.22 μm para eliminar las sustancias de alto peso molecular. - Análisis de muestras de detección electroquímico (EC)-HPLC metodología 18 como se describe en sección 6.
6. Análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento
- Prepare la siguiente solución para la fase móvil: acetato de sodio 55 mM, octanesulfonic ácido 1 m m, Na 2 EDTA 0.1 mM, 8% de acetonitrilo, ácido acético 0,1 M, pH = 3.2.
Nota: Ajustar el pH con ácido acético de 0,1 M. Es importante ser precisos con el pH. La solución debe ser degassed por el desgasificador en línea (parte integrada del sistema HPLC). Hacer 2 L de la fase móvil y cambiar una vez al mes (cambiarlo cuando el ruido se oiga). Debido a las fluctuaciones tarda aproximadamente 24 horas para ajustar después de cambiar la fase móvil. - Configuración del detector:
- conjunto de voltios de salida de 700 mV y la temperatura de 32 ° C en el horno del detector, esto es muy importante. Hacer un programa de gama mediante el manual en línea. Consulte el manual para más detalles). Agregar el programa de tiempo según la tabla 2.
Nota: En este estudio, se establece el programa para cambiar automáticamente la corriente en tiempos de retención establecido, para conservar la HPLC a la corriente óptima y para mantener los picos del cromatograma ampliada como sea posible, pero todavía dentro de vista. Esto ha sido optimizado para lisados de cerebro estriado de los ratones.
- conjunto de voltios de salida de 700 mV y la temperatura de 32 ° C en el horno del detector, esto es muy importante. Hacer un programa de gama mediante el manual en línea. Consulte el manual para más detalles). Agregar el programa de tiempo según la tabla 2.
- Cuando el programa se ha añadido al detector, hacer una curva de calibración de 3 puntos, inyectando el estándar tres veces (5, 10 y 15 μL).
Nota: Estándar (10 μL (10 μL x 0.1 pmol/μL = 1 pmol DA)) debe ser inyectada cada décima muestra muestras y calibradas con el estándar más cercano. Bellas sintonizar el sistema el día antes por el estándar de 3 puntos de ajuste y comprobación de si el cromatograma sale dentro del rango esperado. Si se observa un considerable ruido, cambiar la fase móvil. Si un pico es más alto que 990 mV entonces volver a inyectar la muestra en un volumen más bajo, o hacer un nuevo programa de gama y una nueva curva estándar. El límite de detección se mide como 3 veces el valor del ruido en mV para el valor más bajo de pico inyectado para cada estándar (NA, DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT y 5-HT).- Sistema de puesta a punto la solución LC y activación comienza 1; este análisis en el modo online. Escriba el ID de usuario y contraseña y haga clic en Aceptar. Esperar LC solución conectar a los instrumentos. Ir a tabla de lote y rellene la información (p. ej., tipo de muestra: desconocido para las muestras y std estándar, tipo de análisis: lo QT, inj volumen: 10, ISTD amt: con nivel 1). Guardar el archivo (ir a archivo - > guardar el archivo por lotes como - > Ahorre).
- Que el sistema inyecte la primera muestra pulsando ' iniciar lote '. Esto dará lugar a la inyección de muestra μL 10 por el inyector automático con un módulo de entrega solvente.
Nota: Utilice una velocidad de flujo de la bomba de 0.15 mL/min y una columna de C18 con la fase de inversión. Aquí se utilizó un detector amperométrico para detección electroquímica. El electrodo de carbón vidrioso debe establecerse a 0.8 V con un electrodo de referencia Ag/AgCl. Para ensayo de dopamina, use cromatografía 3 μ de Sao (3) C18 (DA 2 mm x 100 mm, partículas tamaño 3 μm) para lograr la separación cromatográfica. - Extracto de las áreas pico registrados y calculados.
- Vaya a adquisición de datos para seguir el cromatograma cuando terminaron las muestras. Ir a post ejecutar análisis - Lc > eligió el nombre del archivo (se abrirá el cromatograma) - > haga clic en ver. En la barra de integración manual, añadir todos los picos para integrarse - > ir a informe de los datos e imprimir la lectura.
Nota: Aquí LC solución se utilizó el software para control de sistema y análisis de datos.
- Vaya a adquisición de datos para seguir el cromatograma cuando terminaron las muestras. Ir a post ejecutar análisis - Lc > eligió el nombre del archivo (se abrirá el cromatograma) - > haga clic en ver. En la barra de integración manual, añadir todos los picos para integrarse - > ir a informe de los datos e imprimir la lectura.
- De las áreas de pico, calcular la concentración de dopamina en una muestra, como sigue utilizando la concentración conocida del estándar:
- utilizar el área de pico de la norma (equivale a 1 pmol) para adquirir el factor A.
- utilice A factor para obtener la concentración de las muestras.
Concentración de la muestra (en pmol por 10 μL) = Factor A × área del pico de la muestra - Utilice esta fórmula para obtener la concentración de la muestra en ng.
Muestra concentración pmol / 10 μl μl x 500 x MW de dopamina = concentración de la muestra en ng
muestra concentración (en ng) = concentración de la muestra (en pmol por 10 μL) x 500 μL x MW de la dopamina - utilizar la concentración de la muestra en ng para obtener t muestra la concentración de pg/g de tejido (muestra la concentración de pg / g de tejido = pg/g de tejido).
- utilizar el área de pico de la norma (equivale a 1 pmol) para adquirir el factor A.
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Representative Results
Protocolo de captación DA actual (figura 1) incluye todos los pasos necesarios para evaluar la funcionalidad de DAT en sinaptosomas de ratones. Nuestros datos representativos del método de captación de DA (figura 2) muestra una curva de saturación con datos sin ajustar (figura 2B) y ajustar los datos (figura 2A). La curva de saturación muestra captación de ratones de tipo salvaje. Generalmente uno haría DA la absorción para la comparación con un ratón mutante, que daría lugar a una curva de saturación para cada genotipo5. En ese caso, las diferencias entre el tipo salvaje y mutantes ratones en 2A y 2B pueden explicarse por múltiples factores. Más profundo el experimentador está siguiendo cada paso del Protocolo, la menor diferencia habrá entre que representa a raw (2B) y datos de la proteína ajustado (2A). The Most razones obvias diferencias son i) peso del tejido en el paso 1.2.6, ii) pérdida de tejido durante la transferencia a y desde cristal de homogeneización en paso 1.2.8-1.2.10 imprecisas y iii) imprecisión al transferir sobrenadante en paso 1.2.13 y eliminación de sobrenadante en paso 1.2.14. Se recomienda realizar un experimento preliminar en ratones de tipo salvaje para mejor precisión.
La dopamina, el método de EC-HPLC (figura 3) incluye todos los pasos necesarios para la cantidad de asnos de DA de dStr y NAc de ratones. Nuestros datos representativos (figura 4 y tabla 3) muestran el resultado de un experimento realizado en ratones de tipo salvaje.
Figura 1: flujo de trabajo esquemático que representa las distintas etapas en la asimilación DA synaptosomal experimentar protocolo. El ratón es sacrificado por dislocación cervical seguida de disección de cerebro y colocación en una matriz de cerebro. Una porción coronal espesor 3 mm se diseca del cerebro, y disección fina se realiza por un golpe bilateral de una pequeña zona inmediatamente por debajo del cuerpo calloso. Estriado dorsal está homogeneizada en 1 mL de tampón de homogeneización por la interrupción mecánica seguida por centrifugación de 10 min a baja velocidad. Sobrenadante se transfirió a un tubo limpio y centrifugado a alta velocidad durante 20 minutos. El precipitado, que contiene los sinaptosomas es resuspendido y listos para el experimento de absorción. La absorción se realiza mediante la adición de triplicados de los diferentes [3H]-DA concentraciones, que van desde una concentración final de 0.031 a 1 μM. Además, se añaden las concentraciones variables de criterio DA a una muestra de control que contiene cocaína μM 500. Por último, las muestras son contadas en un contador beta y análisis de datos se realizaron mostrando la curva de saturación de DAT. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: representante de los resultados de un experimento de absorción DA synaptosomal de cuatro ratones de tipo salvaje de C57Bl/6 de una cepa de ratón Drd1a-cre. (A) datos representativos que representa la curva de saturación de la absorción de DA a través de la DAT de synaptosomal preparados de los ratones de tipo salvaje (n = 4). Los puntos negros son los valores de los cuatro ratones indican por separado, que la curva verde muestra cómo datos normalmente se representa mediante la combinación de datos de 4 a 6 ratones por grupo. Este gráfico combina datos de cuatro ratones. (B) la gráfica de la saturación de los datos en bruto, sin ajustar la concentración real de la proteína de las muestras. Esencialmente, es la versión no ajustada de los datos en datos de Control (C) a.. Este gráfico muestra las cuentas de las muestras que contienen cocaína, que se utilizan para disminuir el fondo de los datos de absorción. Este control es esencial para determinar la confiabilidad de los datos de absorción, pero raramente aparece en los artículos. Si estos datos por alguna razón no linealidad, indica un problema crítico con la instalación, que debe ser identificado y resuelto para deducir de los datos. R cuadrado: n1 = 0.9852, n2 = 0.9584, n3 = 0.9606, n4 = 0.9913. (D) histograma que muestra la capacidad de absorción de DAT (VMAX). VMAX = 43,13 ± 3.2 fmol/min/μg proteína). Datos se muestran como media ± SEM. (E) histograma mostrando la KM para DAT a 0.1 μM ± 0.03 correspondiente bien al método de voltamperometría de disco giratorio que representan valores de KM de DAT a 0,6 μM19. Un valor de KM de 0.1 μM corresponde también a los valores de KM de 0.22 μM que se han obtenido por los modelos de estimulación de estimulado desbordamiento de DA en el estriado20,21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: flujo de trabajo esquemático que representan los diferentes pasos en el protocolo de cromatografía líquida de alta. El ratón se sacrificaron mediante dislocación cervical seguida de disección de cerebro y colocación en la matriz del cerebro. Una porción coronal espesor 3 mm se diseca del cerebro, y disección fina se realiza bilateralmente perforando dos áreas más pequeñas, dividiendo el cuerpo estriado en la dStr y el NAc. Tejido se homogeneiza, seguido de centrifugación rápida. Van a un estándar conocido DA concentraciones como sobrenadantes de las muestras en el HPLC, producen cromatogramas. Las áreas de los picos diferentes se utilizan para calcular la concentración de DA en las muestras en un histograma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: resultados representativos de un experimento de cromatografía líquida de alta. (A) HPLC cromatograma para muestra 10 μL dStr inyectado a un C18 columna (2 x 100 mm) utilizada para moléculas pequeñas. Tiempos de retención; mínima de 3,7 para noradrenalina (NA), 6,7 min dihydroxyphenylacetic ácido (DOPAC), DA, min 10,7 8,3 min de ácido 5-hidroxindolacético (HIAA), 15,3 min de ácido homovanílico (AHV), 18,8 min 3-methoxytyamine (3-MT) y 20,8 min para 5-hydroxtryptamine (5-HT). Sólo los valores de los picos DA se calculan en este estudio. (B) histograma que muestra la concentración de DA en NAc y dStr basado en chromatrogram. Análisis HPLC de estriado áreas incluyendo dStr y NAc de C57BL/6 ratones (n = 7). Datos se muestran como media± SEM. 
indica un cambio en la resistencia y se ha agregado manualmente en el cromatograma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 + coc | 5 + coc | 2.5 + coc | 1.25 + coc | 0.62 + coc | 0,31 + coc |
Tabla 1: Diseño de tubo de microcentrífuga para preparación synaptosomal.
| Tiempo | Rango | Filtro | Válvula de | Auto cero | En offset | Celular E |
| 0 | 1nA | 0,5 Hz | de la carga | no | 30% | 0.7 V |
| 0.2 | 1nA | 0,5 Hz | de la carga | conjunto | 30% | 0.7 V |
| 5 | 500pA | 0,5 Hz | de la carga | no | 30% | 0.7 V |
| 5.2 | 500pA | 0,5 Hz | de la carga | conjunto | 30% | 0.7 V |
| 9.4 | 200pA | 0,5 Hz | de la carga | no | 30% | 0.7 V |
| 9.6 | 200pA | 0,5 Hz | de la carga | conjunto | 30% | 0.7 V |
| 12 | 100pA | 0,5 Hz | de la carga | no | 30% | 0.7 V |
| 12.2 | 100pA | 0,5 Hz | de la carga | conjunto | 30% | 0.7 V |
| 16.2 | 50pA | 0,5 Hz | de la carga | no | 30% | 0.7 V |
| 16.4 | 50pA | 0,5 Hz | de la carga | conjunto | 30% | 0.7 V |
| Final tiempo 25 min. | ||||||
Tabla 2: HPLC programa utilizado en este estudio.
| Pico # | Tiempo de RET. | Zona | Altura | % De área | % De la altura |
| 1 | 3.745 | 230451 | 18500 | 0.299 | 0.626 |
| 2 | 6.691 | 5573485 | 382143 | 7.228 | 12.922 |
| 3 | 8.336 | 13209342 | 510378 | 17.131 | 17.258 |
| 4 | 10.760 | 16443198 | 831182 | 21.325 | 28.106 |
| 5 | 15.344 | 7129795 | 282473 | 9.247 | 9.552 |
| 6 | 18.830 | 11279424 | 346248 | 14.628 | 11.708 |
| 7 | 20.846 | 23241754 | 586419 | 30.142 | 19.829 |
| Total | 77107450 | 2957344 | 100.000 | 100.000 |
Tabla 3: Análisis de pico que muestra el área y la altura de los picos diferentes para calcular las concentraciones en Figura 4B .
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Discussion
Este manuscrito describe protocolos experimentales útiles para delinear DA homeostasis en cualquier modelo de ratón de elección. Ofrecemos protocolos detallados para medir los niveles de DA en el tejido cerebral de ratones utilizando HPLC y synaptosomal DA captación para evaluar funcional DA transporte a través de DAT. Los procedimientos, protocolos y límites para el experimento HPLC y análisis de absorción DA synaptosomal serán elaborados por debajo.
El protocolo de captación synaptosomal puede proporcionar información útil para la funcionalidad de DAT. combinado con un experimento de Biotinilación superficial13, pueden obtenerse conocimientos sobre la cantidad total, superficie y funcionalidad de DAT. Dado el importante papel del DAT y su influencia en la transmisión de DA y su participación en varias enfermedades, ha sido una meta importante para establecer ensayos que pueden modelar la función DAT. Una de las ventajas de la experiencia de captación DA synaptosomal es que puede ser post realizado en vivo manipulaciones como en manipulación de chemogenetic así como diversos en vivo tratamientos farmacológicos como conductuales entrenamiento además investigaciones en ratones modificados genéticamente. Tratamiento farmacológico puede realizarse después de la preparación synaptosomal, en lugar de en vivo si se prefiere, lo que es posible probar el efecto de fármacos sobre DAT directamente22.
Alternativas para realizar la absorción DA synaptosomal, es llevar a cabo experimentos de absorción en cultivos de células transfectada DAT o en cultivos neuronales naturalmente expresando el transportador. Ensayos de cultura de célula pueden ser preferidos para investigaciones iniciales en diferentes modificaciones de DAT23, mientras que cultivos primarios neuronales con el transportador endógeno pueden proporcionar una imagen más fisiológico confiable del transportador función in vivo. A pesar de que las culturas neuronales se hacen directamente de los animales, hay ventajas de usando sinaptosomas en su lugar. Las culturas neuronales se hacen generalmente de las neuronas inmaduras o prenatales, que puedan influir en la función y expresión de DAT, mientras que preparaciones synaptosomal representan preparaciones fisiológicas que pueden obtenerse de animales adultos y viejos incluso sin dificultades6,14.
Hay varias ventajas de utilizar el experimento de absorción synaptosomal para investigar la función de DAT, pero tienen limitaciones importantes a considerar. Los sinaptosomas limitada viabilidad6. Manteniéndolas en hielo es esencial para obtener resultados fiables con baja variación. Si mantenerse en hielo y proporcionan nutrientes necesarios, sinaptosomas purificadas son viables durante horas y y liberar neurotransmisores eficientemente15. Es posible congelar sinaptosomas, pero el método de congelación es de gran importancia15. Pequeñas variaciones en el procedimiento experimental pueden conducir a amplias variaciones en el resultado. Por lo tanto, deben optimizarse los protocolos experimentales en condiciones de tipo salvaje (p. ej. ratones de tipo salvaje) hasta que se obtienen resultados reproducibles y luego puedan hacer comparaciones después de varias manipulaciones genéticas o farmacológicas. Ensayo de absorción DA Synaptosomal es una herramienta experimental fácil, fiable y válida para adquirir datos reproducibles con una muy baja variación de un parámetro clave en la homeostasis de la DA, funcionalidad DAT (figura 2A). Las limitaciones son muy superadas por las ventajas de ser capaces de realizar el experimento en las terminaciones nerviosas conservadas de ratones adultos6.
Los métodos actualmente utilizados para analizar los niveles de DA en el tejido son apoyados por métodos histoquímicos que se convirtió en la década de 1950. La importancia de desarrollar métodos de HPLC para medir los niveles de DA, ha sido evidente desde el descubrimiento de la sustancial disminución de DA en los ganglios basales de pacientes con Parkinson, Fundación de tal modo el principio de tratar a pacientes que sufren de enfermedad de Parkinson con l-dopa24. Desde este descubrimiento, se han desarrollado técnicas más avanzadas para el análisis de tejido de los niveles de DA, pero como con otras técnicas hay trampas. Uno de los escollos principales de estas técnicas es la naturaleza inestable de monoaminas (noradrenalina, dopamina y serotonina). Cómo preparar correctamente la preparación del tejido para evitar la pérdida de monoaminas se ha discutido en gran detalle por Atack et al. 25 y no se discutirá más adelante en este artículo, excepto al subrayar la importancia de colocar el tejido en hielo seco directamente después de la disección y no añadir la solución de homogeneización hasta inmediatamente antes de los análisis HPLC. Desde nuestra experiencia, tejido puede conservarse a-80 oC hasta un mes sin cualquier degradación de DA si se ha añadido ninguna solución. Atack et al hablar de preparación de tejido para métodos que van desde el método espectrométrico de fluoro hasta avanzados métodos HPLC permite un límite de detección a 3 ng/mL de tejido25. El método que describimos en este trabajo se basa en los mismos principios. Tecnologías actuales permiten más refinado análisis y detección de los niveles de DA en fmol concentraciones. Usando una técnica HPLC fluorescente, incluso más robusto análisis de monoamina pueden obtenerse26. Debido a la robustez del método HPLC es ampliamente utilizado para obtener información sobre cambios en los niveles de monoaminas y precursores y metabolitos en distintas regiones del cerebro, tal como se DA en el estriado, para validar modelos de la enfermedad de Parkinson en ratones, monos y minicerdos27,28,29. Aquí, realizamos el experimento en el tejido de dStr y NAc, pero el método es también adecuado para otras áreas del cerebro DA inervada, como la corteza prefrontral, hipocampo, sustancia negra y área tegmental ventral 30. En estas áreas, una muestra de estándar más diluida será necesaria para la correcta determinación de los niveles de DA. Nuestro análisis de contenido DA muestran niveles más altos en subcompartimientos estriada en comparación con investigaciones previas, pero esto se puede explicar experimentalmente. En primer lugar, hemos diseccionado dos partes del cuerpo estriado (NAc y dStr) en lugar de investigar el estriado entero, lo que podría explicar la diferencia en comparación con informes anteriores12,31. Mediciones de estriado tienen niveles más bajos de DA en comparación con las mediciones en puro dStr, desde niveles en NAc sustancialmente inferior en comparación con a dStr. También contamos con estudios previos, confirmando nuestro DA niveles5.
Cada prueba tiene sus limitaciones. Ensayos se desarrollan en un intento de modelo y proporcionar información sobre aspectos específicos de un proceso celular, y podría dejar de lado información importante posible o proporcionar una imagen demasiado generalizada del proceso del mundo real. Una importante limitación a tener en cuenta al elegir el HPLC, es que sólo proporciona una instantánea de los niveles de neurotransmisor. Sin embargo, son propensos a variar más de un día, semana o mes32,33, que hace hincapié en la necesidad de obtener muestras en una ventana de tiempo estrecho, en lugar de comparar las muestras tomadas en horas, días o meses de separado como niveles de neurotransmisores Aunque fueron llevados a la misma hora. Sin embargo, proporcionan información útil sobre el contenido de DA y revelan niveles alterados aberrantes tales como ésos demostraron por el DAT-KO y el ratón transgénico DAT-KD líneas, donde canceladura genética o precipitación de DAT influye significativamente sobre la homeostasis DA por datos HPLC perturbando la recaptación de DA. Estos datos furthermore demuestran que piscinas de DA estriatal consisten principalmente en secuestrado DA más sintetizada de novo de DA y esa reposición de piscinas de DA estriatal intracelular depende críticamente de la recaptación proceso12,34. Un escollo importante a considerar es que la disección del tejido puede limitar una descripción más específica y precisa del contenido de DA en un área del cerebro en un momento dado. La variación en la concentración de DA en diversas áreas del cerebro varía enormemente. Por lo tanto, la precisión de la disección es de gran importancia, que puede mejorarse mediante disección en áreas más pequeñas para garantizar sólo el tejido de la zona de interés es incluido.
Una medida más funcional de las piscinas DA endógenas puede ser analizada usando microdialysis. Esto ha sido desarrollado y promovido por Ungerstedt et al. utilizando la sonda de microdiálisis vertical35. La técnica de microdiálisis permite medir las concentraciones de monoamina en el cerebro de mover libremente los animales y en estructuras cerebrales diferentes. Otra de las ventajas de la técnica de microdiálisis en el muestreo de tejido a través de HPLC es la opción para medir y seguir cambios de monoamina durante un gran período de tiempo. Esto es una ventaja considerable en comparación con el muestreo del tejido de cerebro en sólo un punto del tiempo es posible por animal como en el protocolo HPLC. Mientras, microdialysis puede proporcionar la penetración en la liberación de DA, muestras de tejido seguida por HPLC en su lugar se revelan cambios en la piscinas endógenos y vesicular DA. Para obtener información en tiempo real sobre cinéticas de liberación de DA en diversas áreas cerebrales, métodos como la voltametría cíclica de barrido rápido36,37 o38 de chronoamperometry de alta velocidad puede ser implementado.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la UCPH 2016 programa de excelencia (U.G., A.R., K.J.), la Fundación Lundbeck (M.R.) centro de la Fundación Lundbeck para biomembranas en nanomedicina (U.G.), el nacional Instituto de salud subvenciones P01 DA 12408 (U.G.), el danés Consejo para la investigación independiente - ciencias médicas (U.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
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