Summary
Vi præsenterer her, nytten af langsgående i vivo billeddannelse i opfølgningen af morfologiske ændringer af laser-induceret choroidal neovascularization i mus.
Abstract
Laser-induceret choroidal neovascularization (CNV) er en veletableret model til at efterligne den våde form af aldersrelateret makuladegeneration (AMD). I denne protokol, vi sigter mod at guide læseren ikke blot gennem de tekniske overvejelser generere laser-induceret læsioner til at udløse neovaskulær processer, men snarere fokusere på den kraftfulde oplysninger, der kan opnås fra multimodale langsgående in vivo imaging hele opfølgningsperioden.
Laser-induceret musen CNV model blev genereret af en diode laser administration. Multimodal i vivo billeddannelse teknikker blev brugt til at overvåge CNV induktion, progression og regression. Første, spektrale domæne optisk kohærens tomografi (SD-OCT) blev udført umiddelbart efter lasering for at kontrollere en pause på Bruchs membran. Efterfølgende i vivo billeddannelse ved hjælp af fluorescein angiografi (FA) bekræftede vellykket beskadigelse af Bruchs membran fra serie billeder erhvervet på choroidal niveau. Langsgående opfølgning af CNV spredning og regression på dag 5, 10 og 14 efter den lasering blev udført ved hjælp af både SD-OCT og FA. Enkel og pålidelig klassificering af utætte CNV leasions fra FA billeder præsenteres. Automatiseret segmentering til måling af total retinal tykkelse, kombineret med manuel kaliber ansøgning om måling af retinale tykkelse på CNV websteder, tillade uvildig vurdering af tilstedeværelsen af ødem. Endelig, histologisk verificering af CNV udføres, ved hjælp af isolectin GS-IB4 farvning på choroidal flatmounts. Farvning er thresholded, og området isolectin-positive beregnes med ImageJ.
Denne protokol er især nyttig i therapeutics undersøgelser kræver høj-overførselshastighed-lignende screening af CNV patologi, da det giver mulighed for hurtig, multimodale og pålidelige klassificering af CNV patologi og retinal ødem. Høj opløsning SD-OLT kan desuden optagelsen af andre patologiske kendetegnende, såsom ophobning af subretinal eller intraretinal væske. Denne metode giver dog ikke mulighed for at automatisere CNV volumen analyse fra SD-okt billeder, som skal udføres manuelt.
Introduction
Den første vellykkede forsøg på at efterligne patologi af menneskelige CNV i gnavere blev påvist næsten tre årtier siden med en kryptonfluorid i lang-Evans rotter1. Derefter blev en kryptonfluorid brugt til at bryde Bruchs membran i den mest populære mus stamme, C57BL/6J2,3,4. Succesraten for CNV induktion blev bekræftet med FA og histologiske pletter. En hurtig udvikling af noninvasive billedbehandling modaliteter, som OLT, fremmet væksten i feltet af gnavere prækliniske modeller. Evnen til at overvåge morfologiske forandringer i nethinden på flere tidspunkter i det samme øje væsentligt bidrager til reduktion af brug af dyr, og øger effektiviteten i eksperimentelle undersøgelser. Histologisk vurdering af CNV-læsioner er temmelig ligetil, og kræver mærkning af unormale kar vækst omkring stedet laser administration, image erhvervelse og areal/volumen estimation ved hjælp af et billede analyse software. I modsætning hertil, indføre i vivo billeddiagnostiske modaliteter mere komplekse analyser af CNV patologi og dens fortolkning.
Her præsenterer vi en enkel og relativt hurtig metode til grade induktion, progression og regression af CNV ved hjælp af FA, SD-OLT, og metoden automatiseret segmentering i mus laser-induceret CNV model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrene blev behandlet i overensstemmelse med sætningen ARVO for brug af dyr i Ophthalmic og Vision forskning og EF-direktiv 86/609/EØF for dyreforsøg, ved hjælp af protokoller godkendt og overvåget af dyr eksperiment bestyrelsen af Finland.
1. laser-induceret mus CNV model 5
- Inspicere øjne dyrets makroskopisk for eventuelle afvigelser.
- Veje musen.
- Beregne og forberede et passende beløb af anæstetika til brug, baseret på vægten af dyr, fx en blanding af medetomidine (1 mg/kg), ketamin (75 mg/kg) og destilleret vand (0,9% NaCl opløsning) i forholdet 1:1.5:2.5 eller ketamin (40-75 mg/kg), xylazin (5 mg/kg) og destilleret vand (0,9% NaCl opløsning) i forholdet 1:2. 5:1; for en 20 g mus, injicere 0,1 mL af blandingen.
- Injicere bedøvelsesmiddel intraperitoneal.
- Placere musen tilbage i bur og vente, indtil dyret er bedøvede. Bekræfte musen er korrekt bedøvede af mangel på en pedal refleks.
- Sikre brugen af laser sikkerhed personlige værnemidler.
- Tænd en spaltelampe og en 532 nm diodelaser.
- Fjerne musen fra buret og sted på en varmepude.
- Påfør en dråbe af tropicamid for pupil dilatation. Vente 3-5 min for fuld (3 mm) pupil dilatation.
- Placer musen på scenen i en spaltelampe.
- Anbring en dråbe af oftalmologiske flydende gel på en coverslip til applanate af hornhinden.
- Orientere mus øjet med synsnerven hoved i midten.
- Indstille laser magt til 100 mW, varighed at 100 ms, og den spot størrelse til 50 µm.
- Fokusere laserstrålen på retinale pigment epitel (ÅV).
- Gøre tre laser skud ind i det ene øje ved at undgå retinale blodkar ideelt på 4, 8 og 12 på urskiven omkring synsnerven, henholdsvis. Inspicere fundus i øjet efter alle laser skud for fravær af retinal blødning. De kontralaterale øje fungerer som en ikke-laserbehandlet kontrol.
- Kassere coverslip og sted musen tilbage på den hede afrivningsblok.
- Påfør en dråbe af PIND gel dråber på begge øjne.
2. SD-okt 6,7
- Placere musen i gnaver justering fase, og immobilisere hovedet.
- Juster linsen af SD-okt-system (f.eks.Bioptigen/Leica Envisu R2200) overfor øjet for i vivo billeddannelse ved hjælp af X - og Y-trins controllere.
- Udføre SD-okt scanninger for at kontrollere pauser af Bruchs membran: når SD-OLT scanner hele øjet, manuelt flytte referencelinjen på laserbehandlet websteder. Pauser af Bruchs membran skal være klart synlige i laserbehandlet områder (Se figur 1).
3. fluorescein angiografi 7,8,9
- Fjerne musen med indehaveren, og placere den på FA systemet (fxHeidelberg Spectralis HRA2).
- Fokus på laser brænde områder af fundus i øjet ved hjælp af infrarød Reflektionsgraden tilstand med lederen af synsnerven midt i visningsvinduet.
- Injicere 0,1 mL 5% fluorescein natrium salt for en 20 g mus subkutant eller intraperitoneal.
- Fokusere på den choroidal niveau.
- Tage et billede fra choroidal fokus niveau.
- Re-fokus på den retinale plan og tage et billede.
- Vente 30 s og Gentag trin 3.4-3.6.
- Fjerne musen fra indehaveren og placere den på en varmepude.
- Omvendt anæstesi af en2-antagonist til medetomidine, Atipamezol (0,5 mg/kg, i.p.) eller vente til animalsk nyttiggørelse fra anæstesi.
- Gentag i vivo SD-OCT og FA imaging i bedøvede dyr på de opfølgende dage 5, 10 og 14.
4. CNV sortering
- Grade beskadigelse af Bruchs membran fra OCT og choroidal FA billeder taget umiddelbart efter lasering på dag 0 som følgende:
0 - Bruchs membran blev ikke beskadiget
1 - succes beskadigelse af Bruchs membran - Grade tilstedeværelsen af CNV fra laserbehandlet steder, der havde lækage som observeret ved at sammenligne dynamics fluorescein signal i en serie af retinale FA billeder som følgende:
0 - normale udseende af nethinden
0,5 - svag farvning af lækage
1,0 - utæt CNV områder
Bemærk: Brug OCT imaging for yderligere bekræftelse af CNV eller i tvivlsomme FA hvor tilstedeværelsen af intraretinal væske i OCT billeder vil foreslå CNV sortering.
5. retinal tykkelsesmålinger
- Bruge en automatiseret segmentering software til retinal tykkelsesmålinger. Sikre at den samlede retinal tykkelse anses som tykkelsen af alle lag fra nerve fiber lag til ÅV (sund måling websteder) eller til en imaginær linje, der forbinder ÅV rundt på hjemmesiden af skader (laserbehandlet sites) (Se også figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En boble eller subretinal blødning umiddelbart efter lasering er ikke altid synlige. Derfor, SD-okt er særligt vigtigt at kontrollere skader af Bruchs membran. Figur 1 viser et eksempel på OCT imaging på forskellige tidspunkter efter laser administration.
Figur 1 : OCT da ansigt visning af øjet fundus (VIP billede) viser tre laserbehandlet områder skitseres i hvide, grønne og røde cirkler. OCT B-scanne billeder blev taget før den lasering (baseline), umiddelbart efter lasering for at kontrollere en pause på Bruchs membran (0 dage, pilene peger på webstedet af skader), og 5, 10 og 14 dage efter laser administration. Som det kan ses fra området skitseret i hvid (første række billeder), CNV ikke udvikler på senere timepoints. Området skitseret i grøn og rød udviklet CNV, som blev fundet på opfølgende dag 5. Men, på 10 og 14 dages timepoints, disse CNV-læsioner svandt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 og 3 viser serie imaging ved hjælp af FA, som bekræftede vellykket beskadigelse af Bruchs membran i alle tre steder på dag 0 i en mandlig 10-uge-forhenværende C57BL/6jRj mus.
Figur 2 : Seriel FA imaging taget hver 20 s (billeder 1 til 18) på choroidal niveau umiddelbart efter laser administration. Hvide pile i billede 1 point til laserbehandlet websteder, der viser fluorescein lækage på senere timepoints (hvide pile i billede 18). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Seriel FA imaging taget hver 20 s (billeder 1 til 18) på den retinale niveau umiddelbart efter laser administration. CNV område, der har fluorescein lækage og en klassificering af 1 (utæt CNV) er påpeget af den hvide pil i billede 18. Bemærk en stigende intensitet, samt fluorescein positive område, under timecourse af FA imaging (hvid pil i billeder 8 og 11). To områder skitseres i hvid i billede 18 blev klassificeret som havende en svag FA signal (grading 0,5). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Ud over sortering af CNV patologi, er SD-okt også nyttige til at afsløre flere oplysninger i læsion websted, f.eks., tilstedeværelsen af subretinal væske, ødem og CNV regression. Figur 4 viser de væsentligste patologiske kendetegnende for laser-induceret CNV i mus.
Figur 4 : Spektrale domæne optisk kohærens tomografi Imaging af CNV patologi. SD-okt giver en detaljeret CNV patologi inden for retinal væv, som kan ses fra disse repræsentative billeder på ar væv, CNV dannelse og flydende ophobning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Makulaødem er en af de vigtigste patologiske kendetegnende for våde form AMD i mennesker. I laser-induceret CNV model, kan retinal tykkelse evalueres ved hjælp af automatiserede segmentering. Manuel måling af udvalgte laserbehandlet lokaliteter er forpligtet til at måle retinal tykkelse i stedet for CNV. Figur 5 viser et eksempel på en rapport genereres efter automatiseret segmentering.
Figur 5 : Kvantificering af retinale tykkelse. Retinal tykkelse målt ved automatiseret segmentering venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Brug af automatiserede segmentering er en hurtig måde at give et overblik over retinal tykkelse (tabel 1). Tal 6A og 6B Vis repræsentative eksempler på automatiseret segmentering fra en sund retinal område og det retinale område med CNV patologi, henholdsvis. Trods mindre unøjagtigheder fundet skelne enkelte retinal lag, samlede, genkender softwaren pålideligt den samlede retinal tykkelse i pigmenteret mus.
Figur 6 : Automatiseret segmentering af retinale lag. Automatiseret segmentering af sunde retinal område (A) og retinal område indeholdende CNV (stjerne i billede B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
For at vurdere den retinale tykkelse på laserbehandlet områder, hver laserbehandlet område blev målt manuelt som følgende: den samlede retinal tykkelse blev betragtet som tykkelsen af alle lag fra nerve fiber lag til den imaginære linje, der forbinder ÅV omkring stedet, skader (figur 7 og tabel 1).
| Område | Dag 5 | Dag 10 | Dag 14 |
| Samlede retinal tykkelse, μm | 218±7.8 | 220±7.2 | 221±9.8 |
| Laserbehandlet område 1 | 200 | 204 | 214 |
| Laserbehandlet område 2 | 226 | 217 | 220 |
| Laserbehandlet område 3 | 222 | 223 | 227 |
| Data præsenteres som mean±SD | |||
Tabel 1. Samlede retinal tykkelse og retinal tykkelse på CNV steder i løbet af en 14-dages opfølgning som fastlagt af automatiserede segmentering bruger inVivoDiver software (v. 3.0.8).
Figur 7 : Manuel måling af retinale tykkelse på laserbehandlet område med CNV patologi. Gul linje angiver den samlede retinal tykkelse fra nerve fiber lag til en imaginær ÅV lag (sort streg) i stedet for laser administration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Histologisk, blev CNV-læsioner bekræftet ved hjælp af isolectin GS-IB4 mærkning (figur 8A). Billede analyse software Image Jørgensen blev brugt til at beregne området i CNV læsion (fig. 8B).
Figur 8 : Histologisk analyse. Histologiske pletten af CNV læsion fra choroidal flatmount (med grønt, A) kan kvantificeres ved hjælp af tærskel i billedet Jørgensen (B). Skalalinjen for A er 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multimodal imaging tilbyder værdifulde værktøjer til CNV patologi evaluering. Her fremlagde vi en billeddannelse protokol bestående af FA, SD-OCT og automatisk segmentering til hurtig, reproducerbare og pålidelig evaluering af CNV patologi. En pause på Bruchs membran efter laser administration blev bekræftet. Desuden brug af SD-okt på dette tidspunkt også tilladt umiddelbare visualisering af mulige intraretinal og subretinal hemorrhages, som kan forvirre fortolkning af resultaterne. Retinal lækager blev klassificeret baseret på fluorescein signalet fra FA billeder. Brug af SD-okt leveret en mere detaljeret beskrivelse af CNV patologi. Derudover fremhævet langsgående SD-okt analyse på forskellige tidspunkter i hele opfølgningsperioden tidsmæssige forskelle i patologi, der ville forblive undvigende hvis afhængige FA alene.
Samlede retinal tykkelse blev målt ved hjælp af automatiserede segmentering. Retinal tykkelse på websteder CNV blev induceret måltes manuelt. Histologisk vurdering af choroidal flatmount er kontrolleret, og området af neovascularization måles ved hjælp af billede analyse software Image J.
Den rette gennemsigtighed af den visuelle akse er afgørende for vellykket præstation præsenteret-protokollen. Tørhed af hornhinden og dannelse af grå stær er de vigtigste faktorer involveret i fejlfinding. Derfor, når musen får bedøvede, øjnene skal være konstant hydreret med kunstige tårer eller gel til at opretholde ordentlig hydrering af hornhinden. Den foreslåede protokol bør udføres fortrinsvis inden for 10 min fra induktion af anæstesi. Udvidet anæstesi tid kan forårsage dannelse af grå stær og forhindre i vivo billeddannelse.
Den beskrevne protokol er begrænset til observationelle klassificering af CNV progression baseret på vaskulære lækager på niveauet af nethinden. Kvantitativ vurdering af retinale lækage kan tilføjes ved hjælp af Heidelberg Spectralis software, som tillader afgrænsningen af området til lækagen og giver kvantitative data på det pågældende område. Derudover foreslået Sulaiman og kolleger (2015) for nylig en beregning af CNV volumen fra i vivo erhvervet OCT billeder ved hjælp af ellipsoide metode10. Modellens ellipsoide sandsynligvis introducerer bias mod overvurdering af omfanget af læsioner som CNV i de fleste tilfælde har en uregelmæssig form. Men høj korrelation mellem volumen målinger fra Konfokal analyse af histologiske prøver og foreslåede ellipsoide kvantificering fra OCT billeder giver bevis for, at metoden er et værdifuldt redskab til kvantitative evaluering af CNV volumen10 .
Til sidst, vi tror kombinationen præsenteres i forskellige vivo billeddannelse modaliteter, sammen med automatiseret segmentering og histologiske analyse, giver reproducerbare og pålidelig evaluering af CNV patologi i prækliniske studier. Metoden kan være særligt nyttigt for bevis for begrebet terapeutisk intervention undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatter Symantas Ragauskas, Ph.D. er en medarbejder (videnskabsmanden) og aktionær i Experimentica Ltd, der tilbyder kontrakt forskning tjenester beskæftiger de prækliniske CNV model, der anvendes i denne artikel.
Forfatteren Eva Kielczewski er en medarbejder (forskning applikationer ingeniør, OCT) af Leica Microsystems, der producerer SD-okt-systemer, der anvendes i denne artikel.
Forfatter Joseph Vance er en medarbejder (NA OCT salgsdirektør) af Leica Microsystems, der producerer SD-okt-systemer, der anvendes i denne artikel. Joseph Vance er også formand og administrerende direktør for respektive, LLC.
Forfatter Simon Kaja, Ph.D. er konsulent Chief Scientific Officer og aktionær i Experimentica Ltd, en prækliniske kontrakt forskning organisation, der tilbyder kontrakt opslagstjenester, incl. de prækliniske CNV model bruges i denne artikel. Simon Kaja, Ph.D. er også CEO af K & videnskabelige Pedersen, LLC, en konsulentvirksomhed, det biovidenskabelige og tjener som Dr. John P. og Therese E. Mulcahy begavet Professor i oftalmologi ved Loyola University Chicago, Stritch School of Medicine. Vilkårene i denne aftale har gennemgået og godkendt af Loyola University Chicago efter sin interessekonflikt politik.
Forfatter Michael Kalesnykas, Ph.D. er en medarbejder (CEO) og aktionær i Experimentica Ltd, der tilbyder kontrakt forskning tjenester beskæftiger de prækliniske CNV model, der anvendes i denne artikel.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Yuliya Naumchuk (Loyola University Chicago) og Agne Žiniauskaitė (Experimentica Ltd.) for fremragende tekniske og videographic støtte. Dr. Kaja forskningsprogram er støttet af Dr. John P. og Therese E. Mulcahy begavet professorat i oftalmologi ved Loyola University Chicago.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medetomidine (commercial name Domitor) | Orion | Vnr 01 56 02 | Anesthesia |
| Ketamine | Intervet | Vnr 51 14 85 | Anesthesia |
| 0,9% NaCl | B Braun | 357 0340 | Anesthesia |
| Xylazine (commercial name Rompun vet) | Bayer | vnr 14 89 99 | Anesthesia |
| Tropicamide | Santen | Vnr 04 12 36 | Mydriatic agent |
| Viscotears | Alcon | Vnr 44 54 81 | Lubricant |
| Systane | Alcon | - | Lubricant |
| 5% Fluorescein sodium salt | Sigma Aldrich | F6377-100G | Fluoresent agent |
| Atipamezole (commercial name Antisedan) | Orion | Vnr 47 19 53 | Anesthesia |
References
- Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat. Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).
- Tobe, T., et al. Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).
- Seo, M. S., et al. Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor. Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. J Vis Exp. (106), e53502 (2015).
- Giani, A., et al. In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PloS One. 10, e0132643 (2015).
- Sheets, K. G., et al. Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse. Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).
- Hoerster, R., et al. In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Sulaiman, R. S., et al. A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization. J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).
