Summary
Her presenterer vi nytten av langsgående i vivo bildebehandling i oppfølgingen av morfologiske endringer av laser-indusert choroidal neovascularization i mus.
Abstract
Laser-indusert choroidal neovascularization (CNV) er en veletablert modell å etterligne den våte formen for aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). I denne protokollen, vi tar sikte på å lede leseren ikke bare gjennom de tekniske betraktningene generere laser-indusert lesjoner utløse neovascular prosesser, men heller fokusere på kraftig informasjon kan fås fra intermodal langsgående i vivo imaging gjennom oppfølging periode.
Laser-indusert musen CNV modellen ble generert av en diode laser administrasjon. Flere i vivo Bildeteknikker ble brukt til å overvåke CNV induksjon, progression og regression. Først spectral domene optical coherence tomografi (SD-oktober) ble utført umiddelbart etter lasering for å bekrefte en pause på Bruchs membran. Senere i vivo bildevisning fluorescein angiography (FA) bekreftet vellykket skade av Bruchs membran fra serielle bilder kjøpt på choroidal nivå. Langsgående oppfølging av CNV spredning og regresjon på dager 5, 10 og 14 etter den lasering ble utført med både SD-oktober og FA. Enkel og pålitelig sortering av lekk CNV leasions fra FA bilder vises. Automatisert segmentering for måling av totale retinal tykkelse, kombinert med manuell kaliber program for måling av netthinnen tykkelse på CNV områder, tillate upartisk evaluering av tilstedeværelsen av ødem. Endelig utføres histologiske verifisering av CNV med isolectin GS-IB4 flekker på choroidal flatmounts. Den flekker er thresholded, og isolectin-positive området beregnes med ImageJ.
Denne protokollen er spesielt nyttig i therapeutics studier som krever høy-ytelse som screening av CNV patologi som det tillater rask, flere og pålitelig klassifisering av CNV patologi og retinal ødem. I tillegg gjør høyoppløselig SD-oktober opptak av andre patologisk kjennetegn, for eksempel opphopning av subretinal eller intraretinal væske. Denne metoden gir imidlertid ikke mulighet til å automatisere CNV volum analyse fra SD-oktober bilder, som må utføres manuelt.
Introduction
Det første vellykkede forsøket på å etterligne menneskelige CNV i gnagere patologi ble demonstrert nesten tre tiår siden med en krypton laser i lang-Evans rotter1. Deretter ble en krypton laser brukt til å bryte Bruchs membran i mest populære musen belastningen, C57BL/6J2,3,4. Suksessrate på CNV induksjon ble bekreftet med FA og histologiske flekker. En rask utvikling av noninvasive tenkelig modaliteter, for eksempel OKT, fostret veksten av feltet gnager prekliniske modeller. Evnen å dataskjerm morfologiske endringer i netthinnen på flere tidspunkt i samme øyet betydelig bidrar til reduksjon av dyr bruk, og øker effektiviteten i eksperimentelle studier. Histologiske evaluering av CNV lesjoner er ganske grei, og krever merking av unormal vascular vekst rundt området av laser administrasjon, bildeopptak og området/volum estimering bruker en analyseprogramvare. I kontrast introdusere i vivo tenkelig modaliteter mer kompliserte analyser av CNV patologi og dens fortolkning.
Her presenterer vi en enkel og relativt rask metode klasse induksjon, progresjon og regresjon av CNV bruker FA, SD-oktober, og automatisert segmentering metoden i mouse laser-indusert CNV modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrene ble behandlet i samsvar med ARVO erklæringen for bruk av dyr i Ophthalmic og visjon forskning og EC direktiv 86/609/EØF for dyreforsøk, bruker protokoller godkjent og overvåket av dyr eksperiment styret i Finland.
1. laser-indusert musen CNV modell 5
- Inspisere øyne dyr macroscopically for noe unormalt.
- Veie musen.
- Beregne og forberede en passende mengde bedøvelse å bruke, basert på vekten av dyret, f.eks en blanding av medetomidine (1 mg/kg), ketamin (75 mg/kg) og destillert vann (0,9% NaCl løsning) i forholdet 1:1.5:2.5 eller ketamin (40-75 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) og destillert vann (0,9% NaCl løsning) i forholdet 1:2. 5:1; for 20 g mus, injisere 0,1 mL av blandingen.
- Injisere bedøvelse intraperitoneally.
- Plasserer musen tilbake i buret og vent til dyr er anesthetized. Bekreft musen er riktig anesthetized av mangel på en pedal refleks.
- Sikre bruk av laser sikkerhet personlig verneutstyr.
- Slå på en slit lampe og en 532 nm diode laser.
- Fjern musen fra buret og sted på oppvarming pad.
- Bruke en dråpe Tropicamide for pupillary dilatasjon. Vente på 3-5 minutter for full (3 mm) pupillary dilatasjon.
- Plass musen på scenen av slit lampe.
- Plass en dråpe ophthalmic væske gel på en dekkglassvæske til applanate hornhinnen.
- Plasser musen øyet med synsnerven hode i midten.
- Sette laser makt til 100 mW, varigheten til 100 ms og størrelsen til 50 µm.
- Fokusere laserstrålen på netthinnens pigment epitel (RPE).
- Gjøre tre laser skudd til ett øye ved å unngå retinal blodkar ideelt på 4, 8 og tolv stillinger rundt synsnerven, henholdsvis. Inspiser fundus på øyet etter alle laser skudd for fravær av netthinnen blødning. Kontralateral øyet fungerer som en ikke-lasered.
- Forkaste dekkglassvæske og plassere musen på oppvarming pad.
- Påfør en dråpe PEG gel dråper på begge øynene.
2. SD-oktober 6,7
- Plasser musen i gnager justering scenen, og nakkens hodet.
- Juster linsen av SD-oktober systemet (f.eksBioptigen/Leica Envisu R2200) å møte øyet i vivo bildevisning X - og Y-scene-kontrollere.
- Utføre SD-oktober søk for å bekrefte pauser for Bruchs membran: når SD-oktober skanner hele øyet, manuelt flytte referanselinjen på lasered nettsteder. Bryter for Bruchs membran skal være synlig i lasered områder (se figur 1).
3. fluorescein angiography 7,8,9
- Fjern musen med holderen, og plassere den på FA systemet (f.eksHeidelberg Spectralis HRA2).
- Fokus på laser brenne områder av fundus av øyet bruker infrarød refleksjon modus med hodet av den optiske nerven i visningsvinduet.
- Injisere 0,1 mL 5% fluorescein natrium salt for 20 g mus subcutaneously eller intraperitoneally.
- Fokus på choroidal nivå.
- Ta et bilde fra choroidal fokus nivå.
- Re-fokusere på netthinnen nivå og ta et bilde.
- Vent 30 s og Gjenta trinnene 3.4-3.6.
- Fjerne musen fra holderen og sett den på oppvarming pad.
- Reversere anestesi ved α2-antagonist for medetomidine, atipamezole (0,5 mg/kg, IP) eller vente på dyr utvinning fra anestesi.
- Gjenta i vivo SD-oktober og FA bildebehandling i bedøvet dyr på oppfølging dager 5, 10 og 14.
4. CNV gradering
- Karakter skade av Bruchs membran fra OCT bilder og choroidal FA bilder tatt umiddelbart etter lasering dag 0 som følgende:
0 - Bruchs membran ble ikke skadet
1 - vellykket skade av Bruchs membran - Karakter tilstedeværelsen av CNV fra lasered kapasitet som hadde lekkasje observert ved å sammenligne dynamikken i fluorescein signal i en rekke retinal FA bilder som følgende:
0 - normalt utseende av netthinnen
0,5 - svake flekker av lekkasje
1.0 - lekk CNV områder
Merk: Bruk OCT avbilding ytterligere bekreftelse av CNV eller i tvilsomme FA der tilstedeværelsen av intraretinal væske i OCT bilder foreslår CNV gradering.
5. retinal tykkelsen
- Bruke en automatisert segmentering til netthinnen tykkelsen. Sikre at totalt retinal tykkelsen er vurdert, som tykkelsen av alle lag fra nerve fiber laget RPE (sunn måling nettsteder) eller en imaginær linje RPE rundt skade (lasered sider) (se figur 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En boble eller subretinal blødning umiddelbart etter lasering er ikke alltid synlige. SD-oktober er derfor spesielt viktig å kontrollere skade av Bruchs membran. Figur 1 viser et eksempel på OCT bildebehandling på ulike tidspunkt etter laser administrasjon.
Figur 1 : OCT no ansiktet av øye fundus (VIP bilde) viser tre lasered områder i hvit, grønn og rød sirklene. OCT B-scan bilder ble tatt før den lasering (grunnlinje), umiddelbart etter lasering for å bekrefte en pause på Bruchs membran (0 dager, piler peker til området av skade), og 5, 10 og 14 dager etter laser administrasjon. Som kan sees fra området i hvitt (første raden av bilder) CNV ikke utvikle på senere timepoints. Området i grønt og rødt utviklet CNV, som ble oppdaget på oppfølgingsdatoen 5. Men på 10 og 14 dagers timepoints regressed disse CNV lesjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Viser seriell imaging bruker FA, som bekreftet vellykket skade av Bruchs membran i alle tre flekker på dag 0 i mannlige 10-uke-gamle C57BL/6jRj musen tall 2 og 3 .
Figur 2 : Serial FA imaging tatt hver 20 s (bilder 1 til 18) på choroidal nivå umiddelbart etter laser administrasjon. Hvite pilene i bilde 1 poeng til lasered områder, som viser fluorescein lekkasje på senere timepoints (hvite pilene i bildet 18). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Serial FA imaging tatt hver 20 s (bilder 1 til 18) på netthinnen nivå umiddelbart etter laser administrasjon. CNV område som har fluorescein lekkasje og en gradering 1 (leaky CNV) er pekt ut av den hvite pilen i bildet 18. Merk en økende intensitet, samt fluorescein positiv området, under timecourse av FA imaging (hvit pil i bilder 8 og 11). To områder i hvitt i bildet 18 ble klassifisert som har et svakt FA signal (gradering 0,5). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I tillegg til sortering av CNV patologi, er SD-oktober også nyttig å vise tilleggsinformasjon i lesjon nettstedet, f.eks, tilstedeværelse av subretinal væske og ødem CNV regresjon. Figur 4 viser viktigste patologisk kjennetegnene på laser-indusert CNV i mus.
Figur 4 : Spectral domene optisk Coherence tomografi Imaging av CNV patologi. SD-oktober gir en detaljert CNV patologi i netthinnen vev, som kan sees fra bildene representant på arr vev, CNV dannelse og væske opphopning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Macula ødem er en av viktigste patologisk kjennetegnene på våt skjemaet AMD hos mennesker. I laser-indusert CNV modellen kan retinal tykkelse evalueres ved hjelp av automatiserte segmentering. Manuell måling av utvalgte lasered områder må måle retinal tykkelse på stedet av CNV. Figur 5 viser et eksempel på en rapport som er generert etter automatisert segmentering.
Figur 5 : Kvantifisering av netthinnen tykkelse. Netthinnen tykkelse målt ved automatisert segmentering Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bruk av automatiserte segmentering er en rask måte å gi en oversikt over retinal tykkelse (tabell 1). Tallene 6A og 6B Vis eksemplene automatisert segmentering fra en sunn retinal området og retinal området med CNV patologi, henholdsvis. Til tross for små unøyaktigheter i skille retinal enkeltlag, samlet, gjenkjenner programvaren pålitelig totale retinal tykkelsen i pigmentert mus.
Figur 6 : Automatisert segmentering av netthinnen lag. Automatisert segmentering av sunn retinal (A) og retinal område som inneholder CNV (stjerne i bilde B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å vurdere retinal tykkelsen på lasered områder, hver lasered området ble målt manuelt følgende: totalt retinal tykkelsen ble betraktet som tykkelsen på alle lag fra nerve fiber laget til den imaginære linjen RPE rundt skade (figur 7 og tabell 1).
| Området | Dag 5 | Dag 10 | Dag 14 |
| Totalt retinal tykkelse, μm | 218±7.8 | 220±7.2 | 221±9.8 |
| Lasered område 1 | 200 | 204 | 214 |
| Lasered område 2 | 226 | 217 | 220 |
| Lasered område 3 | 222 | 223 | 227 |
| Dataene presenteres som mean±SD | |||
Tabell 1. Totalt retinal tykkelse og retinal tykkelse på CNV nettsteder i løpet av en 14-dagers oppfølging som bestemmes av automatiserte segmentering bruker inVivoDiver programvare (v. 3.0.8).
Figur 7 : Manuell måling av netthinnen tykkelsen på lasered område med CNV patologi. Gul linje angir totalt retinal tykkelse fra nerve fiber laget en imaginær RPE laget (svart linje) i stedet for laser administrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Histologisk, ble CNV lesjoner bekreftet ved hjelp av isolectin GS-IB4 merking (figur 8A). Analyseprogramvare bilde J ble brukt til å beregne arealet av CNV lesjon (figur 8B).
Figur 8 : Histologiske analyse. Histologiske flekk av CNV lesjon fra choroidal flatmount (i grønt, A) kan kvantifiseres bruker terskelverdi i bildet J (B). Baren skala for er 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere imaging tilbyr verdifulle verktøy for CNV patologi evaluering. Her vi presentert en tenkelig protokoll bestående av FA, SD-oktober og automatisk segmentering for rask, reproduserbare og pålitelig evaluering av CNV patologi. En pause på Bruchs membran etter at laser administrasjon ble bekreftet. I tillegg tillot bruk av SD-oktober på dette stadiet også umiddelbar visualisering av mulige intraretinal og subretinal blødninger som kan forvirre tolkning av resultatene. Netthinnen lekkasjer var gradert basert på fluorescein signalet fra FA bilder. Bruk av SD-oktober gitt en mer detaljert beskrivelse av CNV patologi. Videre uthevet langsgående SD-oktober analyse på ulike tidspunkt gjennom oppfølging periode timelige forskjeller i patologi som vil forbli unnvikende hvis stole på FA alene.
Totalt retinal tykkelse ble målt ved hjelp av automatiserte segmentering. Netthinnen tykkelse på steder CNV ble indusert ble manuelt målt. Histologiske evaluering av choroidal flatmount er bekreftet, og området neovascularization måles med analyseprogramvare bilde J.
Riktig gjennomsiktigheten til den visuelle aksen er avgjørende for vellykket forestilling av presentert protokollen. Tørrhet i hornhinnen og dannelse av cataracts er de viktigste faktorene som er involvert i feilsøking. Derfor når musen får anesthetized, bør øynene være stadig hydratiserte artificial tårer eller gel å opprettholde riktig hydrering av hornhinnen. Den foreslåtte protokollen skal utføres fortrinnsvis innen 10 min fra induksjon av anestesi. Utvidet anestesi tid kan føre til dannelse av grå stær og hindre i vivo bildebehandling.
Beskrevet protokollen er begrenset til observasjonsstudier gradering av CNV progresjon basert på vaskulær lekkasjer på nivået av netthinnen. Kvantitativ vurdering av netthinnen lekkasjen kan legges ved hjelp Heidelberg Spectralis programvare, som kan avgrensning av lekkasjen, og gir kvantitative data om regionen rundt. I tillegg foreslått Sulaiman og kolleger (2015) nylig en beregning av CNV volum fra i vivo ervervet OCT profilen benytter ellipsoid metoden10. Ellipsoid modellen introduserer sannsynligvis bias mot overvurdering av volumet av lesjoner som CNV i de fleste tilfeller har en ujevn form. Men gir høy korrelasjon mellom volum målinger fra AC confocal analyse av histologiske prøver og foreslåtte ellipsoid kvantifisering fra OCT profilen bevis på at metoden er et verdifullt verktøy for kvantitativ vurdering av CNV volum10 .
For å konkludere, vi tror presentert kombinasjonen av ulike i vivo imaging modaliteter, automatisert segmentering og histologiske analyse, gir reproduserbare og pålitelig evaluering av CNV patologi i preklinisk studier. Metoden kan være spesielt nyttig for bevis på konseptet terapeutisk intervensjon studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren Symantas Ragauskas, Ph.D. er en ansatt (forsker) og aksjonær i Experimentica Ltd som tilbyr kontrakt forskning tjenester ansette prekliniske CNV modellen brukes i denne artikkelen.
Forfatteren Eva Kielczewski er ansatt (forskning programmer ingeniør, OCT) i Leica Microsystems som produseres SD-oktober brukes i denne artikkelen.
Forfatteren Joseph Vance er ansatt (NA OCT Salgsdirektør) av Leica Microsystems som produseres SD-oktober brukes i denne artikkelen. Joseph Vance er også administrerende direktør Spective, LLC.
Forfatteren Simon Kaja, Ph.D. er konsulent senior naturvitenskapelig offiser og aksjonær i Experimentica Ltd, en prekliniske kontrakt forskningsorganisasjon som tilbyr kontrakt oppslagstjenester inkl prekliniske CNV modellen brukes i denne artikkelen. Simon Kaja, Ph.D. CEO av K & P vitenskapelig, LLC, en biovitenskap konsulentfirma, og fungerer som Dr. John P. og Therese E. Mulcahy utstyrt Professor i Oftalmologi ved Loyola University Chicago, Stritch School of Medicine. Vilkårene i denne ordningen har blitt vurdert og godkjent av Loyola University Chicago i samsvar med sin interessekonflikt politikk.
Forfatteren Giedrius Kalesnykas, Ph.D. er en ansatt (CEO) og aksjonær i Experimentica Ltd som tilbyr kontrakt forskning tjenester ansette prekliniske CNV modellen brukes i denne artikkelen.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Yuliya Naumchuk (Loyola University Chicago) og Agne Žiniauskaitė (Experimentica Ltd) for utmerket teknisk og videographic støtte. Dr. Kaja forskningsprogram støttes av Dr. John P. og Therese E. Mulcahy utstyrt professorat i Oftalmologi ved Loyola University Chicago.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medetomidine (commercial name Domitor) | Orion | Vnr 01 56 02 | Anesthesia |
| Ketamine | Intervet | Vnr 51 14 85 | Anesthesia |
| 0,9% NaCl | B Braun | 357 0340 | Anesthesia |
| Xylazine (commercial name Rompun vet) | Bayer | vnr 14 89 99 | Anesthesia |
| Tropicamide | Santen | Vnr 04 12 36 | Mydriatic agent |
| Viscotears | Alcon | Vnr 44 54 81 | Lubricant |
| Systane | Alcon | - | Lubricant |
| 5% Fluorescein sodium salt | Sigma Aldrich | F6377-100G | Fluoresent agent |
| Atipamezole (commercial name Antisedan) | Orion | Vnr 47 19 53 | Anesthesia |
References
- Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat. Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).
- Tobe, T., et al. Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).
- Seo, M. S., et al. Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor. Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. J Vis Exp. (106), e53502 (2015).
- Giani, A., et al. In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PloS One. 10, e0132643 (2015).
- Sheets, K. G., et al. Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse. Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).
- Hoerster, R., et al. In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Sulaiman, R. S., et al. A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization. J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).
