Summary
Qui, presentiamo l'utilità di longitudinale in vivo imaging nel follow-up dei cambiamenti morfologici del neovascularization coroidico laser-indotta in topi.
Abstract
Indotta da laser il neovascularization coroidico (CNV) è una modella ben affermata per imitare la forma umida di degenerazione maculare senile (AMD). In questo protocollo, ci proponiamo di guidare il lettore non semplicemente attraverso le considerazioni tecniche di generare lesioni indotte da laser per innescare processi neovascolare, ma piuttosto concentrarsi sulle informazioni potenti che possono essere ottenute da multimodal longitudinale in vivo imaging durante tutto il periodo di follow-up.
Il topo indotta da laser modello CNV è stato generato da un'amministrazione di laser del diodo. Tecniche di imaging multimodale in vivo sono stati utilizzati per monitorare la CNV induzione, progressione e regressione. Primo, tomografia a coerenza ottica dominio spettrale (SD-OCT) è stata effettuata immediatamente dopo la lavorazione laser per verificare una rottura della membrana di Bruch. Successivi in vivo imaging mediante angiografia della fluorescina (FA) ha confermato il successo danno della membrana di Bruch da seriale immagini acquisite a livello della coroide. Follow-up longitudinale di proliferazione di CNV e regressione nei giorni 5, 10 e 14 dopo la lavorazione laser è stato effettuato usando sia SD-OCT e FA. Semplice e affidabile di classificazione di leasions di CNV che perde da FA immagini è presentato. Segmentazione automatizzata per la misurazione dello spessore retinico totale, combinato con applicazione manuale calibro per la misurazione dello spessore retinico a siti CNV, consentire la valutazione imparziale della presenza dell'edema. Infine, verifica istologica di CNV viene eseguita utilizzando isolectin GS-IB4 colorazione sul flatmounts coroidico. La colorazione è con soglia, e viene calcolata l'area isolectin-positivi con ImageJ.
Questo protocollo è particolarmente utile negli studi di terapeutica che richiedono alta-velocità di trasmissione-come proiezione di patologia CNV quanto consente veloce, multimodale e affidabile classificazione dell'edema di patologia e retinico CNV. Inoltre, ad alta risoluzione SD-OCT consente la registrazione di altre caratteristiche patologiche, come l'accumulazione di liquido subretinal o intraretinico. Tuttavia, questo metodo non fornisce la possibilità di automatizzare l'analisi di volume CNV da immagini SD-OCT, che deve essere eseguita manualmente.
Introduction
Il primo tentativo riuscito di imitare la patologia di CNV umana nei roditori è stato dimostrato quasi tre decenni fa con un laser di krypton a lungo Evans ratti1. Da allora in poi, un laser di krypton è stato utilizzato per rompere la membrana di Bruch nel ceppo più popolare del mouse C57BL/6J2,3,4. Il tasso di successo dell'induzione di CNV è stato verificato con FA e macchie istologiche. Un rapido sviluppo di modalità di imaging non invasivo, ad esempio OCT, ha favorito la crescita del campo di modelli preclinici del roditore. La possibilità di monitorare i cambiamenti morfologici nella retina a più punti di tempo nello stesso occhio significativamente contribuisce alla riduzione dell'uso di animali e aumenta l'efficienza negli studi sperimentali. La valutazione istologica delle lesioni CNV è piuttosto semplice e richiede etichettatura di crescita vascolare anormale intorno al sito di amministrazione di laser, acquisizione di immagini e stima di superficie/volume utilizzando un software di analisi di immagine. Al contrario, la modalità di imaging in vivo introdurre più complesse analisi di CNV patologia e sua interpretazione.
Qui presentiamo un metodo semplice e relativamente veloce per induzione di grado, la progressione e regressione di CNV utilizzando FA, SD-OCT, e il metodo di segmentazione automatizzata nel topo indotta da laser CNV modello.
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Protocol
Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con la dichiarazione di ARVO per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research e CE direttiva 86/609/CEE per gli esperimenti sugli animali, utilizzando protocolli approvati e monitorati dal Consiglio esperimento animale della Finlandia.
1. indotto da laser mouse CNV modello 5
- Ispezionare gli occhi dell'animale in modo macroscopico per eventuali anomalie.
- Pesare il mouse.
- Calcolare e preparare un'appropriata quantità di anestetici da utilizzare, in base al peso dell'animale, ad esempio una miscela di medetomidina (1 mg/kg), ketamina (75 mg/kg) e acqua distillata (soluzione di NaCl 0,9%) a un rapporto di 1:1.5:2.5, o ketamina (40-75 mg/kg), xilazina (5 mg/kg) e acqua distillata (soluzione di NaCl 0,9%) a un rapporto di 1:2. 5:1; per un mouse 20g, iniettare 0,1 mL della miscela.
- Iniettare anestetico per via intraperitoneale.
- Posizionare il mouse nuovamente dentro la gabbia e aspettare fino a quando l'animale è anestetizzato. Confermare che il mouse è adeguatamente anestetizzato dalla mancanza di una reflex pedale.
- Garantire l'uso di dispositivi di protezione individuale sicurezza laser.
- Accendere una lampada a fessura e un laser a diodo 532 nm.
- Rimuovere il mouse dalla gabbia e posto il termoforo.
- Applicare una goccia di Tropicamide per dilatazione pupillare. Attendere 3-5 min per la dilatazione pupillary pieno (3 mm).
- Posizionare il mouse sul palco della lampada a fessura.
- Depositare una goccia di gel liquido opthalmic su un vetrino coprioggetto per applanate la cornea.
- Orientare l'occhio del mouse con la testa del nervo ottico nel centro.
- Impostare la potenza del laser a 100 mW, la durata di 100 ms e la dimensione dello spot a 50 µm.
- Focalizzare il fascio laser sull'epitelio pigmentato retinico (RPE).
- Fare tre colpi di laser in un occhio evitando vasi sanguigni retinici idealmente a 4, 8 e 12 posizioni intorno al nervo ottico, rispettivamente. Ispezionare il fondo dell'occhio dopo tutti i laser scatti per assenza di emorragia retinica. L'occhio controlaterale serve come controllo non laserato.
- Scartare il mouse vetrino coprioggetti e posto indietro il termoforo.
- Applicare una goccia di PEG gel gocce su entrambi gli occhi.
2. SD-OCT 6,7
- Posizionare il mouse in fase di allineamento del roditore e immobilizzare la testa.
- Allineare la lente del sistema SD-OCT (ad es., Bioptigen/Leica Envisu R2200) ad affrontare l'occhio per l'imaging in vivo utilizzando controller X - e Y-stage.
- Eseguire scansioni di SD-OCT per verificare rotture della membrana di Bruch: una volta che il SD-OCT scansiona l'intero occhio, spostare manualmente la linea di riferimento sui siti laserati. Rotture della membrana di Bruch devono essere chiaramente visibile nelle aree laserate (Vedi Figura 1).
3. fluoresceina angiografia 7,8,9
- Rimuovere il mouse con il titolare e posizionarlo sul sistema FA (ad es., Heidelberg Spectralis HRA2).
- Messa a fuoco laser masterizzare aree del fondo dell'occhio utilizzando la modalità a raggi infrarossi riflettanza con la testa del nervo ottico al centro della finestra di visualizzazione.
- Iniettare 0,1 mL di sale di sodio di 5% della fluorescina per un mouse di 20 g per via sottocutanea o per via intraperitoneale.
- Concentrarsi sul livello della coroide.
- Prendere un'immagine dal livello di messa a fuoco della coroide.
- Rimettere a fuoco a livello della retina e prendere un'immagine.
- Attendere per 30 s e ripetere passaggi 3.4-3.6.
- Rimuovere il mouse dal supporto e posizionarlo sul rilievo di riscaldamento.
- Invertire l'anestesia α2-antagonista per medetomidina, atipamezolo (0,5 mg/kg, i.p.) o attesa per animale recupero dall'anestesia.
- Ripetere in vivo SD-OCT e FA imaging in animali anestetizzati sui giorni di follow-up 5, 10 e 14.
4. CNV classificazione
- Grado il danno della membrana di Bruch da immagini di ottobre e coroidica FA immagini scattate subito dopo la lavorazione al laser il giorno 0 come segue:
0 - membrana di Bruch non è stata danneggiata
1 - successo danno della membrana di Bruch - Grado la presenza di CNV da laserata macchie che aveva perdite come osservato confrontando la dinamica del segnale della fluorescina in una serie di immagini retiniche FA come segue:
0 - aspetto normale della retina
0,5 - macchiatura debole di perdita
1.0 - aree CNV che perde
Nota: Utilizzare l'imaging OCT per ulteriore conferma di CNV o in discutibile FA dove la presenza di liquido intraretinico in immagini di ottobre vorrei suggerire CNV classificazione.
5. misure di spessore retinico
- Utilizzare un software di segmentazione automatizzata per le misurazioni dello spessore retinico. Assicurarsi che lo spessore totale della retina è considerato, come lo spessore degli strati tutti da strato delle fibre nervose di RPE (siti di misura sano) o di una linea immaginaria che collega RPE intorno al sito di danno (laserate siti) (Vedi anche Figura 7).
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Representative Results
Una bolla o subretinal sanguinamento immediatamente dopo lavorazione laser non è sempre visibile. Pertanto, SD-OCT è particolarmente importante per verificare il danno della membrana di Bruch. Figura 1 Mostra un esempio di formazione immagine OCT a tempi diversi dopo la somministrazione di laser.
Figura 1 : OCT en faccia vista del fondo dell'occhio (immagine VIP) Mostra tre aree laserate delineate nei cerchi bianchi, verde e rossi. OCT. B-scan immagini sono state scattate previo il lasering (basale), immediatamente dopo la lavorazione laser per verificare una rottura della membrana di Bruch (0 giorni, frecce puntano al sito del danno) e 5, 10 e 14 giorni dopo la somministrazione di laser. Come si può vedere dalla zona evidenziata in bianco (prima riga di immagini), CNV non ha sviluppato timepoints successive. La zona evidenziata in verde e rosso sviluppato CNV, che è stato rilevato il follow-up giorno 5. Tuttavia, alle 10 e 14 punti temporali di giorno, queste lesioni CNV è regredito. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figure 2 e 3 mostrano la formazione immagine di serie utilizzando FA, che ha confermato il successo danno della membrana di Bruch in tutti i tre punti il giorno 0 in un mouse di C57BL/6jRj 10-settimana-vecchio maschio.
Figura 2 : Formazione immagine di serie FA fatta ogni 20 s (immagini da 1 a 18) a livello della coroide immediatamente dopo la somministrazione di laser. Frecce bianche nell'immagine 1 punto ai siti laserate, che mostrano la perdita della fluorescina timepoints successive (frecce bianche nell'immagine 18). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Formazione immagine di serie FA fatta ogni 20 s (immagini da 1 a 18) a livello della retina immediatamente dopo la somministrazione di laser. Zona CNV che ha perdita della fluorescina e pezzatura da 1 (leaky CNV) è sottolineato dalla freccia bianca in immagine 18. Nota un'intensità crescente, come pure zona positiva della fluorescina, durante il timecourse di FA imaging (freccia bianca nelle immagini a 8 e 11). Due aree delineate in bianco nell'immagine 18 sono stati classificati come avendo un debole segnale FA (classificazione 0,5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Oltre la classificazione di patologia CNV, SD-OCT è anche utile per rivelare ulteriori informazioni nel sito di lesione, ad es., presenza di liquido subretinal, edema e regressione di CNV. La figura 4 Mostra i principali segni distintivi patologici di CNV indotta da laser in topi.
Figura 4 : Patologia spettrale dominio ottico coerenza tomografia Imaging di CNV. SD-OCT fornisce una patologia CNV dettagliata all'interno del tessuto retinico, come si può vedere da queste immagini rappresentative sulla cicatrizzazione del tessuto, la formazione di CNV e accumulo di liquido. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'edema maculare è una delle principali caratteristiche patologiche di forma bagnata AMD in esseri umani. Nel modello di CNV indotta da laser, spessore retinico può essere valutato tramite segmentazione automatizzata. Misurazione manuale dei siti selezionati laserate è necessaria per misurare lo spessore retinico al luogo del CNV. Figura 5 Mostra un esempio di un report generato dopo segmentazione automatizzata.
Figura 5 : Quantificazione dello spessore retinico. Lo spessore retinico come misurato dalla segmentazione automatizzata Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'uso di segmentazione automatizzata è un modo veloce per fornire una panoramica di spessore retinico (tabella 1). Figure 6A e 6B mostrano esempi rappresentativi della segmentazione automatizzata da una zona della retina sana e dalla zona della retina con patologia CNV, rispettivamente. Nonostante lievi inesattezze trovati nel distinguere singoli strati retinici, nel complesso, il software riconosce in modo affidabile dello spessore retinico totale nei topi pigmentati.
Figura 6 : Automated segmentazione degli strati retinici. Segmentazione automatica di area retinica sana (A) e area retinica contenente CNV (asterisco nell'immagine B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Al fine di valutare lo spessore retinico alle aree laserate, ogni zona lasered è stata misurata manualmente come segue: il totale dello spessore retinico è stato considerato come lo spessore di tutti i livelli da strato delle fibre nervose per la linea immaginaria che collega RPE intorno al sito di danno (Figura 7 e tabella 1).
| Zona | Giorno 5 | Giorno 10 | Giorno 14 |
| Totale spessore retinico, μm | 218±7.8 | 220±7.2 | 221±9.8 |
| Laserata zona 1 | 200 | 204 | 214 |
| Laserata zona 2 | 226 | 217 | 220 |
| Laserata zona 3 | 222 | 223 | 227 |
| I dati sono presentati come media ± DS | |||
Tabella 1. Lo spessore retinico totale e lo spessore retinico in siti CNV durante un follow-up di 14 giorni come determinato dalla segmentazione automatizzata utilizzando il software inVivoDiver (v. 3.0.8).
Figura 7 : Misurazione manuale dello spessore retinico a zona laserato con patologia CNV. Linea gialla indica lo spessore retinico totale da strato delle fibre nervose in un immaginario layer di RPE (linea nera) al sito di amministrazione di laser. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Istologicamente, le lesioni CNV sono state confermate utilizzando isolectin GS-IB4 etichettatura (Figura 8A). Software di analisi di immagine immagine J è stato utilizzato per calcolare l'area della lesione CNV (Figura 8B).
Figura 8 : Analisi istologica. Macchia istologica della lesione CNV da flatmount coroidico (in verde, A) può essere quantificata utilizzando la soglia dell'immagine J (B). La barra della scala per A è 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Imaging multimodale offre preziosi strumenti per la valutazione di patologia CNV. Qui abbiamo presentato un protocollo imaging composto da FA, SD-OCT e segmentazione automatica per la valutazione rapida, riproducibile e affidabile di patologia CNV. Una rottura della membrana di Bruch dopo amministrazione del laser è stato confermato. Inoltre, l'uso di SD-OCT in questa fase anche ha permesso la visualizzazione immediata delle possibili emorragie intraretiniche e subretinal, che può confondere l'interpretazione dei risultati. Perdite della retina sono state classificate basato sul segnale della fluorescina da FA immagini. L'uso di SD-OCT fornito una descrizione più dettagliata della patologia CNV. Inoltre, analisi longitudinale di SD-OCT in vari momenti durante il periodo di seguito evidenziato differenze temporali nella patologia che rimarrebbero sfuggente se affidarsi a FA da solo.
Totale spessore retinico è stato misurato mediante segmentazione automatizzata. Manualmente è stato misurato lo spessore retinico in siti che CNV è stata indotta. La valutazione istologica di coroidico flatmount è verificata, e la zona della neovascolarizzazione è misurata utilizzando software di analisi di immagine Image J.
La propria trasparenza dell'asse visivo è fondamentale per la buona riuscita del protocollo presentato. Secchezza della cornea e la formazione di cataratte sono i principali fattori coinvolti nella risoluzione dei problemi. Pertanto, una volta che il mouse ottiene anestetizzato, gli occhi devono essere costantemente idratati con lacrime artificiali o gel per mantenere la corretta idratazione della cornea. Proposta di protocollo deve essere eseguita preferenzialmente entro 10 min dall'induzione dell'anestesia. Tempo prolungato anestesia può causare la formazione di cataratte e prevenire in vivo imaging.
Il protocollo descritto è limitato a scarpata d'osservazione della progressione di CNV basato su perdite vascolari a livello della retina. Valutazione quantitativa della perdita della retina possa essere aggiunti utilizzando software di Heidelberg Spectralis, consente la delimitazione della zona della perdita, che fornisce dati quantitativi sulla regione di interesse. Inoltre, Sulaiman e colleghi (2015) ha recentemente proposto un calcolo del volume CNV da in vivo ha acquisito immagini di ottobre utilizzando il metodo dell'elissoide10. Il modello dell'elissoide introduce molto probabilmente polarizzazione verso sovrastima del volume delle lesioni come CNV nella maggior parte dei casi ha una forma irregolare. Tuttavia, alta correlazione tra misure del volume da analisi confocale di preparati istologici e quantificazione dell'elissoide proposto da immagini OCT fornisce la prova che il metodo è uno strumento prezioso per la valutazione quantitativa del volume CNV10 .
Per concludere, riteniamo che la combinazione presentata di differenti in vivo imaging modalità, insieme a segmentazione automatizzata e l'analisi istologica, fornisce una valutazione affidabile e riproducibile di patologia CNV negli studi preclinici. Il metodo potrebbe essere particolarmente utile per la prova di studi di intervento terapeutico di concetto.
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Disclosures
L'autore Symantas Ragauskas, pH.d. è un dipendente (ricercatore) e azionista di Experimentica Ltd. che offre servizi di ricerca che impiegano il modello preclinico di CNV utilizzato in questo articolo del contratto.
L'autore Eva Kielczewski è un impiegato (Ricerca applicazioni engineer, OCT) di Leica Microsystems che produce sistemi di SD-OCT utilizzati in questo articolo.
L'autore Joseph Vance è un dipendente (NA OCT direttore vendite) di Leica Microsystems che produce sistemi di SD-OCT utilizzati in questo articolo. Joseph Vance è anche Presidente e amministratore delegato di spettiva, LLC.
L'autore Simon Kaja, pH.d. è consulente Chief Scientific Officer e azionista di Experimentica Ltd., un'organizzazione di ricerca preclinica contratto che offre servizi di ricerca, contraggono incl. il modello preclinico di CNV utilizzato in questo articolo. Simon Kaja, pH.d. è anche CEO di K & P scientifica, LLC, una consulenza, Scienze della vita e serve come il Dr. John P. e Therese E. Mulcahy dotato professore di Oftalmologia presso la Loyola University Chicago, Stritch School of Medicine. I termini di questo accordo sono stati esaminati e approvati dal Loyola University Chicago in conformità alla sua politica di conflitto di interessi.
L'autore Giedrius Kalesnykas, pH.d. è un dipendente (CEO) e azionista di Experimentica Ltd. che offre servizi di ricerca che impiegano il modello preclinico di CNV utilizzato in questo articolo del contratto.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare Yuliya Naumchuk (Loyola University Chicago) e Agne Žiniauskaitė (Experimentica Ltd.) per un eccellente supporto tecnico e videografiche. Programma di ricerca del Dr. Kaja è supportato dal Dr. John P. e Therese E. Mulcahy dotato Professorship in Oftalmologia presso la Loyola University di Chicago.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medetomidine (commercial name Domitor) | Orion | Vnr 01 56 02 | Anesthesia |
| Ketamine | Intervet | Vnr 51 14 85 | Anesthesia |
| 0,9% NaCl | B Braun | 357 0340 | Anesthesia |
| Xylazine (commercial name Rompun vet) | Bayer | vnr 14 89 99 | Anesthesia |
| Tropicamide | Santen | Vnr 04 12 36 | Mydriatic agent |
| Viscotears | Alcon | Vnr 44 54 81 | Lubricant |
| Systane | Alcon | - | Lubricant |
| 5% Fluorescein sodium salt | Sigma Aldrich | F6377-100G | Fluoresent agent |
| Atipamezole (commercial name Antisedan) | Orion | Vnr 47 19 53 | Anesthesia |
References
- Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat. Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).
- Tobe, T., et al. Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).
- Seo, M. S., et al. Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor. Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. J Vis Exp. (106), e53502 (2015).
- Giani, A., et al. In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PloS One. 10, e0132643 (2015).
- Sheets, K. G., et al. Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse. Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).
- Hoerster, R., et al. In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Sulaiman, R. S., et al. A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization. J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).
