Summary
Aqui, apresentamos a utilidade da imagem longitudinal na vivo na sequência de alterações morfológicas da neovascularização de coroide do laser-induzida em camundongos.
Abstract
Induzida por laser a neovascularização de coroide (CNV) é um modelo bem estabelecido para imitar a forma úmida da degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Neste protocolo, nosso objetivo é orientar o leitor não simplesmente através das considerações técnicas de gerar lesões induzida por laser para desencadear processos neovascular, mas prefiro focar a informação poderosa que pode ser obtida multimodal longitudinal vivo em de imagem durante todo o período de seguimento.
O mouse laser-induzida modelo CNV foi gerado por uma administração de laser de diodo. Multimodal no vivo técnicas de imagem foram utilizadas para monitorar CNV indução, progressão e regressão. Primeiro, a tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) foi realizada imediatamente após o lasering para verificar uma ruptura da membrana de Bruch. Subsequentes na vivo imagens usando angiografia fluoresceína (FA) confirmaram sucesso dano da membrana de Bruch da série imagens adquiridas a nível da coroide. Acompanhamento longitudinal da proliferação de CNV e regressão nos dias 5, 10 e 14 após o lasering foi realizado usando SD-OCT e FA. Simples e confiável de classificação de leasions de CNV com vazamento de imagens de FA é apresentado. Segmentação automatizada para medição da espessura total da retina, combinada com a aplicação manual calibre para medição da espessura da retina em sites CNV, permitir uma avaliação imparcial da presença de edema. Finalmente, verificação histológica da CNV é executada usando isolectin GS-IB4 mancha na flatmounts da coroide. A coloração é thresholded, e a área de isolectin-positivo é calculada com o ImageJ.
Este protocolo é especialmente útil em estudos de terapêutica que exigem alta taxa de transferência-como triagem de patologia CNV como rápido, permite multimodal e classificação confiável de edema de patologia e retinal CNV. Além disso, a alta resolução SD-OCT permite a gravação de outras características patológicas, tais como o acúmulo de fluido subretinal ou intraretinal. No entanto, este método não oferece a possibilidade de automatizar a análise de volume CNV de imagens SD-OCT, que tem de ser executada manualmente.
Introduction
A primeira tentativa bem sucedida para imitar a patologia humana CNV em roedores foi demonstrada há quase três décadas com um laser de krypton em Long-Evans ratos1. Depois disso, um laser de krypton foi usado para invadir a cepa de rato mais popular, C57BL/6J2,3,4a membrana de Bruch. A taxa de sucesso da indução CNV foi verificada com FA e manchas histológicas. Um rápido desenvolvimento de modalidades de imagem não-invasivos, como OCT, estimulou o crescimento do campo de roedores modelos pré-clínicos. A capacidade de monitorar mudanças morfológicas na retina em múltiplos pontos de tempo no mesmo olho significativamente contribui para a redução do uso de animais e aumenta a eficiência em estudos experimentais. Avaliação histológica das lesões CNV é bastante simples e exige a rotulagem de crescimento vascular anormal ao redor do local de administração do laser, aquisição de imagem e estimativa de área/volume usando um software de análise de imagem. Em contraste, na vivo modalidades de imagem apresentar análises mais complexas de patologia CNV e sua interpretação.
Aqui nós apresentamos um método simples e relativamente rápido para indução de grau, progressão e regressão de CNV usando FA, SD-OCT, e o método de segmentação automatizada no mouse laser-induzida CNV modelo.
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Protocol
Todos os animais foram tratados em conformidade com a instrução de ARVO para o uso de animais em oftalmologia e Vision Research e a CE Directiva 86/609/CEE para experiências em animais, usando protocolos aprovados e monitorados pelo Conselho da Finlândia experimento Animal.
1. induzida por laser rato CNV modelo 5
- Inspecione os olhos do animal macroscopicamente para qualquer anormalidade.
- Pese o mouse.
- Calcular e preparar uma quantidade apropriada de anestésicos para utilizar, com base no peso do animal, por exemplo, uma mistura de medetomidina (1 mg/kg), ketamina (75 mg/kg) e água destilada (solução de NaCl 0,9%) na proporção de 1:1.5:2.5, ou cetamina (40-75 mg/kg), xilazina (5 mg/kg) e água destilada (solução de NaCl 0,9%) na proporção de 1:2. 5:1; para um mouse de 20g, injete 0,1 mL da mistura.
- Injete o anestésico intraperitonealmente.
- Posicione o mouse volta para a gaiola e espere até o animal é anestesiado. Confirme que o mouse é devidamente anestesiado pela falta de um pedal reflexo.
- Garantir o uso de equipamento de proteção pessoal da segurança do laser.
- Ligue a lâmpada de fenda e um laser de díodo 532 nm.
- Remova o rato da gaiola e coloque sobre a almofada de aquecimento.
- Aplique uma gota de tropicamida para dilatação da pupila. Espere 3-5 min para dilatação pupilar completo (3 mm).
- Posicione o mouse no palco da lâmpada de fenda.
- Coloque uma gota de gel líquido thoughtful sobre uma lamela de applanate da córnea.
- Oriente o olho do rato com a cabeça do nervo óptico no centro.
- Definir a potência do laser a 100 mW, a duração de 100 ms e o tamanho de ponto para 50 µm.
- Focar o feixe de laser o epithelium retinal do pigment (RPE).
- Fazer três tiros de laser em um olho, evitando os vasos da retina idealmente na 4, 8 e 12:00 posições em torno do nervo óptico, respectivamente. Inspecione o fundo do olho, depois todos tiros por ausência de hemorragia retiniana a laser. O olho contralateral serve como um controle de não-com laser.
- Descarte o mouse lamela e lugar volta sobre a almofada de aquecimento.
- Aplique uma gota de gotas de gel de PEG em ambos os olhos.
2. SD-OCT 6,7
- Coloque o mouse para a fase de alinhamento de roedores e imobilizar a cabeça.
- Alinhe a lente do sistema SD-OCT (por exemplo, Bioptigen/Leica Envisu R2200) para enfrentar o olho para a imagem latente com na vivo usando controladores de X - e Y-estágio.
- Realizar exames de SD-OCT para verificar se a quebra da membrana de Bruch: uma vez que o SD-OCT examina o olho inteiro, Mova manualmente a linha de referência nos sites lasered. Quebras de membrana de Bruch devem ser claramente visíveis em áreas lasered (ver Figura 1).
3. fluoresceína angiografia 7,8,9
- Remover o rato com o titular e coloque-o sobre o sistema de FA (por exemplo, Heidelberg Spectralis HRA2).
- Foco para laser queimar áreas do fundo do olho usando o modo de reflectância de infravermelho com a cabeça do nervo óptico, no meio da janela de visualização.
- Injete 0,1 mL de sal de sódio 5% fluoresceína para um rato de 20 g por via subcutânea ou intraperitonealmente.
- Concentre-se no nível da coroide.
- Leve uma imagem do nível de foco da coroide.
- Re-focar a nível da retina e uma imagem.
- Espere por 30 s e repita etapas 3.4-3.6.
- Remova o mouse do suporte e coloque-o sobre a almofada de aquecimento.
- Reverta anestesia por α2-antagonista de medetomidina, atipamezole (0,5 mg/kg, i.p.) ou espera para animal recuperação da anestesia.
- Repita em vivo SD-OCT e FA imagiologia em animais anestesiados sobre os acompanhamento dias 5, 10 e 14.
4. CNV classificação
- Classe os danos da membrana de Bruch da OCT imagens e imagens de FA da coroide tomadas imediatamente após o lasering no dia 0 como seguindo:
0 - membrana de Bruch não foi danificado
1 - sucesso dano da membrana de Bruch - Classe a presença de CNV de lasered manchas que tinha vazamento, como observado, comparando a dinâmica do sinal de fluoresceína em uma série de imagens da retina de FA como seguindo:
0 - aparência normal da retina
0,5 - fraco coloração de escapamento
1.0 - áreas CNV gotejantes
Nota: Use a imagem da OCT para confirmação adicional de CNV ou em FA questionável onde a presença de fluido intraretinal em imagens OCT sugeriria CNV classificação.
5. medições de espessura retina
- Use um software automatizado de segmentação para medições de espessura da retina. Certifique-se de que a espessura total da retina é considerada, como a espessura de todas as camadas da camada de fibras nervosas RPE (sites de medição saudável), ou para uma linha imaginária ligando RPE em torno do local do dano (lasered sites) (ver também Figura 7).
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Representative Results
Uma bolha ou apresentam sangramento imediatamente após lasering nem sempre é visível. Portanto, o SD-OCT é particularmente importante para verificar os danos da membrana de Bruch. A Figura 1 mostra um exemplo de imagem OCT em pontos diferentes de tempo após a administração do laser.
Figura 1 : Vista de face pt OCT de olho do fundo (imagem VIP) mostra três áreas lasered delineadas em círculos brancos, verdes e vermelhos. B-scan de OCT imagens foram tomadas previamente o lasering (linha de base), imediatamente após o lasering para verificar uma ruptura da membrana de Bruch (0 dias, setas apontam para o site de danos) e 5, 10 e 14 dias após a administração do laser. Como pode ser visto a partir a área descrita em branco (primeira linha de imagens), CNV não se desenvolveu em momentos posteriores. A área descrita em verde e vermelho desenvolvido CNV, que foi detectado no 5º dia de acompanhamento. No entanto, os momentos de dia 10 e 14, essas lesões CNV regrediram. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As figuras 2 e 3 mostram imagem serial usando FA, que confirmou o dano bem sucedido da membrana de Bruch em todos os três pontos no dia 0 em um rato de C57BL/6jRj masculino 10 semanas de idade.
Figura 2 : Imagem de série FA tomada cada 20 s (imagens 1 a 18), a nível da coroide imediatamente após a administração do laser. Setas brancas na imagem 1 ponto para lasered sites, que mostram a fuga de fluoresceína em momentos posteriores (setas brancas na imagem 18). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Imagem de série FA tomada cada 20 s (imagens 1 a 18), a nível da retina imediatamente após a administração do laser. Área CNV que tem vazamento de fluoresceína e uma classificação de 1 (CNV gotejante) é apontada pela seta branca na imagem 18. Nota uma intensidade crescente, bem como área de fluoresceína positivo, durante o timecourse de FA de imagem (seta branca em imagens de 8 e 11). Duas áreas delineadas em branco na imagem 18 foram classificadas como tendo um sinal fraco de FA (classificação 0.5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Além da classificação da patologia CNV, SD-OCT também é útil para revelar informações adicionais no local da lesão, por exemplo, presença de fluido subretinal, edema e regressão CNV. A Figura 4 mostra as principais marcas patológicas do CNV induzida por laser em camundongos.
Figura 4 : Patologia espectral domínio óptico coerência tomografia computadorizada da imagem latente de CNV. SD-OCT fornece uma patologia CNV detalhada dentro de tecido da retina, como pode ser visto por essas imagens representativas na cicatrização de tecidos, formação de CNV e acúmulo de líquido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Edema macular é uma das características patológicas principais do formulário molhado AMD em seres humanos. No modelo de CNV induzida por laser, a espessura da retina pode ser avaliada usando segmentação automatizada. Medição manual de sites selecionados lasered é necessário para medir a espessura da retina no local da CNV. A Figura 5 mostra um exemplo de um relatório gerado após a segmentação automatizada.
Figura 5 : Quantificação da espessura retiniana. Espessura da retina, medido por segmentação automatizada clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O uso de segmentação automatizada é uma maneira rápida para fornecer uma visão geral da espessura da retina (tabela 1). Figuras 6A e 6B mostram exemplos representativos de segmentação automática de uma área da retina saudável e da área da retina com patologia CNV, respectivamente. Apesar de pequenas imprecisões encontrados na distinção entre camadas da retina individuais, no geral, o software reconhece confiantemente a espessura total da retina em camundongos pigmentados.
Figura 6 : Automated segmentação das camadas da retina. Automatizado de segmentação da área da retina saudável (A) e área da retina que contém CNV (asterisco na imagem B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A fim de avaliar a espessura da retina em áreas lasered, cada área lasered foi medida manualmente como seguindo: a espessura total da retina foi considerada como a espessura de todas as camadas de camada de fibras nervosas à linha imaginária que conecta o RPE ao redor do local de danos (Figura 7 e tabela 1).
| Área | Dia 5 | Dia 10 | Dia 14 |
| Espessura total da retina, μm | 218±7.8 | 220±7.2 | 221±9.8 |
| Lasered área 1 | 200 | 204 | 214 |
| Lasered área 2 | 226 | 217 | 220 |
| Lasered área 3 | 222 | 223 | 227 |
| Os dados são apresentados como mean±SD | |||
Tabela 1. Espessura total da retina e espessura da retina em sites CNV durante um acompanhamento de 14 dias, conforme determinado pela segmentação automatizada utilizando o software inVivoDiver (v. 3.0.8).
Figura 7 : Manual medição da espessura da retina na área lasered com patologia CNV. Linha amarela indica a espessura da retina total de camada de fibras nervosas a uma camada RPE imaginária (linha preta) no local da administração do laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Histologicamente, as lesões CNV foram confirmadas usando isolectin GS-IB4 rotulagem (Figura 8A). Software de análise de imagem imagem J foi usado para calcular a área de lesão CNV (Figura 8B).
Figura 8 : Análise histológica. Mancha histológica da lesão CNV de flatmount da coroide (em verde, A) pode ser quantificada usando limiarização em Image J (B). A barra de escala para um é 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Imagiologia multimodal oferece valiosas ferramentas para avaliação de patologia CNV. Aqui apresentamos um protocolo de imagem consistindo de FA, SD-OCT e segmentação automática para a avaliação rápida, reprodutível e confiável de patologia CNV. Uma ruptura da membrana de Bruch após administração do laser foi confirmada. Além disso, o uso de SD-OCT nesta fase também permitiu a visualização imediata dos possíveis hemorragias intraretinal e subretinal, que pode confundir a interpretação dos resultados. Vazamentos da retina foram classificados baseia o sinal de fluoresceína de imagens de FA. O uso de out SD fornecido uma descrição mais detalhada da patologia CNV. Além disso, análise longitudinal do SD-OCT em vários pontos de tempo ao longo do período de follow-up destacadas diferenças temporais na patologia que permaneceria indescritível se depender só de FA.
Espessura total da retina foi medida usando segmentação automatizada. Espessura da retina em sites que CNV foi induzido foi medida manualmente. A avaliação histológica dos flatmount da coroide é verificada, e a área de neovascularização é medida usando software de análise de imagem imagem J.
A transparência adequada do eixo visual é fundamental para o bom desempenho do protocolo apresentado. Secura da córnea e formação de catarata são os principais fatores envolvidos na resolução de problemas. Portanto, uma vez que o mouse fica anestesiado, os olhos devem ser hidratados constantemente com lágrimas artificiais ou gel para manter a hidratação adequada da córnea. O protocolo proposto deve ser realizado preferencialmente em 10 min da indução da anestesia. Tempo de anestesia prolongada pode causar a formação de catarata e evitar na vivo de imagem.
O protocolo descrito é limitado a classificação observacional de progressão CNV com base em fugas vasculares a nível da retina. Avaliação quantitativa do vazamento da retina pode ser adicionada usando Heidelberg Spectralis software, que permite a delimitação da área do vazamento e fornece dados quantitativos sobre a região de interesse. Além disso, Sulaiman e colegas (2015) propuseram recentemente um cálculo do volume CNV de na vivo adquirida OCT imagens usando o método elipsoide10. O modelo elipsoide provavelmente apresenta viés em direção a superestimação do volume das lesões como CNV na maioria dos casos tem uma forma irregular. No entanto, a alta correlação entre as medições de volume de análise confocal de amostras histológicas e quantificação elipsoide proposta de imagens OCT fornece evidências de que o método é uma ferramenta valiosa para a avaliação quantitativa do volume CNV10 .
Para concluir, que acreditamos que a combinação apresentada de diferentes na vivo por imagens modalidades, juntamente com a segmentação automatizada e análise histológica, fornece avaliação confiável e reprodutível de patologia CNV em estudos pré-clínicos. O método poderia ser particularmente útil para a prova de estudos de intervenção terapêutica do conceito.
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Disclosures
O autor Symantas Ragauskas, pH.d. é um funcionário (cientista) e acionista do Ltd. de Experimentica que oferece contrato de serviços de pesquisa empregando o modelo CNV pré-clínicos usado neste artigo.
O autor Eva Kielczewski é um empregado (engenheiro de aplicações de pesquisa, OCT) da Leica Microsystems que produz sistemas de SD-OCT usados neste artigo.
O autor Joseph Vance é um empregado (at OCT Sales Director) da Leica Microsystems que produz sistemas de SD-OCT usados neste artigo. Joseph Vance também é presidente e diretor executivo da leção, LLC.
O autor Simon Kaja, pH.d. é consultor Chief Scientific Officer e acionista da Experimentica Ltd., uma contrato pré-clínicos pesquisa organização que oferece contrato de serviços de pesquisa, incl. modelo de CNV pré-clínicos usado neste artigo. Simon Kaja, pH.d. é também CEO da K & P científica, LLC, das Ciências da vida, consultoria e atua como o Dr. John P. e Therese E. Mulcahy dotado Professor em oftalmologia na Loyola University Chicago Stritch School of Medicine. Os termos desse acordo foram revistos e aprovados pela Loyola University Chicago, em conformidade com sua política de conflito de interesses.
O autor Giedrius Kalesnykas, pH.d. é um funcionário (CEO) e acionista do Ltd. de Experimentica que oferece contrato de serviços de pesquisa empregando o modelo CNV pré-clínicos usado neste artigo.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer a Yuliya Naumchuk (Loyola University Chicago) e Žiniauskaitė Agne (Experimentica Ltd.), pelo excelente apoio técnico e videográfico. Programa de pesquisa do Dr. Kaja é suportado pelo Dr. John P. e Therese E. Mulcahy dotado Professorship em oftalmologia na Loyola University Chicago.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medetomidine (commercial name Domitor) | Orion | Vnr 01 56 02 | Anesthesia |
| Ketamine | Intervet | Vnr 51 14 85 | Anesthesia |
| 0,9% NaCl | B Braun | 357 0340 | Anesthesia |
| Xylazine (commercial name Rompun vet) | Bayer | vnr 14 89 99 | Anesthesia |
| Tropicamide | Santen | Vnr 04 12 36 | Mydriatic agent |
| Viscotears | Alcon | Vnr 44 54 81 | Lubricant |
| Systane | Alcon | - | Lubricant |
| 5% Fluorescein sodium salt | Sigma Aldrich | F6377-100G | Fluoresent agent |
| Atipamezole (commercial name Antisedan) | Orion | Vnr 47 19 53 | Anesthesia |
References
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